豬源腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

丁建華，呂李明，周 磊，李澤偉，孫起榮，劉雪蘭，李 郁

（1.霍邱縣動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 六安 237400；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036）

已知多種動物均易被病原性大腸桿菌感染發(fā)生大腸桿菌病。在世界各地，大腸桿菌是豬群中很多疾病，包括新生仔豬腹瀉、斷奶仔豬腹瀉、敗血癥、多發(fā)性漿膜炎、乳腺炎、尿路感染的一個重要原因。腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC）是一組不同種類的大腸桿菌，不僅可正常定植于腸道，而且能侵入引起菌血癥，并誘發(fā)敗血癥或局部腸道外感染，如腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等[1]。臨床上通常使用抗生素進行大腸桿菌病的治療，但近年來隨著抗生素的大量使用，多重耐藥大腸桿菌菌株日益增多，給人和動物的安全帶來了極大隱患；而ExPEC產(chǎn)生的抗生素耐藥性明顯高于其他菌群，50%以上的菌株為多重耐藥，甚至許多菌株已演化成超級細菌，嚴重影響了選擇有效的抗生素對該類細菌引起的疾病進行防治[2]。由于發(fā)病率、死亡率升高和體重降低的增加，以及治療、疫苗和飼料添加劑的成本增加，ExPEC引起的豬大腸桿菌病導(dǎo)致的經(jīng)濟損失日益顯著。

本試驗對來自某集團公司家庭農(nóng)場的病豬腸道外組織及其積液（包括肝臟、脾臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)積液、心包積液），進行常規(guī)的細菌分離培養(yǎng)、分離菌的致病性試驗和藥敏試驗，進行ExPEC的分離鑒定及其對臨床上常用抗菌藥物的敏感性分析，從而為有效預(yù)防和控制該類大腸桿菌病流行提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

試驗時間為2018年3月至2019年3月。采樣地點：安徽、江蘇、山東、河北、廣西。試驗是在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病研究室進行的。本試驗用病豬共計172頭，來源于某集團公司家庭農(nóng)場，發(fā)病豬至少包含高熱、咳喘、關(guān)節(jié)腫大、皮膚發(fā)紅、敗血癥、腦膜炎等臨床癥狀中的一種。每頭病豬均采集其腸道外組織及其積液（包括肝臟、脾臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)積液、心包積液）。

1.2 試劑材料

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）、LB培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MHA）、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，革蘭氏染色液，Kovac試劑、MR試劑、V-P試劑，抗生素藥敏紙片等均購自杭州微生物試劑有限公司。體重為18～22 g、6～8周齡清潔級雌性昆明鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.3 質(zhì)控菌株

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和大腸桿菌（ATCC25922）購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4 細菌分離培養(yǎng)

以無菌操作采集病豬的肝臟、肺臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)積液、心包積液，分別接種MAC并作四區(qū)劃線，于37℃培養(yǎng)18～24 h。

1.5 腸外大腸桿菌鑒定

從1.4中MAC上挑取大腸桿菌的可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢。將鏡檢結(jié)果符合大腸桿菌的菌株純化后穿刺接種于TSI，37℃培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)結(jié)果符合大腸桿菌的菌株分別轉(zhuǎn)種蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水和枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，進行吲哚試驗（I）、甲基紅試驗（M）、乙酰甲基甲醇試驗（Vi）、枸櫞酸鹽利用試驗（C，簡稱 IMViC試驗）。

1.6 腸外大腸桿菌致病性試驗

自1.5中分離并鑒定為腸外大腸桿菌的菌株接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24 h。采取麥氏比濁法，用滅菌生理鹽水將腸外大腸桿菌培養(yǎng)菌液稀釋至濃度為0.5～1.0麥氏單位。將經(jīng)3 d觀察并呈現(xiàn)健康狀態(tài)良好的小鼠隨機分組，分為試驗組（若干組，根據(jù)分離菌株數(shù)確定試驗組數(shù)量，每株分離菌為一個試驗組）和對照組，每組5只；試驗組小鼠接種不同分離菌培養(yǎng)液，接種方式為腹腔注射，接種劑量為0.2 mL/只，對照組小鼠以相同的方式和劑量接種LB液體培養(yǎng)基。接種后觀察72 h，記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況。

