蒲公英提取物對(duì)豬致病菌的體外抑菌作用

王 留，郭全海，王向國(guó)，夏 晴

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476100）

蒲公英是中獸醫(yī)臨床常用的一種清熱解毒類中藥，具有抗菌消炎、清熱解毒、利尿消腫等多種生物學(xué)活性，其主要的抗菌活性物質(zhì)為綠原酸和咖啡酸。據(jù)報(bào)道，蒲公英對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、卡他球菌、結(jié)核桿菌、流感病毒及多種皮膚真菌均有抑制作用[1]，臨床上治療奶牛乳腺炎效果良好[2-3]。本試驗(yàn)采用濾紙片法和分光光度法研究蒲公英提取物對(duì)常見(jiàn)豬致病菌的抗菌效果和最小抑菌濃度，為蒲公英提取物在養(yǎng)豬生產(chǎn)及豬病臨床上的應(yīng)用提供參考。試驗(yàn)于2019年10月在商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疫病診斷實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 蒲公英提取物

蒲公英水提物，商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)室制備，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]。臨用時(shí)配制成3 g/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L、15 g/L、18 g/L 的系列濃度應(yīng)用。

1.2 試驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品檢查所，分別為豬鏈球菌3928株、豬胸膜肺炎放線桿菌268株以及多殺性巴氏桿菌388株。

1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購(gòu)于上海哈靈生物科技有限公司，按說(shuō)明書(shū)配置。胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.4 抑菌效果的測(cè)定

應(yīng)用紙片擴(kuò)散法測(cè)定蒲公英提取物的抑菌效果。用生理鹽水將蒲公英提取物配制成3 g/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L、15 g/L、18 g/L 系列濃度的溶液， 分別取10 mL置于滅菌培養(yǎng)皿中，將直徑6 mm的滅菌定性濾紙片放入培養(yǎng)皿中浸泡過(guò)夜，取出濾紙片30℃風(fēng)干備用。分別取活化培養(yǎng)的豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌懸液0.1 mL均勻涂布于TSA瓊脂培養(yǎng)基上，將藥敏紙片等距放入含菌培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h，用卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。以生理鹽水為對(duì)照，每種細(xì)菌重復(fù)3次。抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)[5]：抑菌圈直徑＞20 mm為極敏、15～20 mm之間為高敏、10～14 mm之間為中敏、＜10 mm為低敏、無(wú)抑菌圈為耐藥。

1.5 最低抑菌濃度的測(cè)定

應(yīng)用分光光度法測(cè)定蒲公英提取物的最小抑菌濃度。將蒲公英提取物添加在TSB肉湯培養(yǎng)基中，分別配制成蒲公英提取物終濃度為3 g/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L、15 g/L、18 g/L的系列TSB肉湯培養(yǎng)基，豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌每種細(xì)菌分別接種一個(gè)系列的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，用分光光度計(jì)測(cè)定各試管培養(yǎng)物的吸光度，以添加蒲公英提取物的各種細(xì)菌接種管與空白對(duì)照試管吸光度完全相同的最低添加濃度作為蒲公英提取物對(duì)該菌的最低抑菌濃度。每種細(xì)菌設(shè)5個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照（培養(yǎng)基+菌液）、陰性對(duì)照（培養(yǎng)基+蒲公英提取物）各1支試管。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英提取物的抑菌效果

蒲公英提取物對(duì)各種豬致病菌的抑菌圈直徑見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果顯示，蒲公英提取物對(duì)豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌均有較好的抑制效果，其抑制作用有濃度依賴性，隨藥物濃度的增加抑菌圈的直徑也隨之增大，抑制效果越好。蒲公英提取物對(duì)豬鏈球菌的抑制效果最好，濃度12 g/L時(shí)即可達(dá)到中敏效果，濃度18 g/L時(shí)可達(dá)到高敏效果。

表1 蒲公英水提物對(duì)豬致病菌的體外抑菌效果

2.2 蒲公英提取物的最小抑菌濃度

蒲公英提取物對(duì)各種豬致病菌的最小抑菌濃度見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果顯示，蒲公英提取物對(duì)豬鏈球菌的抑制效果最好，最小抑菌濃度為9.3 g/L；蒲公英提取物對(duì)豬胸膜肺炎放線桿菌的抑制效果最差，最小抑菌濃度為14.6 g/L。

表2 蒲公英水提物對(duì)豬致病菌的最小抑菌濃度 g/L

3 討論與結(jié)論

豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見(jiàn)的致病菌。豬鏈球菌感染能夠引起豬急性敗血癥、腦膜腦炎及慢性的關(guān)節(jié)炎、化膿性淋巴結(jié)炎，豬胸膜肺炎放線桿菌感染豬發(fā)生以肺炎和胸膜炎為特征的接觸傳染性胸膜肺炎，多殺性巴氏桿菌能夠使豬發(fā)生以纖維素性肺炎為特征的豬肺疫。目前，防治豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌等致病菌感染的主要措施仍然是以飼料中添加抗生素為主，抗生素的長(zhǎng)期應(yīng)用不僅導(dǎo)致病原菌耐藥性的出現(xiàn)，而且抗生素殘留危及人類健康和造成環(huán)境污染。中草藥作為一種綠色、環(huán)保、無(wú)公害的抗菌藥物，替代抗生素應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)具有很好的應(yīng)用前景。

李莉等[6]試驗(yàn)研究了16種中藥提取物對(duì)副豬嗜血桿菌的體外抗菌活性，結(jié)果顯示，黃連、黃柏、蒲公英、連翹對(duì)副豬嗜血桿菌具有較好的的抗菌效果。王定發(fā)等[7]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，廣西華山蒟、廣西山蒟、毛脈樹(shù)胡椒、海南假蒟、夏威夷假蒟等植物提取物對(duì)豬大腸桿菌和豬金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用。王春華等[8]研究表明，肥育豬飼料中添加蒲公英中草藥合劑能夠防治豬鏈球菌病的發(fā)生和降低豬群的發(fā)病率。鄔蘇曉等[9]通過(guò)體內(nèi)外抗菌試驗(yàn)證實(shí)蒲公英對(duì)豬鏈球菌具有較強(qiáng)的體外抑菌活性，體內(nèi)預(yù)防作用比治療作用效果好。本試驗(yàn)通過(guò)體外研究表明，蒲公英提取物對(duì)豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌均有較好的抑制作用，其抑菌效果有濃度依賴性，最小抑菌濃度分別為9.3 g/L、14.6 g/L、11.7 g/L。