枳椇子黃酮的體外抗氧化活性研究

黃蕭天 鄔雪蓮 巴特 余方利 曾昌桃

摘要?通過70%乙醇提取制得粗黃酮浸膏（黃酮含量為7.75%），且對(duì)粗黃酮浸膏進(jìn)行初步純化得到精制黃酮浸膏（黃酮含量為20.87%），以L-抗壞血酸棕櫚酸酯為陽性對(duì)照，比較2種黃酮清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基能力。結(jié)果表明，當(dāng)濃度在0.05～0.25 mg/mL時(shí)，粗黃酮和精制黃酮對(duì)DPPH自由基清除率高達(dá)90%左右，而L-抗壞血酸棕櫚酸酯清除率最高為77.34%。當(dāng)濃度在0.40～2.00 mg/mL時(shí)，3種樣品溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率從大到小依次為精制黃酮、粗黃酮、L-抗壞血酸棕櫚酸酯。濃度為2.00 mg/mL時(shí)，粗黃酮、精制黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)羥自由基的清除率分別為22.41%、36.03%和33.68%?？傊?，枳椇子黃酮對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基有較強(qiáng)的清除效果和較好的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞?枳椇，黃酮，抗氧化活性，自由基

中圖分類號(hào)?TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）06-0152-04

Abstract?A crude flavonoid extract （flavonoid content of 7.75%） was prepared by 70% ethanol extraction，and crude flavonoid extract preliminary give purified flavonoid extract （flavonoid content of 20.87%），Lascorbyl palmitate was used as a positive control，the scavenging ability of two flavonoids on DPPH free radicals，superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals was compared.When the concentration within 0.05-0.25 mg/mL，the crude flavones and the purified flavones on DPPH free radical clearance rate was as high as 90%，and L-ascorbic acid palmitate clearance rate was as high as 77.34%.When the concentration within 0.40 - 2.00 mg/mL，the size of three kinds of sample solution to the superoxide anion free radical clearance rate was purified flavones>crude flavones>L-ascorbic acid palmitate.When the concentration was 2.00 mg/mL，the crude flavones，purified flavones and L-ascorbic acid palmitate to hydroxyl free radical clearance rate was 22.41%，36.03% and 33.68%，respectively.In short，the flavonoids of Hovenia acerba have strong scavenging effects on DPPH free radicals，superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals，and have good antioxidant activity in vitro.

Key words?Hovenia acerba Lindl.，F(xiàn)lavonoids，Antioxidant activity，F(xiàn)ree radical

枳椇（Hovenia acerba Lindl.），為鼠李科枳椇屬落葉闊葉高大喬木，是園林綠化樹種，其木材可做家具，樹皮、葉、根、果實(shí)、種子均可藥用，有極大的開發(fā)利用價(jià)值[1]。我國枳椇種植面積遼闊，栽培品種多樣，產(chǎn)量大，資源豐富。枳椇鮮果、干果可直接食用，枳椇子有保肝護(hù)肝的藥理作用[2]。枳椇子主要含生物堿、黃酮[3]、皂苷[4]、有機(jī)酸、葡萄糖類等成分，其可以開發(fā)多種功能性食品[5-6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類物質(zhì)具有降低心肌耗氧量、增加冠狀動(dòng)脈和腦血管中血流量、抗心律失常、軟化血管、降低血糖和血脂、解酒護(hù)肝和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能[7-8]，同時(shí)在胃腸道中更發(fā)揮了重要的作用，包括抗氧化、抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種功能活性[9]。枳椇子即枳椇的種子，枳椇子中黃酮類物質(zhì)含量較高，具有良好的抗氧化功能[10]，已有文獻(xiàn)指出，可采用超聲波輔助酶法[11]、超聲波輔助乙醇浸提法[12]、超臨界流體萃取、微波輔助提取、加壓液提取、脈沖電場輔助提取、綠色溶劑提取、蒸汽爆破輔助提取及動(dòng)態(tài)微流化輔助提取[13]等方法對(duì)黃酮進(jìn)行提取，并利用響應(yīng)面法在單因素試驗(yàn)結(jié)果之上再做優(yōu)化試驗(yàn)[12]。枳椇子黃酮含量高，且目前對(duì)枳椇子黃酮體外抗氧化活性的研究報(bào)道較少，所以系統(tǒng)研究枳椇子黃酮清除自由基、減緩衰老的藥理活性具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

