第28屆國際生物學(xué)奧林匹克競賽試題 實(shí)驗(yàn)2·生物化學(xué)

佟向軍 王戎疆 張雁云 杜 軍 范六民

（1 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100871 2 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875 3 中國人民大學(xué)附屬中學(xué) 北京 100080）

總分：78 分 時(shí)間：120 min

本實(shí)驗(yàn)考試包含3 個(gè)問題，請(qǐng)按照下述順序完成實(shí)驗(yàn)：

問題1:分析血液標(biāo)志物（11 分）。本實(shí)驗(yàn)約耗時(shí)15 min,將提供一些數(shù)據(jù)請(qǐng)你分析。

問題2：動(dòng)力學(xué)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)測定（60 分）。本實(shí)驗(yàn)約耗時(shí)90 min，你將得到自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

問題3：遺傳標(biāo)記分析（7 分）。本實(shí)驗(yàn)約耗時(shí)5 min，將提供一些數(shù)據(jù)請(qǐng)你分析。

本考試中，你將通過血液標(biāo)志物、酶動(dòng)力學(xué)和一種遺傳病的家族遺傳分析一位病人的病史。

重要信息：

●在給定的框中寫下你的姓名、學(xué)生代碼和國家；

●請(qǐng)?jiān)诖痤}紙上填寫答案，這樣才能得分；

●確定已收到列出的所有材料和設(shè)備；如果缺少任何物品，請(qǐng)立即舉綠牌示意；

●實(shí)驗(yàn)過程中，請(qǐng)確保正確操作設(shè)備；由于自己的原因不慎灑出液體或損壞設(shè)備，將不予補(bǔ)充；

●在考試結(jié)束哨聲響起時(shí)，請(qǐng)立即停筆；

●考試結(jié)束后，請(qǐng)將答題紙留在桌子上；

●不得將紙張、材料或設(shè)備從實(shí)驗(yàn)室?guī)С觯?/p>

●英文原件可應(yīng)要求提供。

材料：冰盒；溶液A：2×溶液的反應(yīng)母液，含有：50 mmol／L 磷酸鉀緩沖液，pH=7.6；14 mmol／L MgSO4；2.64 mmol／L ADP；40 U 乳酸脫氫酶；0.4 mmol／L NADH （10 mL）（在冰盒里）；溶液B：H2O（10 mL）；溶液C：10 mmol／L 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）溶 于0.1 mol／L 磷酸鉀緩沖液，pH=7.6（1.5 mL）（在冰盒里）；血漿稀釋液F、M 和D（每個(gè)0.5 mL）（在冰盒里）；1 支20～200 μL 移液器；1 支100～1 000 μL 或200～1 000 μL 移液器；適合移液器的吸頭；1 mL 塑料比色皿（1 cm 光程）×20；盛放廢棄吸頭和比色皿的垃圾桶；1 臺(tái)可見光分光光度計(jì)；查閱分光光度計(jì)的說明書（另外的單獨(dú)文件），將指導(dǎo)你使用分光光度計(jì)；置于樣品室的1 個(gè)比色皿以指示正確的方向；1 個(gè)比色皿架；方形封口膜×30；數(shù)字式計(jì)時(shí)器；30 cm 尺子；計(jì)算器；鋼筆；鉛筆。

重要背景信息：丙酮酸激酶（PK）是一種58 kDa 的蛋白，以同源四聚體的形式起作用，在糖酵解途徑中起關(guān)鍵作用（圖1）。在反應(yīng)中，將其底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化為丙酮酸和ATP。

PK缺乏癥（PKD）是遺傳性非球形細(xì)胞溶血性貧血的最常見原因，是一組與紅細(xì)胞凈損失相關(guān)的遺傳性疾病。在PKD 病癥中，紅細(xì)胞在成熟前裂解（經(jīng)歷溶血），導(dǎo)致紅細(xì)胞不足（貧血）。在遺傳性非球形細(xì)胞溶血性貧血中，紅細(xì)胞不像其他形式的溶血性貧血呈現(xiàn)球形。血液分析也有助于了解PKD疾病。此外，該疾病通常與網(wǎng)織紅細(xì)胞增多癥（即未成熟紅細(xì)胞——網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量增加）有關(guān)。

