低強度恒定磁場對腫瘤細胞鐵死亡的作用▲

胡金翠 許建文 胡榜利 朱庭沛 黃瀟瀟

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學科，南寧市 530021)

腫瘤康復(fù)是康復(fù)醫(yī)學新近發(fā)展起來的一個分支，日益受到重視。腫瘤康復(fù)在腫瘤疾病的急性期、亞急性期、門診和家庭康復(fù)等多方面同步發(fā)展。磁療作為一種理療措施，已廣泛應(yīng)用于臨床康復(fù)。有文獻[1]報道磁場可以引起細胞鐵代謝紊亂。鐵死亡是一種細胞死亡方式，與凋亡不同，其是由細胞內(nèi)鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化物蓄積導(dǎo)致的，生化顯示鐵含量、脂質(zhì)過氧化物-丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量增加，谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量降低，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)的表達減少和活性降低[2]。鐵死亡可被誘導(dǎo)劑Erastin誘導(dǎo)，被抑制劑Ferrostatin-1抑制。據(jù)報道[3]調(diào)控鐵死亡可干擾腫瘤的病理進程，因此，本文研究低強度恒定磁場對腫瘤細胞鐵死亡的作用，為腫瘤康復(fù)提供更多的思路。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)對象：人直結(jié)腸癌細胞(HCT116，購于中國科學院上海生命科學研究院)。培養(yǎng)條件：細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃，5%CO2。培養(yǎng)基：1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco公司)加10%胎牛血清，加1%青霉素-鏈霉素溶液。

1.2 藥品與試劑 磁鐵長5.0 cm，寬2.5 cm，高0.5 cm。磁場強度測試儀(特斯拉計，購自泰仕電子工業(yè)股份有限公司)測得磁場強度0.5 μT。脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物丙二醛(MDA)試劑盒購自Sigma公司，谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自Solarbio公司，谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)試劑盒購自雷根生物公司，鐵檢測試劑盒(亞鐵嗪微板法)購自北京百奧萊博科技有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Boster Bio，Erastin購自Selleck公司，F(xiàn)errostatin-1購自TargetMol公司。

1.3 細胞鐵死亡指標及檢測方法 鐵死亡檢測指標：細胞內(nèi)GSH含量、GPX活性、鐵含量、脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物MDA含量。檢測具體步驟參照試劑公司提供的說明書，并探索優(yōu)化試劑用量。

1.4 藥品配制方法

1.4.1 Erastin配制方法 50 mg Erastin粉末加9.14 mL二甲基亞砜制成濃度10 mmol/L試劑,取1 mL(10 mmol/L)試劑加9 mL雙蒸水制成濃度1 mmol/L試劑，取1 mL(1 mmol/L)試劑加9 mL雙蒸水制成濃度100 μmol/L試劑，再取400 μL(100 μmol/L)試劑加1 600 μL培養(yǎng)基制成20 μmol/L終濃度試劑。

1.4.2 Ferrostatin-1配制方法 10 mg Ferrostatin-1粉末加38.117 mL雙蒸水制成濃度1 mmol/L試劑，取5 μL(1 mmol/L)試劑加入49.995 mL Erastin終濃度試劑制成0.1 μmol/L Ferrostatin-1終濃度試劑。

1.5 建立細胞模型 設(shè)置4個組：空白對照組、Erastin組、Erastin+磁場組、抑制劑組。將細胞接種于6孔板中，細胞長到50%融合度時，空白對照組正常培養(yǎng)，Erastin組換成配制好的Erastin試劑，抑制劑組換成配置好的Ferrostatin-1試劑，Erastin+磁場組換成配制好的Erastin試劑并在該組孔板的上下面放置磁鐵。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，終止培養(yǎng)檢查各項指標。