枳椇子，購于安國藥材市場，產(chǎn)地湖北，L-抗壞血酸棕櫚酸酯，Amresco公司，二苯苦味?；杂苫―PPH·），Singma公司，蘆丁對(duì)照品、無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、甲醇、三羥基氨基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、水楊酸、FeSO4·7H2O、H2O2等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2?試驗(yàn)儀器

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮儀器廠，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城工貿(mào)有限公司，HWS-12型電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，KQ5200 DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，AR1140型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，UV-1000型紫外可見分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司，1-PHASINDUCITON型粉碎機(jī)，泓荃制藥有限公司，規(guī)格0-100型3支組酒精計(jì)，余姚儀表工廠有限責(zé)任公司。

1.3?枳椇子黃酮的提取與精制工藝流程[14]?見圖1。

1.4?枳椇子黃酮含量測定

1.4.1?蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg，80%乙醇溶解后定容于50 mL容量瓶中，配成濃度為0.40 mg/mL的對(duì)照品溶液，精取上述對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置25 mL比色管中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al（N03）3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加入4%NaOH溶液10.0 mL，用80%乙醇稀釋至刻度，混勻。放置15 min，在500 nm波長處，以相應(yīng)試劑作空白，分別測吸光度[15]，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2?黃酮含量的測定。

分別稱取0.200 g粗黃酮浸膏、精制黃酮浸膏，用80%乙醇溶解后定容于100 mL容量瓶中作為樣品液。取4.0 mL樣品置25 mL比色管中，后續(xù)方法同“1.4.1”。將測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到樣品中黃酮的濃度，再計(jì)算出粗黃酮、精制黃酮浸膏中黃酮的含量。

1.5?枳椇黃酮體外抗氧化活性研究

1.5.1?對(duì)二苯苦味?；杂苫―PPH·）的清除試驗(yàn)。DPPH·清除法是一種篩選自由基清除劑評(píng)價(jià)抗氧化活性的簡便方法。其分析原理是：DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，1個(gè)N原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，其甲醇溶液呈紫色，在517 nm附近有強(qiáng)吸收，當(dāng)DPPH·溶液中加入自由基清除劑時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，顏色由紫色向黃色變化，在517 nm處的吸光度變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈定量關(guān)系，可用清除率（P）表示，P值越大，抗氧化能力越強(qiáng)[16-17]。

樣品溶液的制備及操作步驟如下：精確稱取枳椇子粗黃酮、精制黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯（陽性對(duì)照），均配制成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 5個(gè)濃度的待測液。試驗(yàn)分調(diào)空白、空白組、樣品組、本底組4個(gè)平行組?？瞻捉M是2 mL 70%乙醇加入2 mL 0.1 mg/mL DPPH-甲醇溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min，樣品組是2 mL不同濃度樣品溶液加入2 mL 0.1 mg/mL DPPH-甲醇溶液，反應(yīng)條件同空白組，本底組排除樣品溶液顏色干擾，將2 mL不同濃度樣品溶液中加入2 mL甲醇溶液，反應(yīng)條件與空白組相同，另外用2 mL 70%乙醇和2 mL甲醇的混合溶液作為調(diào)空白。反應(yīng)完成后，在517 nm波長下測吸光度，每組平行3次，根據(jù)公式計(jì)算：

P=Ao-（Ai-Aj）Ao×100%（1）

式中，P為清除率 ，Ao為空白吸光度，Ai為樣品組吸光度，Aj為本底組吸光度。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，繪制枳椇子粗黃酮、枳椇子精制黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)DPPH自由基清除效果的比較曲線。