對照組小鼠均健活，試驗組小鼠表現(xiàn)精神萎靡、眼睛無神、嗜睡、行動遲緩或靜止抱團不活動、食欲下降或不進食、被毛雜亂且無光澤度，最終死亡；并在無菌條件下將對照組和試驗組小鼠的肺臟、肝臟、脾臟分別進行細菌分離鑒定，方法同1.3和1.4。試驗組小鼠的分離菌與攻毒菌一致，對照組小鼠則無，表明腸外大腸桿菌具有致病性，鑒定為ExPEC。

1.7 ExPEC藥敏試驗

根據(jù)1.6確定的ExPEC，將其純化并制成菌懸液，校正濁度至0.5麥氏單位，使用MHA培養(yǎng)基，采用紙片瓊脂擴散法（K-B法）對ExPEC分離株進行藥敏試驗。22種抗生素包括青霉素（PEN）、阿莫西林（AMX）、氨芐西林（AMP）、頭孢唑林（CFZ）、頭孢氨芐（CA）、頭孢曲松（CRO）、鏈霉素（STR）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（RAN）、丁胺卡那（AMK）、新霉素（NEO）、大觀霉素（SPT）、四環(huán)素（TE）、多西環(huán)素（DX）、氟苯尼考（FFC）、甲氧芐胺嘧啶（TMP）、復(fù)方新諾明（SXT）、氧氟沙星（OFL）、恩諾沙星（ENR），環(huán)丙沙星（CIP）、多黏菌素B（PB）、多黏菌素 E（CT）。根據(jù)美國臨床和實驗室標準化研究所（CLSI）2018版執(zhí)行標準判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離與腸外大腸桿菌鑒定

自172頭病豬中共分離到71株符合大腸桿菌的形態(tài)、培養(yǎng)和生化反應(yīng)特性的菌株。在MAC上形成圓形凸起、不透明、粉紅色、邊緣整齊、表面光滑、直徑2～3 mm的菌落；培養(yǎng)物涂片染色鏡檢結(jié)果呈革蘭氏陰性、桿狀、兩端鈍圓、散在或成對排列的菌體；純化培養(yǎng)物在TSI中的結(jié)果為斜面和底面都變黃、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫，IMViC試驗結(jié)果為陽性、陽性、陰性、陰性，見圖1、圖2、圖3和圖4。

2.2 腸外大腸桿菌對小鼠的致病性

71株腸外大腸桿菌分別進行小鼠致病性試驗，按照1.6，有54株腸外大腸桿菌具有致病性，鑒定為ExPEC。54株ExPEC分離自33頭病豬，分離率為19.19%（33/172）；其中分離自肺臟的19株（35.19%），腸系膜淋巴結(jié)15株（27.78%），肝臟11株（20.37%），脾臟7株（12.96%），關(guān)節(jié)積液和心包積液各1株，分別占比1.85%。在54株ExPEC中，致小鼠100%死亡的 24株（44.44%），80%死亡的 11株（20.37%），60%死亡的6株（11.11%），40%死亡的8株（14.81%），20%死亡的5株（9.26%）。

2.3 ExPEC藥敏試驗結(jié)果

54株ExPEC對22種抗生素藥敏試驗結(jié)果見表1。100%的菌株耐受青霉素、多西環(huán)素，98%的菌株耐受甲氧芐胺嘧啶，復(fù)方新諾明，96%的菌株耐受阿莫西林、氨芐西林和四環(huán)素，85%的菌株耐受頭孢氨芐，80%的菌株耐受氟苯尼考，76%的菌株耐受卡那霉素和鏈霉素，72%的菌株耐受頭孢唑林，63%的菌株耐受慶大霉素，56%的菌株耐受頭孢曲松，54%的菌株耐受新霉素和環(huán)丙沙星，52%的菌株耐受恩諾沙星，44%的菌株耐受氧氟沙星，28%的菌株耐受丁胺卡那，20%的菌株耐受大觀霉素，而100%的菌株均對多黏菌素B和多黏菌素E敏感。

54株ExPEC對22種抗生素的耐藥譜見表2。98.1%菌株耐5種以上抗生素，均為多重耐藥。其中耐5～9種抗生素的菌株2株，占比3.7%；耐10種以上抗生素的菌株51株，占比94.4%。耐藥譜有46種，其中PEN+AMX+AMP+CFZ+CA+CRO+STR+GEN+RAN+AMK+TE+DX+TMP+SXT的占比最大，為10.87%。

