雙光子成像在細(xì)胞移植與治療中的應(yīng)用

楊皓旻，肖 昀，張運(yùn)海，倪健強(qiáng)

1中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇省醫(yī)用光學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215163；2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 蘇州 215006

雙光子成像的基礎(chǔ)理論提出后，Denk等[1]將雙光子激發(fā)現(xiàn)象應(yīng)用于激光共聚焦掃描顯微鏡中，提出雙光子顯微鏡。在對(duì)生物組織成像的應(yīng)用中，由于雙光子成像一般使用紅外波段的激光，受到生物組織散射影響較小，能夠比傳統(tǒng)的單光子共聚焦成像探測(cè)到更深的組織結(jié)構(gòu)[2-3]；同時(shí)，由于雙光子的激發(fā)效應(yīng)，對(duì)焦點(diǎn)外組織的熒光漂白效果較小，更適于進(jìn)行活體長(zhǎng)時(shí)間熒光成像。因此，在生命科學(xué)研究以及動(dòng)物模型的應(yīng)用中，雙光子成像技術(shù)已有廣泛應(yīng)用[4-7]。本文將介紹雙光子活體成像技術(shù)對(duì)細(xì)胞移植和治療研究中發(fā)揮的作用，并簡(jiǎn)要探討這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

1 技術(shù)原理

雙光子激發(fā)熒光是一個(gè)非線性光學(xué)過(guò)程[8-9]。與一般的單光子激發(fā)熒光不同，熒光分子被雙光子激發(fā)的過(guò)程中，熒光分子要在飛秒量級(jí)時(shí)間內(nèi)吸收兩個(gè)光子，才能從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，然后通過(guò)各種輻射或非輻射衰變路徑返回至基態(tài)。當(dāng)熒光分子通過(guò)自發(fā)輻射返回基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光。由于雙光子成像采用近紅外光作為激發(fā)光，受生物組織的散射影響相對(duì)較小，因此成像深度比可見(jiàn)光成像更深，一般可達(dá)到1 mm[10]，對(duì)組織進(jìn)行透明化處理手后成像深度可達(dá)到3 mm[11]。

雙光子成像過(guò)程中，熒光的激發(fā)只發(fā)生在焦點(diǎn)附近很小的區(qū)域內(nèi)，從原理上達(dá)到了空間濾波效果，避免了雜散光干擾，因此實(shí)際使用中不需要傳統(tǒng)共聚焦成像結(jié)構(gòu)中的針孔，更有利于收集在體成像時(shí)微弱的光信號(hào)。在活體成像中，除了通過(guò)加入外源性熒光分子對(duì)生物組織進(jìn)行熒光標(biāo)記[12-13]，還可以利用組織中一些固有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生的自發(fā)熒光成像，這些熒光物質(zhì)也被稱(chēng)為內(nèi)源熒光團(tuán)[14-16]。典型內(nèi)源熒光團(tuán)包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、卟啉類(lèi)化合物等。利用雙光子激發(fā)內(nèi)源熒光團(tuán)，進(jìn)行自發(fā)熒光成像，已經(jīng)應(yīng)用于研究在體狀態(tài)下細(xì)胞的形態(tài)學(xué)以及代謝水平[17-18]。

2 應(yīng)用領(lǐng)域

隨著轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記技術(shù)[19-20]與雙光子成像技術(shù)相結(jié)合，活體光學(xué)成像技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心肌、骨髓以及抗腫瘤藥物等領(lǐng)域研究中。

2.1 干細(xì)胞移植用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究

雙光子成像已用于研究神經(jīng)元分布、環(huán)路結(jié)構(gòu)等[21-24]等基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)問(wèn)題。突觸連接是形成神經(jīng)環(huán)路、實(shí)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的基礎(chǔ)。利用雙光子成像技術(shù)進(jìn)行在體光學(xué)成像，可以研究突觸連接及其在學(xué)習(xí)與記憶、衰老、損傷后、疾病等過(guò)程中扮演的角色。目前，由于大部分神經(jīng)連接生物學(xué)相關(guān)的基礎(chǔ)問(wèn)題只能在動(dòng)物模型中研究，有關(guān)突觸的許多問(wèn)題仍有待解答，例如在成熟的功能網(wǎng)絡(luò)中人類(lèi)神經(jīng)元是否經(jīng)歷重組，如何更好地模擬影響突觸連接的一系列神經(jīng)疾病等[25]。通過(guò)對(duì)人源神經(jīng)元進(jìn)行在體光學(xué)成像，可以為解答這些問(wèn)題發(fā)揮作用。