1.6 劃痕實驗 預(yù)先在6孔板背面，每個孔用黑色筆畫3條橫線，每個孔接種106個細胞，培養(yǎng)細胞長到100%時，用10 μL的無菌槍頭在每個孔里畫3條豎線，與預(yù)先畫好的3條橫線垂直，磷酸緩沖鹽溶液洗3次，洗掉脫落的細胞，換2 mL無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察，找到橫線與豎線交叉點拍照記錄，給予不同的干預(yù)，48 h后在相同的地方拍照記錄。劃痕修復(fù)率(%)=(0 h劃痕距離-48 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤細胞生化指標比較 Erastin組、Erastin+磁場組的鐵含量高于空白對照組，且Erastin+磁場組高于Erastin組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，而抑制劑組的鐵含量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Erastin組、Erastin+磁場組、抑制劑組的MDA含量均高于空白對照組，且Erastin+磁場組高于Erastin組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；Erastin組、Erastin+磁場組、抑制劑組的GSH含量、GPX活性均低于空白對照組，且Erastin+磁場組低于Erastin組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組腫瘤細胞中生化指標比較 (x±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；與Erasrin組比較，#P<0.05?？瞻讓φ战M、Erastrin組、抑制劑組、Erastin+磁場組的鐵含量樣本量(n=4、9、13、8)，MDA含量(n=11、15、7、16)，GSH含量(n=11、14、9、14)，GPX含量(n=9、14、7、15)。

2.2 細胞遷移能力的比較 Erastin+磁場組、Erasrin組的劃痕修復(fù)率低于空白對照組，且Erastin+磁場組低于Erasrin組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而抑制劑組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞劃痕修復(fù)率比較 (x±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；與Erasrin組比較，#P<0.05。

3 討 論

國內(nèi)外已有許多關(guān)于磁場抑制和治療腫瘤的研究，并取得了很大進展[4-9]。Sabo等[4]將HL-60癌細胞置于磁場72 h后發(fā)現(xiàn)癌細胞的生長受到了抑制。Omote等[5]發(fā)現(xiàn)脈沖磁場對癌細胞KDH-8和KMT-17有抑制作用。Tofani等[6]將帶有LLC或B16癌細胞的白鼠注射順鉑和環(huán)磷酰胺，再將他們置于磁場中，結(jié)果表明，使用磁場與這兩種藥物結(jié)合治療幾乎沒有毒副作用。磁場通過抑制腫瘤組織供血和代謝、抑制DNA復(fù)制、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、增強免疫細胞活性、抑制腫瘤的選擇性、抑制腫瘤異形增長，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7-9]。

研究顯示通過誘導(dǎo)腫瘤細胞鐵死亡來殺死腫瘤細胞，能抑制腫瘤的生長[10]。Erastin、索拉非尼、柳氮磺胺吡啶等是鐵死亡的誘導(dǎo)劑[11-13]。除此之外，Erastin可以提高順鉑、阿糖胞苷和阿霉素等在特定腫瘤上的化療作用[14-16]。Ferrostatin-1是鐵死亡抑制劑，能阻斷鐵死亡通路。本研究發(fā)現(xiàn)，Erastin組與空白對照組相比，腫瘤細胞遷移能力降低，鐵含量、脂質(zhì)過氧化物-MDA增加，GSH含量減少和GPX酶活性降低，而這種趨勢在加入抑制劑后部分逆轉(zhuǎn)了，說明上述指標的變化是因Erastin激活鐵死亡通路引起，而Ferrostatin-1阻斷了鐵死亡通路。Erastin+磁場組與Erastin組相比，腫瘤細胞遷移能力降低，鐵含量、脂質(zhì)過氧化物-MDA增加，GSH含量減少和GPX酶活性降低，尤其是鐵含量升高非常顯著。研究表明，使用鐵螯合劑可以抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，而補充外源性的鐵可以增加Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[17]。磁場干預(yù)后細胞內(nèi)鐵含量明顯增加，提示磁場增強Erastin誘導(dǎo)細胞鐵死亡的機制可能是磁場引起細胞內(nèi)鐵離子與鐵蛋白代謝紊亂，鐵離子儲存能力降低，鐵超載加重細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，進而引起細胞鐵死亡。

本研究表明Erastin可誘導(dǎo)細胞鐵死亡，低強度恒定磁場可以增強Erastin誘導(dǎo)的腫瘤細胞的鐵死亡作用，但沒有研究低強度恒定磁場影響細胞鐵死亡的機制，低強度恒定磁場是否通過其他因素影響鐵死亡還需進一步研究。