高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定莨菪浸膏片中的4種活性組分

杜暉，任靜，鄭妍

莨菪浸膏片由三分三浸膏或顛茄浸膏制成，為抗膽堿藥，具有解除平滑肌痙攣和抑制腺體分泌等功能，其主要成分為莨菪類生物堿?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只有鑒別和檢查，無含量測(cè)定部分。現(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于托烷類生物堿常用測(cè)定法為酸性染料比色法［1］、高效液相色譜法［2-5］、毛細(xì)管電泳法［6］、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［7-11］等。但目前檢測(cè)方法僅針對(duì)相關(guān)藥物中硫酸阿托品等3種極性較強(qiáng)的莨菪堿［12-15］含量的測(cè)定，有質(zhì)控指標(biāo)的缺陷，存在化學(xué)原料藥投料的風(fēng)險(xiǎn)［16-17］。東莨菪內(nèi)酯是一種香豆素類化合物，具有顯著的抗癌、抗氧化、抗炎和殺螨［18-19］等作用。除常規(guī)的3種生物堿外，本研究2017年10月至2018年6月增加了東莨菪內(nèi)酯的分離測(cè)定，為莨菪浸膏片的辨?zhèn)未嬲婧唾|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 戴安U3000高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)賽默飛世爾公司）；HC-3018R型低溫冷凍高速離心機(jī)（合肥科大創(chuàng)新股份有限公司）；Milli-QAdvantage超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

莨菪浸膏片為市售藥品（西安利君制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)1509559，規(guī)格24μg總堿量；沈陽同聯(lián)集團(tuán)，生產(chǎn)批號(hào)151004～151006，規(guī)格30μg總堿量）；氫溴酸東莨菪堿（生產(chǎn)批號(hào)100049～201009）、氫溴酸山莨菪堿（生產(chǎn)批號(hào)100051～201607）、硫酸阿托品（生產(chǎn)批號(hào)100040～201613）和東莨菪內(nèi)酯（生產(chǎn)批號(hào)110768～200504）。對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純（美國(guó)霍尼韋爾公司）；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 樣品溶液 取莨菪浸膏片30片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于總堿量0.3 mg），置離心管中，精密加入甲醇5 mL，密塞，置水浴中超聲提取15 min，再精密加入0.05 mol/L硫酸溶液5 mL，0.45μm濾膜過濾即得。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取氫溴酸東莨菪堿10.07 mg、氫溴酸山莨菪堿9.95 mg、硫酸阿托品9.68 mg和東莨菪內(nèi)酯10.03 mg，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別精密量取0.5、1、2、5、10和20 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇-0.05 mol/L硫酸溶液（1∶1）稀釋至刻度，即得。

1.2.2色譜條件色譜柱為Welch C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，二元梯度洗脫（0～35 min，A相由3%上升至 25%；35.0～40.0 min，A 相上升至 50%；40.0～45.0 min，A相維持在50%；45.1～50.0 min，A相維持在3%）；流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 分別吸取供試品和對(duì)照品溶液，按1.2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)行液相分析，記錄色譜圖如圖1所示，樣品中雜質(zhì)峰非常多，但被分析物與干擾組分得到了有效的分離，分離度均大于1.5。

2.2 線性范圍和檢測(cè)限的考察 精密量取1.2.1.2項(xiàng)所配置的東莨菪堿、山莨菪堿、阿托品和東莨菪內(nèi)酯的混合對(duì)照品溶液，按1.2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)行液相分析，以峰面積y（mAU/min）對(duì)樣品濃度x（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)均在0.999 3以上，如表1所示。當(dāng)S/N約為3時(shí)，計(jì)算出4種組分的檢測(cè)限分別為1.2、1.5、0.5和1.6 ng。

2.3 重復(fù)性及穩(wěn)定性考察 將批號(hào)為1509559樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，發(fā)現(xiàn)4種組分保留時(shí)間和峰面積的RSD值分別為0.15%、0.13%、0.07%、0.10%和0.70%、0.69%、0.98%、0.38%，證明該方法的重復(fù)性滿足實(shí)驗(yàn)要求。