PKD遺傳于常染色體隱性模式。具有常染色體隱性病癥個(gè)體的父母可能會(huì)或不會(huì)顯示病情的體征和癥狀，取決于他們擁有的等位基因。

假定亞基表達(dá)量相同且隨機(jī)關(guān)聯(lián)，簡單雜合子或復(fù)合雜合子（雜合子中有2 個(gè)不同的隱性等位基因）中，PK 四聚體同工酶（A4，A3B，A2B2，B3A，B4）的理論比值為1∶4∶6∶4∶1。如果B 是變體，A 是正常的，則PKD 患者體內(nèi)所有PK 四聚體中約94%含有一個(gè)或多個(gè)突變的亞基；未組裝的單體易被蛋白酶降解。重要的是，要注意一些特定的等位基因編碼的PK 蛋白形成四聚體，而其他等位基因編碼的PK 蛋白則保持單體形式。

通常在簡單雜合子、復(fù)合雜合子和純合子中觀察到的臨床癥狀是可變的，從需要輸血的新生兒黃疸，到能自我調(diào)節(jié)、只顯示最小臨床癥狀的溶血性貧血。根據(jù)有缺陷酶的生物化學(xué)特征，已經(jīng)鑒定了許多突變型PK。

圖1 丙酮酸激酶的功能

臨床情境：已診斷出很多家庭成員患有非球形細(xì)胞溶血性貧血，可能與PK 缺乏有關(guān)?？蛇M(jìn)行許多測試，包括血液測定以確定血液組成的參數(shù)（血液圖）和專門用于PK 活性的血漿酶分析。此外，可進(jìn)行遺傳分析，包括鑒定個(gè)體的PK 蛋白，以及通過家系分析確認(rèn)可能的遺傳模式。

你將分析和收集3 名家庭成員的數(shù)據(jù)：父親（F）、母親（M）和女兒（D），以確定家系。

問題1：血液分析

從父親（F）、母親（M）及其女兒（D）收集全血樣本。取血并分析后，獲得以下這部分結(jié)果（表1）。

表1

可進(jìn)行各種分析，包括測定血細(xì)胞比容，即紅細(xì)胞堆積的體積占總血量的百分比。通過將血液樣品吸入微量毛細(xì)管并離心，使紅細(xì)胞沉淀在一起，再通過測量毛細(xì)管中堆積在一起的紅細(xì)胞占總體積的比值，計(jì)算紅細(xì)胞的百分比。

任務(wù)1a

確定圖2所示的每個(gè)人的血細(xì)胞比容（堆積的紅細(xì)胞占總體積的百分比）。將這些數(shù)據(jù)填寫在表3的第1 行中,以百分比表示,小數(shù)點(diǎn)后保留1 位有效數(shù)字。

圖2 父親、母親及女兒的血細(xì)胞比容圖

表2 健康人的血液圖正常值

任務(wù)1b

使用圖2的堆積細(xì)胞體積和表1的患者數(shù)據(jù)，計(jì)算每位患者（F、M 和D）的以下參數(shù)：紅細(xì)胞體積，稱為平均細(xì)胞體積（MCV）；每個(gè)紅細(xì)胞血紅蛋白的質(zhì)量，稱為平均細(xì)胞血紅蛋白（MCH）；MCV 以飛升（fL，1 fL=1×10-15L）為單位，小數(shù)點(diǎn)后保留1 位有效數(shù)字；MCH 以皮克（pg，1 pg=1×10-12g）為單位，小數(shù)點(diǎn)后保留1 位有效數(shù)字；MCHC 是RBC 這部分中血紅蛋白總濃度，以克/分升（g／dL，1 dL=0.1 L）為單位，小數(shù)點(diǎn)后保留1 位有效數(shù)字。

請(qǐng)?jiān)诜娇? 中填寫計(jì)算所得父親（F）的每個(gè)參數(shù)值，并在表3中填寫父親（F）、母親（M）和女兒（D）各參數(shù)的相應(yīng)數(shù)字。

方框1 患者F（父親）的計(jì)算結(jié)果（4 分）

?

