孟魯司特鈉對支氣管肺發(fā)育不良大鼠Th1Th2細胞平衡及其相關細胞因子水平的調(diào)節(jié)作用

陳 信，彭萬勝，周 瑞，趙 茜，陳 云，周 艷，王 越，高 亞

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)常見于早產(chǎn)兒，屬于慢性呼吸系統(tǒng)疾病。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計，BPD在胎齡<28周的早產(chǎn)兒中的發(fā)病率超過50%，重度BPD患兒的病死率達到64%，存活的患兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的發(fā)生率是正常新生兒的2～3倍，是一種嚴重影響早產(chǎn)兒生命健康的疾病[1-3]。至今BPD尚無特效治療方法，雖然糖皮質(zhì)激素對BPD的治療有一定的效果，但是激素存在抑制患兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等不良反應，目前在臨床上的應用存在較大爭議。孟魯司特鈉(montelukast，MK)是一種半胱氨酰白三烯受體拮抗劑，屬于非激素類抗炎藥，對多種疾病具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的防護作用，且不良反應較少。目前，有研究[4-5]顯示出MK治療BPD的有效性和安全性，但其抑制BPD發(fā)展的確切機制尚不清楚。因此，本研究旨在探討MK對BPD大鼠免疫因子的影響以及細胞因子水平的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 隨機選擇SPF級健康SD大鼠60只，孕3周左右，體質(zhì)量200～250 g，常規(guī)喂食、供水下常規(guī)飼養(yǎng),溫度22～25 ℃，濕度50%～60%。所有實驗動物購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，并于SPF級實驗動物中心完成飼養(yǎng)和實驗操作。

1.1.2 主要儀器和試劑 100%醫(yī)用氧氣，購自重慶朝陽氣體有限公司。CY100型數(shù)字測氧儀，購自杭州立華儀器有限公司。有機玻璃氧箱，購自深圳市誠美有機玻璃制品有限公司。電熱恒溫水箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司。細胞培養(yǎng)箱，購自美國Millipore公司。BMJ-B型包埋機，購自常州市中威電子儀器有限公司。

DMSO、0.25%胰酶購自Sigma公司。DMEM/F12培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司。BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。孟魯司特鈉顆粒(順爾寧，杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20140167，0.5 g∶4 mg×7袋)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 將60只孕3周左右自然分娩SD母鼠與新生大鼠分為3組，每組20只，分別為：MK處理BPD模型組(MK組)、BPD模型組(BPD組)、常氧飼養(yǎng)對照組(對照組)。MK組、BPD組飼養(yǎng)在95%的高氧環(huán)境中，其中MK組給予MK(腹腔注射，10 mg·kg-1·d-1)處理，BPD組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液處理。對照組亦給予等劑量0.9%氯化鈉溶液處理，飼養(yǎng)在常氧環(huán)境中。

1.2.2 分析指標

1.2.2.1 肺功能檢測 實驗15 d后，將大鼠用2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔內(nèi)麻醉后，仰臥位置于密閉體描箱內(nèi)，其呼吸借助一端與插管連接，另一端與體描箱外動物呼吸機的皮管連接。動物呼吸時一個傳感器受動物氣道內(nèi)壓力的變化，另一個傳感器感受體描箱內(nèi)壓力的變化并通過放大器轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)電腦處理后計算出所需肺功能的各項指標：吸氣阻力(Ri)、呼氣阻力(Re)、肺順應性(Cl)、最大通氣量(MVV)、每秒鐘呼出容積占用力肺活量之比(FEV1/FVC%)[6]。

1.2.2.2 肺損傷局部巨噬細胞亞群和Th細胞功能亞群的檢測 流式細胞術法：肺損傷后不同時間點取肺組織置冰冷的磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)中。采用200目尼龍網(wǎng)過濾法獲取單細胞懸液，采用OptiPrep密度梯度離心法分離免疫細胞,用含10%FBS的RMPI1640培養(yǎng)液重懸1×106/mL。M1、M2型檢測采用CD68、CD86、CD163三色表面染色，采用CD68/SSC設門，確定巨噬細胞群體，進一步進行巨噬細胞亞群分析[7]。CD68+CD86+CD163-為M1型巨噬細胞，CD68+CD86-CD163+為M2型巨噬細胞。采用CD3、CD8 進行表面標記，IFN-γ/IL-4進行胞內(nèi)染色分別檢測Th1、Th2亞群。采用CD3/SSC設門，確定T 淋巴細胞群體，進一步進行Th細胞亞群分析。CD3+CD8-、IFN-γ+細胞群體為Th1細胞；CD3+CD8-IL-4+細胞群體為Th2細胞。所有流式細胞術樣本采用特異性抗體標記的同時均采用相應的同型對照抗體，來排除非特異染色,用以設定陰性標準。

1.2.2.3 肺損傷局部促炎和抗炎細胞因子的檢測 取大鼠肺部組織，檢測肺損傷局部干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6 等促炎因子和IL-4、IL-10、IL-13 等抗炎因子在肺損傷部位的水平[8]。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 3組大鼠肺功能比較 大鼠Ri、Re水平BPD組高于MK組，MK組高于對照組(P<0.05)，Cl、MVV、FEV1/FVC水平BPD組低于MK組，MK組低于對照組(P<0.05)(見表1)。

2.2 3組大鼠Th1、Th2細胞水平比較 大鼠Th1、Th1/ Th2水平BPD組高于MK組，MK組高于對照組(P<0.05)，Th2水平BPD組低于MK組，MK組低于對照組(P<0.05)(見表2)。

2.3 3組大鼠局部肺組織促炎因子相關細胞因子水平比較 大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平BPD組高于MK組，MK組高于對照組(P<0.05)(見表3)。

