腎氣丸對(duì)缺血再灌注損傷小鼠腎細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究

趙峰，綦海燕，肖程程，蔣楠，吳帥

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種常見且危重的臨床疾病，發(fā)生在約5%的住院病人中，總死亡率在45%～70%之間［1-3］。而腎缺血再灌注（ischemiareperfusion，I/R）損傷是急性腎損傷的主要病因之一，常發(fā)生于腎移植、腎動(dòng)脈栓塞及休克病人［4-6］。研究表明，細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）、促炎性細(xì)胞因子和促凋亡因子在腎I/R損傷中起重要作用［7-8］。腎氣丸出自《金匱要略》，具有溫補(bǔ)腎陽的功效。研究表明腎氣丸具有抗生精細(xì)胞、肝細(xì)胞凋亡的作用［9-10］，但其對(duì)腎臟I/R損傷的保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確。本研究于2018年4—7月研究腎氣丸在小鼠I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康雄性C57BL6小鼠40例，清潔級(jí)，體質(zhì)量20～25 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。過程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.1.2 藥品與試劑 腎氣丸中所含中藥飲片均一次性購于青島市中醫(yī)醫(yī)院門診中藥局。制備：中藥浸泡2 h，第1煎200 mL，30 min，取汁；第2煎200 mL，20 min，取汁；第3煎200 mL，20 min，取汁。將3次所煎取的藥液混合，濃縮至100%濃度，即1 g/mL。血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）測試盒，購自上海微蒙生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物制品公司；β-actin，Bcl-2和Caspase-3購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司。磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶信號(hào)通路（AKT）抗體購自Cell signaling tecnology公司，二抗購自Santacrus公司。

1.2 分組與模型建立

1.2.1 分組 將小鼠在20℃～26℃實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)2 d，利用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10例：①假手術(shù)組；②腎缺血再灌注組（腎I/R組）；③腎氣丸低劑量組；④腎氣丸高劑量組。腎氣丸低劑量組和高劑量組均給予腎氣丸中藥液灌胃，每天劑量分別為10.5 g/kg和21.0 g/kg，治療持續(xù)2周［11］。假手術(shù)組和腎I/R組使用生理鹽水進(jìn)行灌胃，2周后構(gòu)建腎I/R損傷的小鼠模型。

1.2.2 模型建立 本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)建腎I/R損傷模型，10%水合氯醛腹腔麻醉，剖腹手術(shù)，游離雙側(cè)腎蒂。腎I/R組和腎氣丸組（低劑量組和高劑量組）小鼠夾閉雙側(cè)腎蒂，夾閉時(shí)間為30 min，之后摘掉動(dòng)脈夾以恢復(fù)腎組織血流的灌注，再對(duì)小鼠腹壁進(jìn)行縫合［12-14］。假手術(shù)組開腹并游離雙側(cè)腎蒂但不夾閉血管，其余操作相同。腎組織血流再灌注24 h后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，分離并提取血清，各組標(biāo)本分別保存在冰箱中，待檢測血清Scr、BUN含量。然后摘取左腎，仔細(xì)剪除附著的脂肪組織和筋膜，一部分迅速置于-80℃冰箱中保存，另一部分固定液經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋。

1.3 檢測方法

1.3.1 腎組織勻漿制備 制備勻漿前除去組織血液，用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱重。將干凈、干燥的勻漿管置于冰水混合物中，把組織塊放于勻漿管中，做到盡快剪碎組織，然后按1∶9（W/V）加入冰生理鹽水，進(jìn)行組織勻漿。而后將勻漿移入干燥試管，置于4℃離心機(jī)中，以3 000 r/min的速度離心10 min。取上清液儲(chǔ)存待測。

1.3.2 生化檢查 Scr、BUN、MDA含量及SOD活性檢測，以上指標(biāo)均按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3.3 HE染色 取稱量后的左側(cè)腎組織，于4%的多聚甲醛溶液中固定72 h后經(jīng)石蠟包埋、切片（厚度為5μm）、脫蠟水化處理后行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，使用倒置光學(xué)顯微鏡對(duì)各組小鼠腎組織的病理形態(tài)進(jìn)行觀察并評(píng)估損傷程度。