表3（4 分）

進(jìn)一步分析：根據(jù)紅細(xì)胞的大小，將貧血癥分為正常細(xì)胞（正常MCV）、大細(xì)胞（增加的MCV）或小細(xì)胞（降低的MCV）貧血?；谕庵苋科瑱z查，小細(xì)胞貧血也常被描述為低血色素貧血。小細(xì)胞小而薄的光學(xué)性質(zhì)，使其在血涂片上顯示為低著色，而血紅蛋白濃度保持在正常范圍（小細(xì)胞貧血；低色素性貧血）。正常血色素血液的血涂片無光學(xué)性質(zhì)的變化，血紅蛋白的濃度也在正常范圍。

表2提供了MCV 和MCHC 的正常范圍。

任務(wù)1c

使用你獲得的數(shù)值（包括在表3中），根據(jù)血細(xì)胞的大小及樣品F、M 和D 的血液中血紅蛋白水平進(jìn)行分類。

對(duì)每位患者，請(qǐng)從以下選項(xiàng)中選擇其一回答（注意：任何選項(xiàng)均可多次使用）：

A．大紅細(xì)胞，正常色素

B．小紅細(xì)胞，低色素

C．正常細(xì)胞，正常色素

（3 分）

?

問題2：測定丙酮酸激酶活性

利用生物化學(xué)方法，通過研究酶的動(dòng)力學(xué)變化，可了解酶的性質(zhì)。酶活性通常通過監(jiān)測底物的消失或產(chǎn)物的產(chǎn)生進(jìn)行確定，通常使用反應(yīng)混合物的分光光度特性的變化確定底物和產(chǎn)物的變化。

通過耦聯(lián)測定方便地測定PK，其中反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸（方程式1）用作NADH 耦聯(lián)的乳酸脫氫酶（LD）（方程式2）的底物。該酶以足夠的量加入到反應(yīng)混合物中，使反應(yīng)期間產(chǎn)生的所有丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸?？赏ㄟ^340 nm 光吸收值隨時(shí)間的減小監(jiān)測反應(yīng)。耦聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)方程式見圖3。

圖3 丙酮酸激酶（PK）和乳酸脫氫酶（LD）催化的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）（方程式1）和丙酮酸（方程式2）的分解

可通過改變PEP 底物濃度確定酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)（方程式1）。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定3 位患者，父親（F）、母親（M）和女兒（D）血漿樣本中PK 的功能。

●通過使用耦聯(lián)測定法測定患者血漿樣品中PK 的活性。

●計(jì)算PK 的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，以絕對(duì)單位表示。

方法:丙酮酸激酶測定開始前,請(qǐng)注意以下事項(xiàng)：

1）溶液A、C 和患者樣本F（父親）、M（母親）、D（女兒）應(yīng)保持在冰上，溶液B（H2O）保持在室溫。

2）分光光度計(jì)應(yīng)該在340 nm 波長處使用水（已提供）做空白對(duì)照。

3）通過表4所示的試劑，直接吸取至1 mL的塑料比色皿中制備反應(yīng)混合物。你應(yīng)該添加除血漿樣品以外的所有成分，然后在準(zhǔn)備開始反應(yīng)時(shí)，最后添加血漿樣品。

表4 丙酮酸激酶實(shí)驗(yàn)試劑

任務(wù)2a

計(jì)算5 個(gè)濃度的PEP（溶液C）（從0.2～1.5 mmol／L中選取5 個(gè)濃度） 所需PEP 的反應(yīng)體積。在方框2 中填寫最高濃度的計(jì)算示例。PEP 將推動(dòng)反應(yīng)進(jìn)行,以測定每個(gè)血漿樣品［父親（F）、母親（M）和女兒（D）］中的丙酮酸激酶活性。

