高效液相色譜法測(cè)定辣椒醬中苯甲酸和山梨酸的含量

貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)所（550004）高源 田莉 季偉 肖丹

貴州醫(yī)科大學(xué)（550025）劉尚瑩

食品防腐劑能抑制食品中微生物的繁殖，防止腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)保存期[1]。在食品加工過(guò)程中，人們采用了許多不同的手段來(lái)殺死或者抑制微生物，添加防腐劑是其中最方便而有效的一種方法，因而被廣泛使用于食品加工行業(yè)中[2]。然而許多商家和企業(yè)為了減小成本和謀取利益，出現(xiàn)了防腐劑的超標(biāo)使用、違規(guī)使用、使用劣質(zhì)防腐劑、不在食品標(biāo)簽中標(biāo)注添加了防腐劑、超范圍使用防腐劑等幾種情況[3]?；瘜W(xué)合成防腐劑使用不當(dāng)會(huì)有一定的副效應(yīng)， 長(zhǎng)期過(guò)量攝入會(huì)對(duì)身體健康造成危害[4]。主要表現(xiàn)在：影響人體新陳代謝平衡；對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害(如老年癡呆癥、帕金森綜合征及周?chē)窠?jīng)炎等疾病)；影響胎兒生長(zhǎng)發(fā)育；引起疊加中毒現(xiàn)象，可能構(gòu)成致癌危險(xiǎn)等。因此，檢測(cè)人員做好相關(guān)質(zhì)量檢查工作是關(guān)鍵點(diǎn)。科研檢驗(yàn)部門(mén)應(yīng)深入研究，找出快速簡(jiǎn)便、靈敏經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法和適用儀器。實(shí)施檢測(cè)措施，完善檢測(cè)隊(duì)伍，加強(qiáng)對(duì)防腐劑含量的快速檢測(cè)，從而及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理相關(guān)違法情況。

1 材料

1.1 主要儀器 eppendorf Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī)；隔膜真空泵；戴安UltiMate3000高效液相色譜儀，Chromeleon色譜工作站； Thermo AcclaimTM色譜柱（C18，250×4.6㎜，5μm，柱號(hào)為006644）；梅特勒分析天平；超聲水浴鍋；明澈D24UA純水超純水一體機(jī)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及試劑 標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.5%苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer GmbH）；純度為99.0%山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer GmbH）。試劑：乙酸銨（優(yōu)級(jí)純），成都艾科試劑；甲醇（色譜純），默克公司；乙酸鋅（優(yōu)級(jí)純）；超純水；0.45μm微孔濾膜；亞鐵氰化鉀（優(yōu)級(jí)純）；液相進(jìn)樣小瓶。樣品：貴州省食品藥品檢驗(yàn)所監(jiān)督抽查的辣椒醬樣品。模擬陽(yáng)性樣品（在辣椒醬樣品中加入食品級(jí)的苯甲酸和山梨酸，均勻制樣，測(cè)定其含量）。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo AcclaimTM色譜柱(C18 ，250×4.6㎜，5μm）；流速：1mL/min；色譜柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；流動(dòng)相：甲醇（0.02mol/L），乙酸銨（2：98）；進(jìn)樣量：10μL。見(jiàn)附圖1、2。

2.2 樣品前處理方法 隨機(jī)均勻取5.00g模擬樣品，精密稱(chēng)定，共有六份，分置50mL離心管中，加入30mL超純水，充分搖勻后，再加入1mL亞鐵氰化鉀溶液，1mL乙酸鋅溶液，混勻，在離心管中定容至50mL刻度線，超聲處理15min后，以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min。取上清液用0.45微孔濾膜過(guò)濾，注入液相進(jìn)樣小瓶，作為待測(cè)供試品溶液。

2.3 樣品測(cè)定 分別準(zhǔn)確吸取山梨酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)樣品溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積/峰高，根據(jù)峰面積/峰高-山梨酸濃度曲線和峰面積/峰高-苯甲酸濃度曲線求得樣品中山梨酸和苯甲酸含量。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及線性范圍的測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備：精密稱(chēng)取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01148g置于100mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解后定容至刻度。精密稱(chēng)取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01216g于100mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解后定容至刻度?；旌蠈?duì)照品溶液制備：取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液5mL于100mL容量瓶中，取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液10mL于100mL容量瓶中，均用水定容至刻度。所得山梨酸濃度為12.09μg/mL；苯甲酸濃度為10.54μg/mL。

分別吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、5、10、15、20mL置于50mL容量瓶中，定容至刻度。進(jìn)樣量為10μL，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄保留時(shí)間及峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其回歸方程。

在4.57～182.8μg/mL范圍內(nèi)苯甲酸質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.4007x-0.001，r=1。在2.14～85.76μg/mL范圍內(nèi)山梨酸質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.6996x-0.0064，r=1。

2.5 精密度和重復(fù)性考察 取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10ul，可得出精密度苯甲酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD是0.099%，山梨酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD是0.13%。平行處理6次樣品，進(jìn)樣量為10uL，在優(yōu)化色譜條件測(cè)得樣品重復(fù)性為，苯甲酸含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD是0.69%，山梨酸含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD是2.4%。說(shuō)明其精密度，重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收率的考察 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：精密稱(chēng)取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01176g于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。精密稱(chēng)取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01067g于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分別精密量取20mL苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、10mL山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于200mL容量瓶中，稀釋至刻度，其濃度分別為23.40μg/mL、10.56μg/mL。

附圖1 苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

附圖2 苯甲酸、山梨酸樣品色譜圖

供試樣溶液制備：稱(chēng)取上述模擬陽(yáng)性樣品5.00g，共6份，精密稱(chēng)定，分別置于50mL離心管中。其中1、2管精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5mL，3、4管精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液15mL，5、6管精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液25mL，按2.2所述方法制備樣品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀測(cè)定。記錄峰面積值，計(jì)算苯甲酸，山梨酸回收率。其計(jì)算公式為：

回收率平均值苯甲酸為98.11%，RSD為1.5%，山梨酸為96.91%，RSD為1.6%。

2.7 實(shí)際檢出限的測(cè)定 苯甲酸實(shí)際檢出限的確定：吸取濃度為5.2525μg/mL苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4mL，置于裝有5.0g樣品的50mL容量瓶中，依照2.2所述方法進(jìn)行樣品處理。精密吸取10μL注入液相色譜中，記錄苯甲酸峰高，與噪音相比，滿(mǎn)足3倍信噪比的要求，可得到苯甲酸的實(shí)際檢出限為0.4mg/Kg。

山梨酸實(shí)際檢出限的確定：吸取濃度為5.0705μg/mL山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.3mL，置于裝有5.0g樣品的50mL容量瓶中，依照2.2所述方法進(jìn)行樣品處理。精密吸取10μL注入液相色譜中，記錄山梨酸峰高，與噪音相比，滿(mǎn)足3倍信噪比的要求，可得到山梨酸的實(shí)際檢出限為0.3mg/Kg。