1.3.4 TUNEL染色 石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化處理后，修復(fù)抗原37℃與Proteinase K作用，封閉非特異性反應(yīng)加上胎牛血清和小牛血清白蛋白，用PBS漂洗，加入TUNEL緩沖液，PBS漂洗，給予3%甲醇溶液對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行阻斷，PBS漂洗，再次封閉非特異性抗原加入羊血清，使用PBS進(jìn)行漂洗，加1∶2稀釋的POD，PBS進(jìn)行漂洗，使用DAB顯色及蘇木精襯染，采用光學(xué)顯微鏡觀察標(biāo)本，細(xì)胞核黃染為陽性著色

1.3.5 PCR及免疫組化檢測Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平 RNA提取試劑盒提取組織總RNA，各組取等量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過PCR擴(kuò)增Bcl-2、Caspase-3及內(nèi)參β-actin的cDNA。每個(gè)檢測點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)管，以cDNA為模板對(duì)Bcl-2、Caspase-3基因進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。引物序列如下：Bcl-2，正向5′-GCCATATGGCGCACGCTGGGAGAA-3′，反向 5′-GCGCTCGAGTCACTTGTGGCCCAGATA-3′；Caspase-3，正向5′-TGGACCTGTTGACCTGAAA-3′，反向5′-ACAAAGCGACTGGATGAACC-3′；β-actin，正向5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3′，反向5′CCACAGGATTCCATACCCAAGA-3′。根據(jù)各反應(yīng)管的靶基因循環(huán)閾值（Ct）和內(nèi)參基因Ct值，采用比較Ct值法（2-ΔΔCt）計(jì)算E-Bcl-2、Caspase-3水平。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測PI3K、AKT蛋白表達(dá)組織蛋白的提取 將標(biāo)本儲(chǔ)存于-80℃低溫冰箱中，在蛋白提取前，先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稱重，每100 mg組織中加入1 mL RIPA，加入1 0μL PMSF，組織勻漿，低溫離心15 min，10 000～14 000 r/min，取上清加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min分裝，-70℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)取。將蛋白提取以后，進(jìn)行灌膠上樣，加樣后先使用恒流（10 mA），再使用恒壓（100 V）電泳至溴酚藍(lán)到凝膠的底部。至電泳結(jié)束以后，把凝膠移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)移使用100 V電壓，時(shí)間2 h。上述操作結(jié)束后，把PVDF膜轉(zhuǎn)移到平皿中，其內(nèi)含有封閉液，在室溫條件下，于搖床上搖動(dòng)封閉2 h。取出PVDF膜，加入稀釋后的一抗（1∶1 000）冰箱里4℃過夜。然后在室溫條件下，使用TBST脫色搖床上洗滌3次，每次時(shí)間10 min。然后加入1∶1 000比例稀釋的辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，在室溫下進(jìn)行孵育，時(shí)間1 h，再使用TBST脫色搖床上洗滌5次，每次時(shí)間10 min。其后在PVDF膜上滴加顯色劑，進(jìn)行顯色照相。最后用quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎氣丸對(duì)BUN和Scr含量的影響 與假手術(shù)組比較，腎I/R組腎功能受損明顯，BUN和Scr含量均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與I/R組比較，腎氣丸組（低劑量組和高劑量組）BUN和Scr含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與腎氣丸低劑量組比較，腎氣丸高劑量組中BUN和Scr含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 C57BL6小鼠Scr、BUN的比較/±s

表1 C57BL6小鼠Scr、BUN的比較/±s

注：BUN為尿素氮，Scr為血清肌酐。與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與腎I/R組比較，b P＜0.05；與腎氣丸低劑量組比較，c P＜0.05

Scr/（μmol/L）135.65±11.21 413.47±36.68a 308.32±17.36ab 225.59±21.05abc 253.192 0.000組別假手術(shù)組腎I/R組腎氣丸低劑量組腎氣丸高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 BUN/（mmol/L）8.37±1.80 67.45±8.40a 43.32±4.82ab 20.63±2.77abc 259.409 0.000

2.2 腎氣丸對(duì)MDA含量及SOD活性的影響 腎I/R組和腎氣丸組（低劑量組和高劑量組）中腎組織SOD活性均低于假手術(shù)組（P＜0.05），MDA含量高于假手術(shù)組（P＜0.05），均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與腎I/R組相比，腎氣丸組（低劑量組和高劑量組）SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量減少（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與腎氣丸低劑量組比較，腎氣丸高劑量組中SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 C57BL6小鼠MDA、SOD的比較/±s