將批號(hào)為1509559樣品溶液保存在4℃環(huán)境中，并在24、48、72 h和1周后進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)4種組分峰面積的RSD值分別為1.50%、1.79%、1.85%和2.02%，樣品在1周內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖1 莨菪浸膏片供試品（A為沈陽同聯(lián)151006、B為西安利君1509559）和對(duì)照品（C）的高效液相色譜圖

表1 莨菪浸膏片中4種組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢測(cè)限

2.4 樣品測(cè)定及回收率考察 按1.2.1.1方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，按1.2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)行液相分析，測(cè)得4批莨菪浸膏片中4種組分的含量，如表2所示。3種生物堿含量的和相比藥品規(guī)格略低，考慮可能是樣品中還存在少量其他種類的生物堿。

表2莨菪浸膏片4批樣品中4種組分的含量/（微克/片，±s）

樣品西安利君1509559沈陽同聯(lián)151004沈陽同聯(lián)151005沈陽同聯(lián)151006東莨菪堿3.23±0.13 1.60±0.06 1.52±0.05 1.52±0.05山莨菪堿0.75±0.03 1.01±0.03 1.02±0.03 1.00±0.04阿托品15.30±0.45 25.55±0.60 25.30±0.57 25.81±0.53東莨菪內(nèi)酯1.25±0.04 4.01±0.14 4.05±0.20 4.50±0.18

按1.2.1.1方法測(cè)定批號(hào)為1509559的莨菪浸膏片中的4種組分，并向樣品中準(zhǔn)確加入高中低3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組濃度平行3份，計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果如表3所示，平均回收率在98.3%～100.0%之間，RSD小于2.8%。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 東莨菪堿等3種生物堿均是末端吸收，而東莨菪內(nèi)酯的最大吸收波長(zhǎng)是220和350 nm。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)小于210 nm時(shí)，基線不平穩(wěn)，干擾較明顯；當(dāng)波長(zhǎng)大于220 nm，4種成分的紫外吸收又明顯減弱。綜合考慮，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為215 nm。

表3 莨菪浸膏片4種組分的回收率

3.2 提取溶劑 比較了相同的超聲時(shí)間和條件下，甲醇、水和0.05 mol/L硫酸溶液等3種溶劑的提取率和樣品出峰情況。參考文獻(xiàn)［14］并試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用0.05 mol/L硫酸溶液提取阿托品等生物堿，樣品干擾少且重復(fù)性較好，但是東莨菪內(nèi)酯提取率較低；甲醇作為溶劑可以兼顧所有目標(biāo)成分的提取，但溶劑與流動(dòng)相極性差別較大導(dǎo)致色譜峰拖尾嚴(yán)重；故我們?cè)谟眉状继崛悠泛蠹尤胪w積的0.05 mol/L硫酸溶液，從而滿足我們分析要求。

3.3 流動(dòng)相 實(shí)驗(yàn)中我們考慮了甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸溶液（15∶85和20∶80）等度洗脫，雖然東莨菪堿和山莨菪堿的出峰時(shí)間較快，但是與相鄰雜質(zhì)峰無法完全分離；而東莨菪內(nèi)酯則在40 min左右出峰，整體分析時(shí)間較長(zhǎng)?？紤]到包括東莨菪堿在內(nèi)的幾種生物堿極性相近，我們將起始甲醇比例降為3%，采用梯度洗脫，到35 min時(shí)，甲醇的比例提高到25%，4種成分在30 min出峰完畢，峰形對(duì)稱無干擾；而后調(diào)整有機(jī)相比例，使弱極性組分快速洗脫完畢。

4 結(jié)論

相比文獻(xiàn)［12，14］，本研究增加了樣品中東莨菪內(nèi)酯的分離測(cè)定，并且將分析時(shí)間大幅度縮短至50 min。本研究采用甲醇提取莨菪浸膏片中的有效成分，促使弱極性的東莨菪內(nèi)酯有效溶出；而后再同比例加入酸水，減小了溶劑與流動(dòng)相極性的差別從而兼顧了峰形。莨菪浸膏片原有標(biāo)準(zhǔn)中無含量測(cè)定項(xiàng)目，鑒別項(xiàng)目涉及的是托烷類生物堿，沒有針對(duì)性。本研究所述方法對(duì)莨菪浸膏片中4種組分進(jìn)行了分離測(cè)定，控制了該藥品非法添加化學(xué)原料的問題，可用于莨菪浸膏片的質(zhì)量控制。