方框2（1 分）

任務(wù)2b

將用于使反應(yīng)混合的體積填入表5中的空白處；注意：對(duì)于每個(gè)血漿樣品（F、M 和D）都相同。

你應(yīng)該在表5每一列的頂部填寫上你決定用的底物濃度PEP［S］，以及在各相應(yīng)框中填寫每個(gè)溶液所用的體積。

表5 反應(yīng)體積（3 分）

PK 活性測定

通過反復(fù)顛倒比色皿混合內(nèi)容物（確保使用拇指或食指將一塊封口膜壓緊在開口處），在零時(shí)間點(diǎn)讀取A340讀數(shù)，然后以30 s 的間隔記錄A34090 s。記錄下分光光度計(jì)上顯示的吸光值。

對(duì)于每個(gè)樣品，需要確定你使用各濃度PEP（［S］） 時(shí)的初始反應(yīng)速率ΔA／Δt（時(shí)間以min 表示），用零時(shí)間點(diǎn)值和另一個(gè)選擇的數(shù)值。在數(shù)值上畫圈以突出顯示你用于計(jì)算速率的時(shí)間點(diǎn)范圍。

任務(wù)2c

按所描述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并使用提供的表記錄吸光度讀數(shù)（表6.1、6.2 和6.3）。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算：隨著時(shí)間的推移，產(chǎn)物/底物濃度的變化可通過吸光度的變化表示。對(duì)于每個(gè)初始速率ΔA／Δt，計(jì)算每個(gè)PEP 底物濃度（［S］）的反應(yīng)初始速度V0（ΔConc／Δt）。反應(yīng)用Beer-Lambert定律給出速度絕對(duì)單位應(yīng)為μmol／min。Beer-Lambert 定律（或Beer 定律）是吸光物質(zhì)的吸光度和濃度之間的線性關(guān)系。公式為：A=εlc，其中A為光吸收，ε為摩爾消光系數(shù)，l為光程，c為濃度。

該實(shí)驗(yàn)測量NADH［摩爾消光系數(shù)為6 220 L／（mol·cm）］向NAD+（其在340 nm 具有可忽略的吸光度）的轉(zhuǎn)化，即PEP 向乳酸的轉(zhuǎn)化。由于組分摩爾比為1∶1，因此，NADH 的轉(zhuǎn)化率等于PEP 的轉(zhuǎn)化率。比色皿光程長度為1 cm。

任務(wù)2d

計(jì)算初始速度（V0），將每個(gè)病人［父親（F）、母親（M）和女兒（D）］的答案填入下表（表7.1、7.2和7.3），保留3 位小數(shù)。

表6.1 樣品F（6 分）

表6.2 樣品M（6 分）

表6.3 樣品D（6 分）

表7.1 患者F（1 分）

表7.2 患者M(jìn)（1 分）

表7.3 患者D（1 分）

計(jì)算酶參數(shù)KM和Vmax

通過不同底物濃度的不同酶促反應(yīng)速率，可確定2 個(gè)酶參數(shù)：KM和Vmax。這2 個(gè)參數(shù)可通過以下2 種方法之一進(jìn)行估算：Michaelis-Menten 圖（圖4A）或Hanes-Woolf 圖（圖4B）。

圖4 動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)圖

任務(wù)2e

使用你從每位患者（F、M 和D）獲得的數(shù)據(jù)，在下面的坐標(biāo)紙上，以V0對(duì)［S］各做一張Michaelis-Menten 圖。你應(yīng)該將3 個(gè)數(shù)據(jù)圖繪制在一張坐標(biāo)紙上：父親（F）、母親（M）和女兒（D）各一個(gè)數(shù)據(jù)圖。用“×”標(biāo)記來自父親（F）的數(shù)據(jù)，用“○”標(biāo)記來自母親（M）的數(shù)據(jù)，用“△”標(biāo)記來自女兒（D）的數(shù)據(jù)。

Michaelis-Menten 圖（10 分）

任務(wù)2f

使用3 個(gè)數(shù)據(jù)圖，估計(jì)Vmax和KM；使用正確的單位在下表中填入圖中每個(gè)樣本的估計(jì)值，保留2 位小數(shù)。（6 分）

?