2.4 3組大鼠局部肺組織抗炎因子相關細胞因子水平比較 大鼠IL-4、IL-10、IL-13水平BPD組高于MK組，MK組高于對照組(P<0.05)(見表4)。

表1 3組大鼠肺功能比較

q檢驗：與MK組比較*P<0.05；與BPD組比較△P<0.05

表2 3組大鼠Th1、Th2細胞水平比較

q檢驗：與MK組比較*P<0.05；與BPD組比較△P<0.05

分組nIFN-γ/(μg/L)TNF-α/(ng/mL)IL-1β/(pg/mL)IL-6/(pg/mL)MK組2052.19±7.263.18±1.07137.42±9.55 184.31±27.68 BPD組2064.22±6.33?7.44±2.46?177.86±12.31?238.69±43.15?對照組2044.18±8.39?△1.31±0.29?△91.42±4.92?△137.42±27.66?△F—37.4181.34420.4345.42P—<0.01<0.01<0.01<0.01MS組內(nèi)—54.3902.42788.9821 131.060

q檢驗：與MK組比較*P<0.05；與BPD組比較△P<0.05

分組nIL-4/(pg/mL)IL-10/(ng/mL)IL-13/(ng/L)MK組2094.22±16.3752.16±9.4242.33±9.16BPD組20115.67±15.23?77.86±10.49?63.47±12.29?對照組2072.15±9.88?△38.44±5.29?△14.31±5.22?△F—47.55105.96139.16P—<0.01<0.01<0.01MS組內(nèi)—199.18175.58787.399

q檢驗：與MK組比較*P<0.05；與BPD組比較△P<0.05

3 討論

BPD是一種常見于早產(chǎn)兒的慢性肺部疾病[9]，臨床上早產(chǎn)兒日齡超過28 d后仍然需要氧療維持生命，且可能已發(fā)生肺部感染、肺動脈高壓等并發(fā)癥。大部分BPD患兒是在早產(chǎn)兒呼吸窘迫綜合征治療過程中發(fā)生。BPD嚴重危害早產(chǎn)兒的健康，重度BPD患兒超過一半會病死，存活的患兒會出現(xiàn)極高的再入院率和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙[10]。有研究[11-12]認為，胎兒炎癥反應綜合征是導致BPD發(fā)生的重要原因，多種炎性細胞和炎性細胞因子在發(fā)病過程中起到重要的作用。這些異常的炎性因子會阻礙肺支氣管發(fā)育的正常進程，延遲了肺泡微血管成熟時間，導致肺泡出現(xiàn)形成障礙。炎性細胞因子與抗炎性因子比例的失衡與BPD的發(fā)病密切相關。

BPD的治療尚無確切方案，目前臨床以糖皮質(zhì)激素治療為主。糖皮質(zhì)激素雖然對BPD的治療有一定的作用，但是尚未制定統(tǒng)一的治療方案，給藥的途徑和劑量仍然處于探索的過程，而且激素具有抑制神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的嚴重不良反應，可能會增加腦癱等嚴重傷殘的發(fā)生率。因此，臨床上使用糖皮質(zhì)激素治療BPD爭議較大[13]。MK屬于白三烯受體拮抗劑，研究已經(jīng)證實該藥物的抗炎、抗纖維化的作用，在哮喘、變應性鼻炎等呼吸道過敏性疾病的治療中應用廣泛。MK能夠抑制白三烯的水平，而白三烯的升高可能與BPD的發(fā)生發(fā)展密切相關。VLIEGENTHART等[14]在早產(chǎn)兒BPD的治療中使用了MK，明顯提高了重癥BPD患兒的生存率，同時患兒的機械通氣時間也顯著縮短。國外的研究[15]發(fā)現(xiàn)，使用MK治療BPD，所取得的臨床效果與使用糖皮質(zhì)激素治療相當，但患兒的不良反應明顯減少。MK治療BPD的機制尚未明確，多考慮與藥物通過靶向抑制Ⅰ型半胱酰胺白三烯受體的作用相關，而針對免疫系統(tǒng)的平衡和相關因子調(diào)節(jié)作用的臨床研究較少。

本次研究使用大鼠進行BPD造模，將剛出生的幼鼠進行高濃度氧環(huán)境下生長，以使大鼠發(fā)生BPD，同時使用MK進行治療。本研究顯示，BPD造模組大鼠Ri、Re水平高于MK組大鼠,提示MK具有改善BPD大鼠肺部通氣功能的作用。在免疫細胞平衡的研究中，BPD造模大鼠的Th1、Th1/ Th2水平最高，Th2水平最低。Th1細胞為CD4陽性細胞，主要分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，參與細胞免疫調(diào)節(jié)、介導免疫應答以及增強吞噬細胞的抗感染免疫作用。而Th2細胞具有抑制Th1細胞增殖，輔助B細胞活化的作用。3組大鼠Th1、Th2細胞水平的失衡變化在BPD造模組最為顯著，MK組與對照組相比雖有一定程度的免疫失衡，但與BPD組相比則顯著改善。對于相關細胞因子水平的研究發(fā)現(xiàn)，BPD組大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13水平均高于MK組大鼠，對照組大鼠上述指標水平均低于MK組和BPD組大鼠，提示BPD大鼠肺局部的抗炎因子和促炎因子水平均顯著升高，這是體內(nèi)炎癥反應的結果。但是經(jīng)過MK的治療，體內(nèi)的炎癥因子均明顯降低，提示藥物對于Th1、Th2相關的細胞因子具有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，MK具有調(diào)節(jié)BPD大鼠Th1、Th2細胞平衡，降低相關細胞因子水平的作用，但是其具體作用機制仍需要進一步深入研究。