人胚胎干細(xì)胞（ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）有望模擬人腦在發(fā)育和疾病過(guò)程中的突觸連接[26-28]。然而，由于體外培養(yǎng)的ESCs和iPSCs衍生的神經(jīng)元存活期短，神經(jīng)與突觸成熟度不夠，建立的研究模型并不完善。有學(xué)者[29-30]建立了一套研究方案，將人ESCs/iPSCs衍生的神經(jīng)元移植進(jìn)入嚙齒動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。通過(guò)雙光子成像技術(shù)，觀察移植細(xì)胞進(jìn)入大腦皮層的情況，以及移植2月后在紋狀體、胼胝體等部位的軸突情況（圖1），確認(rèn)該方法可以增強(qiáng)人神經(jīng)元的存活期和功能成熟度，更有利于開(kāi)展人ESCs/iPSCs衍生神經(jīng)元在突觸形成與功能整合進(jìn)入宿主的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方面的研究。這套研究方法建立了更準(zhǔn)確的大腦皮質(zhì)疾病和修復(fù)模型，能夠促進(jìn)細(xì)胞移植治療腦損傷等疾病的發(fā)展。

在通過(guò)移植iPSCs恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)功能方面，研究表明，移植iPSCs衍生的神經(jīng)元可以促進(jìn)損傷的神經(jīng)環(huán)路功能恢復(fù)[31-32]。Falkner等[32]切除了成年鼠的一部分初級(jí)視皮層，然后將鼠胚胎神經(jīng)元移植到相同區(qū)域。利用雙光子成像技術(shù)進(jìn)行刺激-誘發(fā)響應(yīng)的在體成像，發(fā)現(xiàn)移植神經(jīng)元響應(yīng)視覺(jué)刺激的方式與宿主神經(jīng)元一致，說(shuō)明它已經(jīng)完全整合進(jìn)入了宿主的視覺(jué)通路，但整合的具體機(jī)制仍有待研究。

2.2 心肌細(xì)胞移植的功能研究

圖1 人ESC移植到新生小鼠腦部2月后不同腦部區(qū)域的軸突雙光子圖像Fig.1 Axonal two-photon images of different brain regions of newborn mice after human ESC transplantation

心血管疾病是人類(lèi)主要的致死性疾病，應(yīng)對(duì)策略主要是改變生活方式預(yù)防、藥物治療和手術(shù)干預(yù)。在心力衰竭的情況下，需要建立新的方法改善診斷和治療策略。心肌損失會(huì)導(dǎo)致心力衰竭，而移植是終末期心力衰竭的唯一具有確定長(zhǎng)期療效的治療方法。但是，器官移植會(huì)帶來(lái)一系列后續(xù)問(wèn)題。干細(xì)胞療法通過(guò)心肌細(xì)胞再生減少心臟變性，被認(rèn)為是最有前景的治療策略之一[33]。對(duì)單個(gè)離體心肌細(xì)胞的研究已在細(xì)胞和分子水平上提供了有關(guān)電特性和鈣離子的重要信息。但是，與單個(gè)細(xì)胞相比，完整組織中心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的特性有所不同[34]。有鑒于此，在心肌細(xì)胞移植治療的研究中，原位觀察和評(píng)估移植后細(xì)胞功能恢復(fù)情況，是評(píng)價(jià)移植治療效果的重要手段。

為了評(píng)估移植心肌細(xì)胞功能整合的程度，Rubart等[35-37]開(kāi)展了一系列研究，將表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因胚胎心肌細(xì)胞移植進(jìn)入非轉(zhuǎn)基因成年小鼠中，結(jié)合鈣離子熒光指示劑rhod-2，對(duì)完整心臟中移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)的瞬時(shí)變化進(jìn)行雙光子成像。發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞與宿主細(xì)胞功能發(fā)生耦合，移植細(xì)胞可以與宿主心肌形成功能合胞體[35]。有研究還進(jìn)行了心肌細(xì)胞移植治療后的功能研究[36]（圖2）。通過(guò)雙光子成像，監(jiān)測(cè)單個(gè)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位誘發(fā)鈣離子瞬時(shí)變化，并在連續(xù)電刺激的同時(shí)，通過(guò)線掃描模式下記錄rhod-2的瞬時(shí)變化，分辨了鈣離子變化的時(shí)間進(jìn)程。這些研究為細(xì)胞移植后影響整體細(xì)胞功能原因的進(jìn)一步研究提供了幫助。

利用雙光子顯微鏡在跳動(dòng)心臟中進(jìn)行細(xì)胞水平的研究，不可避免地會(huì)受到跳動(dòng)引起的位移干擾，Jones等[38]在經(jīng)典雙光子顯微鏡上進(jìn)行了改進(jìn)，消除了血流和心臟跳動(dòng)的影響，同時(shí)測(cè)量了鈣離子瞬態(tài)變化、血管尺寸和組織位移量，加以擴(kuò)展后可用于現(xiàn)有研究模型中。