任務(wù)2g（3 分：每完成一個(gè)表1分）

對(duì)每個(gè)樣品的每個(gè)底物濃度，確定［S］／V0，并將每位患者［父親（F）、母親（M）和女兒（D）］的答案寫在下表中。估算值保留2 位小數(shù)。

患者F （1 分）

患者M(jìn) （1 分）

患者D （1 分）

任務(wù)2h

對(duì)于每位患者 （F、M 和D），在下面的坐標(biāo)紙上，以［S］／V0作圖。你應(yīng)該將3 個(gè)數(shù)據(jù)圖繪制在一張坐標(biāo)紙上：父親（F）、母親（M）和女兒（D）各一個(gè)數(shù)據(jù)圖。對(duì)于每個(gè)數(shù)據(jù)圖，擬合一條最佳直線。用“×”標(biāo)記來自父親（F）的數(shù)據(jù)，用“○”標(biāo)記來自母親（M）的數(shù)據(jù)，用“△”標(biāo)記來自女兒（D）的數(shù)據(jù)。

Hanes-Woolf 圖（10 分）

任務(wù)2i

計(jì)算每位患者的Vmax和KM，并使用正確的單位填入下表，保留3 位小數(shù)。（6 分）

?患者 Vmax KM父親（F）母親（M）女兒（D）

問題3：遺傳分析和診斷

將父親、母親和女兒的血樣送至臨床檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步分析。從全血中提取蛋白質(zhì)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后（western blot），使用酶聯(lián)抗PK 抗體和化學(xué)發(fā)光檢測使樣品顯像。所得PK 蛋白含量見圖5，請(qǐng)參閱重要背景信息以幫助理解圖像。

圖5 受影響的家族中PK 蛋白變體的免疫印跡

任務(wù)3a

完成下表，指出每位患者（F、M 或D）的樣品中是否存在相應(yīng)大小的可見蛋白條帶。使用字母P 表示存在，用NP 表示不存在。

任務(wù)3b

在表格中指出，每位患者（F、M 或D）中是否含有PK 四聚體。使用字母P 表示存在，用NP 表示不存在。（5 分）

?

臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室還收到同胞兄弟姐妹和其他家庭成員的樣品，并分析了這些個(gè)體的PK 活性。此家庭中，該女兒有2 個(gè)兄弟（表8）。其他家庭成員PK 的KM數(shù)據(jù)也顯示在表8中。

任務(wù)3c

為了方便，請(qǐng)將用Hanes-Woolf 算法得到的父親、母親和女兒的KM值填入表格中（0 分）。

表8家族受試者的KM［PEP］數(shù)據(jù)。“先證者”表示作為家族遺傳研究起點(diǎn)的人。

?

圖6 家系

任務(wù)3d

（回答正確得1 分；除非你已經(jīng)正確回答任務(wù)3d，否則任務(wù)3e 不能得分）

指出父親Ⅲ-4 的PK 基因的組成情況（請(qǐng)?jiān)谀氵x擇的A、B 或C 上畫一個(gè)圓圈）：

A.簡單雜合子（Aa1，Aa2，Aa3）

B.復(fù)合雜合子（a1a2，a1a3，a2a3）

C.純合子（AA）

任務(wù)3e

（回答正確得1 分；只有任務(wù)3d 正確回答，本題才能得分）

指出兄弟Ⅳ-5 的PK 基因的組成情況（請(qǐng)?jiān)谀氵x擇的A、B 或C 上畫一個(gè)圓圈）：

A.簡單雜合子

B.復(fù)合雜合子