表2 C57BL6小鼠MDA、SOD的比較/±s

注：MDA為血清丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶；與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與腎I/R組比較，b P＜0.05；與腎氣丸低劑量組比較，c P＜0.05

SOD/（U/mL）175.69±16.29 79.36±7.04a 95.61±9.71ab 145.72±14.68abc 126.815＜0.001組別假手術(shù)組腎I/R組腎氣丸低劑量組腎氣丸高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 MDA/（nmol/mL）3.75±0.33 13.21±1.39a 11.37±1.02ab 5.57±1.04abc 166.680＜0.001

2.3 各組腎I/R小鼠腎組織結(jié)構(gòu)的比較 HE染色顯示，假手術(shù)組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整、腎小管結(jié)構(gòu)清晰、腎間質(zhì)無水腫、管腔無管型；與假手術(shù)組比較，腎I/R組小鼠腎小管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫、脫落、小管結(jié)構(gòu)腫脹、小管腔凝固壞死等病變；腎氣丸低劑量和高劑量組小鼠腎細(xì)胞組織損傷程度減輕，腎小管的上皮細(xì)胞腫脹、脫落及凝固壞死等病變損傷減輕，高劑量組較低劑量組損傷程度更輕。TUNEL染色顯示，與假手術(shù)組比較，腎I/R組、腎氣丸低劑量和高劑量組細(xì)胞凋亡增加；與腎I/R組比較，腎氣丸低劑量和高劑量組細(xì)胞凋亡減輕，且高劑量組細(xì)胞凋亡程度更輕，見圖1。

2.4 PCR及免疫組化檢測Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，腎I/R組小鼠的Bcl-2表達(dá)降低［（1.96±0.18）比（0.61±0.09）］，Caspase-3表達(dá)增高［（0.45±0.06）比（1.76±0.19）］；與腎I/R組比較，腎氣丸低劑量和高劑量組小鼠的Bcl-2表達(dá)增高［（0.61±0.09）比（0.94±0.11）、（1.52±0.16）］，Caspase-3表達(dá)降低［（1.76±0.19）比（1.35±0.16）、（0.89±0.11）］；與腎氣丸低劑量比較，腎氣丸高劑量組小鼠的Bcl-2表達(dá)增高［（0.94±0.11）比（1.52±0.16）］，Caspase-3表達(dá)降低［（1.35±0.16）比（0.89±0.11）］，見圖2～4。

2.5 各組腎組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)測定 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）蛋白含量檢測顯示，與假手術(shù)組組比較，腎I/R組PI3K、AKT蛋白表達(dá)均顯著降低［（0.81±0.09）比（0.09±0.01），（0.86±0.11）比（0.11±0.01），P＜0.05］；與腎I/R組比較，腎氣丸組PI3K、AKT蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（0.09±0.01）比（0.23±0.02）比（0.45±0.05），（0.11±0.01）比（0.27±0.03）比（0.53±0.06），P＜0.05］；與腎氣丸低劑量組比較，腎氣丸高劑量組中PI3K、AKT蛋白表達(dá)升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（0.23±0.02）比（0.45±0.05），（0.27±0.03）比（0.53±0.06），P＜0.05］，見圖5。

3 討論

腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷（AKI）的主要病因，目前沒有可靠有效的治療方法改善預(yù)后及降低死亡率［15-16］。腎I/R損傷的有多種發(fā)病機(jī)制，其中腎組織中氧自由基等活性氧的增多是導(dǎo)致腎I/R損傷的主要原因之一，在疾病發(fā)生、發(fā)展的過程中起到重要作用［17］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生腎I/R時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基，同時(shí)，機(jī)體清除氧自由基的能力下降，導(dǎo)致氧自由基大量堆積，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致機(jī)體組織功能障礙［18-19］。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）是抗氧化機(jī)制中兩個(gè)非常重要的衡量指標(biāo)［20-21］。在損傷過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生亦十分關(guān)鍵，相關(guān)因子Bcl-2、Caspase-3均參與其中，并且，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2可激活促凋亡因子Caspase-3等其它因子，引起凋亡的發(fā)生［22］。