1.5.2?對(duì)超氧陰離子自由基（O2·-）的清除試驗(yàn)。鄰苯三酚自氧化法是測定清除O2·-活性的常用方法[18-20]，該試驗(yàn)采用此方法。樣品溶液的制備及操作步驟為：精確稱取枳椇子粗黃酮、精制黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯，均配制成0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mg/mL 5個(gè)濃度的待測液。試驗(yàn)分調(diào)空白、空白組、樣品組、本底組?？瞻自嚬苤幸来渭尤?.5 mL 0.05 mol/L Tris-Hcl、0.1 mL 70%乙醇、0.4 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚，混勻后25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，再加入0.1 mL 8 mol/L Hcl終止反應(yīng)，樣品組將空白組中0.1 mL 70%乙醇換成0.1 mL不同濃度樣品溶液，本底組將0.4 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚換成0.4 mL 10 mmol/L Hcl溶液，調(diào)空白組的混合液是將空白組的鄰苯三酚換成超純水，反應(yīng)條件均與空白組相同。反應(yīng)完成后在299 nm波長下測吸光度，每組平行3次，清除率計(jì)算公式見式（1），根據(jù)結(jié)果繪制枳椇子粗黃酮、枳椇子精制黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)超氧陰離子自由基清除效果的比較曲線。

1.5.3?對(duì)羥自由基（·OH）的清除試驗(yàn)。

·OH是一個(gè)具極強(qiáng)氧化能力的基團(tuán)。其半衰期為9～10 s，它可通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，使細(xì)胞壞死或突變，·OH還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬等有關(guān)[21]，所以羥自由基清除率是反映抗氧化功能的重要指標(biāo)。該試驗(yàn)利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生羥自由基，即H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基進(jìn)攻水楊酸分子上的苯環(huán)，產(chǎn)生2，3-二羥基苯甲酸，通過分光光度法可測定其含量，從而來描述羥基的量及待測物質(zhì)清除羥基自由基的能力[22]。再在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉羥自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)。該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收[23]，可用該吸光度來表示羥自由基的含量。

試驗(yàn)分4個(gè)平行組：調(diào)空白、空白組、，樣品組、本底組。室溫下，取1 mL 1 mmol/L水楊酸-乙醇溶液于試管中，依次加入0.1 mL 0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mg/mL 5個(gè)濃度的樣品溶液和1 mL 1 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻，最后加入1 mL新配制的0.01%過氧化氫溶液，在37 ℃下溫浴30 min，在510 nm處測吸光度，重復(fù)3次所測得數(shù)據(jù)取平均為樣品組的吸光度Ai，同理，本底組用1 mL超純水代替1 mL 0.01%過氧化氫溶液，操作方法同上，測得510 nm處的吸光度Aj，空白組以1 mL 70%乙醇溶液取代樣品組的1 mL樣品溶液，操作同上，測得510 nm處的吸光度Ao，調(diào)空白用1 mL超純水代替空白組的1 mL 0.01%過氧化氫溶液，操作方法同上。清除率計(jì)算公式見式（1）。繪制枳椇子粗黃酮、枳椇子精制黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)羥自由基清除效果的比較曲線。

2?結(jié)果與分析

2.1?樣品中黃酮的測定

從圖2可以看出，蘆丁濃度與吸光度的線性關(guān)系良好（R2=0.999 8），線性回歸方程為y=11.518x+0.001 6 。4 mL枳椇子粗黃酮樣品溶液測得的吸光度平均值為A=0.287，4 mL枳椇子精制黃酮樣品溶液測得的吸光度平均值為A=0.771。枳椇子的總重量為20.007 8 g，提取得到的粗黃酮總浸膏重量為1.550 5 g。根據(jù)“1.4.2”方法計(jì)算，粗黃酮浸膏中黃酮的含量為7.75%，精制黃酮浸膏中黃酮的含量為20.87%。