表2 54株ExPEC的耐藥譜

3 討論

當前影響我國生豬健康養(yǎng)殖的五大難題包括品種、疾病、飼料、設(shè)備和環(huán)境，其中疾病防制是養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵，與養(yǎng)豬業(yè)效益、食品安全息息相關(guān)。目前豬病的發(fā)生和流行的新特點表現(xiàn)在：疾病種類明顯增多，多病原混合感染或繼發(fā)感染顯著增加；臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)一病多型、一病多癥、一癥多?。缓粑啦【C合征的問題日益突出；免疫抑制性疫病危害深重；細菌性疾病的危害加大，對藥物耐受性增強等。這些問題大大影響了生豬生產(chǎn)的穩(wěn)定發(fā)展。

本試驗從172頭病豬的腸道外組織及其積液中分離到71株大腸桿菌，其中54株為ExPEC，分離自33頭病豬，分離率為19.19%，與國內(nèi)相關(guān)研究報道19.1%、18.5%類似[3-4]；分離株多源自肺部（35.19%），其次是腸系膜淋巴結(jié)（27.78%）、肝臟（20.37%）和脾臟（12.96%），此外還由關(guān)節(jié)積液和心包積液中分離出ExPEC，這也與國內(nèi)相關(guān)研究報道類似[3，5-6]；表明豬源ExPEC流行較廣，感染較普遍。本試驗用病豬至少出現(xiàn)了高熱、咳喘、關(guān)節(jié)腫大、皮膚發(fā)紅、敗血癥、腦膜炎等臨床癥狀中的一種，從病豬腸道外的多器官組織中分離的54株大腸桿菌對小鼠均具有致病性，其中致病力很強（致小鼠100%～80%死亡）的菌株占比64.81%。研究顯示，大腸桿菌在高熱綜合征的發(fā)病過程中只起協(xié)同誘發(fā)作用[7]。而本試驗中54株ExPEC在致豬發(fā)病過程中的作用如何？由于沒有進行豬的攻毒試驗，因而尚不能確定，有待于進一步試驗探究。但該類菌對豬群健康產(chǎn)生的潛在危害性，應(yīng)引起我們的高度重視。

藥敏試驗結(jié)果顯示，本試驗的54株ExPEC均為多重耐藥，至少耐3種及以上受試藥物，其中94.4%的菌株耐10種以上藥物，同時存在46種不同的耐藥譜，表明其耐藥性強、耐藥譜復(fù)雜多樣。54株ExPEC對青霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、甲氧芐胺嘧啶、阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素、頭孢氨芐、卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、頭孢唑林的耐藥率均在70%以上，對慶大霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、新霉素、氧氟沙星的耐藥率均在46%以上，存在向耐藥性增強發(fā)展的趨勢，與國內(nèi)相關(guān)的報道有差異[3-6，8]，顯示出時間上和地域性差異。不同地區(qū)、不同豬場，即使同一豬場在不同的時間，其用藥方法都會存在一定的差別，而抗生素的選擇壓力會導(dǎo)致ExPEC分離菌對藥物的敏感性不同。所幸的是，54株ExPEC對多黏菌素B和多黏菌素E均敏感。多黏菌素對多重耐藥革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、沙門氏菌）的抑菌效果良好，多年來在臨床上得到廣泛應(yīng)用。我國是世界上多黏菌素農(nóng)業(yè)使用量最高的國家之一。然而，近年來動物源性多黏菌素類藥物耐藥率趨高，與質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1有關(guān)。2015—2016年的調(diào)查顯示，豬源大腸桿菌的mcr-1的流行率為68.86%[9]。

綜上所述，某集團公司家庭農(nóng)場的豬群中存在ExPEC一定程度上的流行，以肺臟分離率最高，多具有較強的致病性，耐藥性強且相當普遍，耐藥譜復(fù)雜多樣且有增大的趨勢。因此在臨床生產(chǎn)實際中，應(yīng)堅持不懈地進行豬群中ExPEC的監(jiān)測工作，及時分析ExPEC對藥物的敏感性，合理用藥，有效控制ExPEC對豬群的威脅，降低ExPEC耐藥性的產(chǎn)生和傳播，以保證生豬生產(chǎn)的健康、穩(wěn)定、持續(xù)發(fā)展。