腎氣丸出自《金匱要略》，是治療腎氣虧虛證的經(jīng)典方，具有陰陽雙補(bǔ)、腎虛得復(fù)、元?dú)獬渥愕裙π?，能夠延緩損傷、激活組織器官功能。研究發(fā)現(xiàn)腎氣丸可減少肝細(xì)胞的脂性凋亡及抗生精細(xì)胞凋亡［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，腎I/R損傷組小鼠腎組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高；與腎I/R損傷組比較，腎氣丸低、高劑量組小鼠腎組織中SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，表明經(jīng)腎氣丸干預(yù)后，可提高腎組織細(xì)胞對(duì)ROS的清除能力，結(jié)果提示腎氣丸可能通過抑制腎組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而對(duì)腎I/R損傷具有保護(hù)作用。并且，通過HE及TUNEL染色表明，與腎I/R組相比，腎氣丸低劑量和高劑量組小鼠腎細(xì)胞組織損傷程度減輕，腎小管的上皮細(xì)胞腫脹、脫落及凝固壞死等病變損傷減輕，高劑量組較低劑量組損傷程度更輕。結(jié)果提示腎氣丸可有效抑制腎組織細(xì)胞損傷及凋亡。免疫組化可見，與假手術(shù)組比較，腎I/R組小鼠的Bcl-2表達(dá)降低，Caspase-3表達(dá)增高；與腎I/R組比較，腎氣丸低劑量和高劑量組小鼠的Bcl-2表達(dá)增高，Caspase-3表達(dá)降低；與腎氣丸低劑量比較，腎氣丸高劑量組小鼠的Bcl-2表達(dá)增高，Caspase-3表達(dá)降低。本研究結(jié)果提示腎氣丸可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低腎組織細(xì)胞凋亡，減輕小鼠I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷，從而為臨床使用腎氣丸治療急性腎損傷治療提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

P13K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)過活化的P13K通過激活A(yù)kt，進(jìn)而調(diào)控下游的多條信號(hào)通路，如Caspase、Bax/Bcl-2等信號(hào)通路，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與細(xì)胞的多種生理過程［23］。其中，作為P13K/Akt信號(hào)通路的下游，Bcl-2是常見的抗凋亡蛋白［24］，Caspase-3作為核心關(guān)鍵酶參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Caspase-3酶的水解活性超細(xì)蛋白作用可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能損傷DNA加速凋亡［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，腎I/R損傷后，小鼠腎組織中PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平顯著下降；與腎I/R損傷組比較，腎氣丸低、高劑量組小鼠腎組織中PI3K和AKT蛋白水平顯著升高；與腎氣丸低劑量組比較，腎氣丸高劑量組小鼠腎組織中PI3K和AKT蛋白水平顯著升高，這提示腎氣丸可激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制ROS生產(chǎn)，保護(hù)I/R所致的腎組織損傷。

綜上所述，本研究從體內(nèi)水平研究腎氣丸在腎I/R損傷的保護(hù)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)腎氣丸可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)小鼠I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷具有保護(hù)作用。但對(duì)臨床的指導(dǎo)意義仍存在不足，如給藥濃度及劑量還有待進(jìn)一步完善。中藥復(fù)方腎氣丸在辨證論治的整體思想指導(dǎo)下進(jìn)行配伍組方，往往可以通過多途徑、多靶點(diǎn)綜合作用于多個(gè)病理環(huán)節(jié)，從整體上有效保護(hù)腎I/R損傷。進(jìn)一步深入研究腎氣丸對(duì)腎損傷的完整保護(hù)機(jī)制，將為臨床防治腎缺血再灌注損傷提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（本文圖1～5見插圖4-2）

圖1 各組小鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡情況比較：1A為HE染色（×400），1B為TUNEL染色（×400）

圖2 免疫組紛織化學(xué)檢測B淋巴細(xì)胞癌-2（Bcl-2）（2A）、半胱氨酸天冬蛋白酶3（Caspase 3）（2B）表達(dá)水平（×400）

圖3 半胱氨酸天冬蛋白酶3（Caspase 3）mRNA表達(dá)情況

圖4 B淋巴細(xì)胞癌-2（Bcl-2）mRNA表達(dá)情況

圖5 各組小鼠腎組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)比較：P13K為磷脂酰肌醇3-激酶、AKT為蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶信號(hào)通路