2.3 造血干細(xì)胞的相關(guān)研究

造血干細(xì)胞是骨髓微環(huán)境的重要組成，借助雙光子成像技術(shù)對(duì)其動(dòng)態(tài)觀察，造血干細(xì)胞之間的相互作用以及對(duì)微環(huán)境的影響已有研究[39-41]。有研究利用雙光子在體成像技術(shù)，使用了GFP、DiD、自發(fā)熒光和二次諧波4種信號(hào)通道，標(biāo)記識(shí)別了鼠顱骨中的幾種成分[41]（圖3）。并對(duì)其進(jìn)行了多點(diǎn)延時(shí)成像，對(duì)造血干細(xì)胞和HSPCs進(jìn)行監(jiān)測(cè)，獲得了HSPCs與周?chē)h(huán)境的三維圖像，對(duì)單個(gè)移植細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了識(shí)別和長(zhǎng)時(shí)間高精度監(jiān)測(cè)，追蹤了移植HSPCs在鼠顱骨骨髓中的遷移，并觀察了HSPCs與基質(zhì)細(xì)胞的相互作用。

圖2 完整心臟中心肌細(xì)胞移植后的雙光子圖像Fig.2 Two-photon images of intact central cardiac muscle cells after transplantation

圖3 對(duì)顱骨不同深度下的二維雙光子圖像Fig.3 Two-dimensional two-photon images of the skull at different depths

采用類(lèi)似的裝置，有研究在小鼠模型中，利用雙光子顯微鏡研究了急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對(duì)骨髓血管和造血干細(xì)胞的影響[42]。觀察到急性粒細(xì)胞白血病中的骨髓血管受損、內(nèi)膜血管丟失等現(xiàn)象，以及用小分子去鐵胺或遺傳方法，可以保存骨膜內(nèi)皮，挽回造血干細(xì)胞的丟失，提高化療療效，并提高生存率。這些發(fā)現(xiàn)有可能改進(jìn)現(xiàn)有治療急性粒細(xì)胞白血病的方法。

2.4 抗腫瘤藥物的療效評(píng)價(jià)

在抗腫瘤藥物的研究中，通常將腫瘤細(xì)胞移植到健康小鼠體內(nèi)，建立異種移植模型。利用雙光子成像技術(shù)等在體成像技術(shù)，可觀察對(duì)抗腫瘤藥物治療后的腫瘤演變，進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)[43-45]。有研究分別使用雙光子顯微鏡實(shí)時(shí)觀察了不同腫瘤在化療藥物使用后的變化[44-45]。Shimura等[44]研究了紫杉醇在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移性異種移植模型中的療效（圖4）。將表達(dá)紅色熒光的胃癌細(xì)胞（NUGC4）移植進(jìn)入綠色熒光小鼠的腹腔，治療后，通過(guò)雙光子成像觀察，與解剖病理觀察結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)根據(jù)二者圖像得到的結(jié)論一致。研究結(jié)果證明了該實(shí)驗(yàn)方法可用于抗胃癌藥物臨床前的藥效評(píng)價(jià)，并可將個(gè)體差異降至最低。

圖4 紫杉醇治療后的腫瘤細(xì)胞雙光子圖像Fig.4 Two-photon image of tumor cells treated with paclitaxel

3 總結(jié)與展望

在已經(jīng)開(kāi)展的研究中，雙光子成像技術(shù)以其較大的成像深度、較高的成像質(zhì)量等特點(diǎn)，滿(mǎn)足了在體成像的需求，在以動(dòng)物為研究對(duì)象的研究中發(fā)揮了重要的作用，使我們對(duì)活細(xì)胞生理、病理和藥理領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)得到極大的發(fā)展。但是本技術(shù)還存在一定局限：成像深度仍在毫米量級(jí)；自發(fā)熒光成像對(duì)應(yīng)基團(tuán)有限；非熒光標(biāo)記的二次諧波成像局限于特定蛋白結(jié)構(gòu)；光源功率較高，盡管光漂白效果相對(duì)較弱，焦點(diǎn)附近樣品仍可能受到熱損傷。通過(guò)開(kāi)發(fā)新型標(biāo)記材料與方法，實(shí)現(xiàn)更低漂白效果和更豐富標(biāo)記手段；與其它影像技術(shù)結(jié)合，跨尺度成像，實(shí)現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)判斷與功能成像的結(jié)合，可能是本技術(shù)下一步的發(fā)展方向。