2.2?對(duì)DPPH·的清除作用?從3種樣品溶液對(duì)DPPH·的作用結(jié)果（圖3）可以看出，枳椇子粗黃酮、精制黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)DPPH·均有明顯的清除作用。在溶液濃度為0.05～0.25 mg/mL，隨著樣品濃度的不斷增加，3種樣品溶液對(duì)DPPH·的清除率在不斷增大，并且L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)DPPH·清除率增加的最為明顯，由21.79%上升至77.34%。枳椇子粗黃酮、精制黃酮對(duì)DPPH·的清除率雖然增加但增幅較小，誤差波動(dòng)范圍也較小，但清除率一直在85%～92%，說明在0.05～0.25 mg/mL枳椇子粗黃酮、精制黃酮對(duì)DPPH·就表現(xiàn)出很高的清除率。由此可見，對(duì)DPPH·清除效果枳椇子粗黃酮、精制黃酮好于陽性對(duì)照組L-抗壞血酸棕櫚酸酯，說明枳椇子粗黃酮、精制黃酮對(duì)DPPH·有很強(qiáng)的清除作用，在0.05 mg/mL的濃度時(shí)，清除率達(dá)85%。

2.3?對(duì)超氧陰離子（O2·-）的清除作用?從3種樣品溶液對(duì)O2·-的作用結(jié)果（圖4）可以看出，枳椇子粗黃酮、精制黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)

O2·-均有明顯的清除效果，3種樣品溶液都隨著濃度的增加對(duì)O2·-的清除能力呈線性關(guān)系增強(qiáng)。對(duì)O2·-的清除能力從大到小依次為精制黃酮、粗黃酮、L-抗壞血酸棕櫚酸酯。在樣品溶液濃度0.40～2.00 mg/mL，精制黃酮的清除率呈現(xiàn)開始增長緩慢，中間迅速增長，最后又緩慢增長的趨勢。粗黃酮清除率的變化趨勢是一直緩慢增長，從3.45%增加至10.69%。L-抗壞血酸棕櫚酸酯開始增長緩慢而隨后趨于平穩(wěn)，清除率從1.49%上升至4.90%。從清除曲線來看，在

樣品溶液濃度為0.40～2.00 mg/mL時(shí)，精制黃酮對(duì)O2·-的清除效果最好，最高達(dá)22.89%，但誤差波動(dòng)范圍較大。粗黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)O2·-的清除率一般，最高值分別為10.69%和4.90%，而誤差波動(dòng)范圍較小?？傮w來看，枳椇子精制黃酮對(duì)O2·-的清除效果明顯優(yōu)于粗黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯的清除效果，清除率從大到小依次為枳椇子精制黃酮、粗黃酮、L-抗壞血酸棕櫚酸酯，說明對(duì)O2·-枳椇子粗黃酮、精制黃酮的清除效果比陽性對(duì)照L-抗壞血酸棕櫚酸酯更強(qiáng)。

2.4?對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用

從3種樣品溶液對(duì)·OH的作用結(jié)果（圖5）可以看出，在樣品溶液濃度為0.40～2.00 mg/mL時(shí)，3種樣品溶液清除率都呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系并且清除率與3種樣品溶液濃度呈正相關(guān)。在濃度為0.40～1.60 mg/mL，對(duì)·OH的清除作用從大到小依次為L-抗壞血酸棕櫚酸酯、精制黃酮、粗黃酮，粗黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯清除率的誤差波動(dòng)范圍比精制黃酮小。在濃度為0.80 mg/mL時(shí)，L-抗壞血酸棕櫚酸酯的清除率高達(dá)24.23%，大于枳椇子粗黃酮（9.24%）與精制黃酮（15.25%）的清除率。在濃度為2.00 mg/mL時(shí)，枳椇子精制黃酮的清除率高達(dá)36.03%，而枳椇子粗黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯清除率分別為22.41%和33.68%，但是在同濃度下3種溶液對(duì)·OH的清除率要遠(yuǎn)大于對(duì)O2·-的清除率。在

樣品溶液濃度為1.20～2.00 mg/mL時(shí)，枳椇子粗黃酮與精制黃酮的清除率呈迅速增長趨勢，清除能力越來越強(qiáng)，而L-抗壞血酸棕櫚酸酯清除率雖然也在不斷增長，但變化不大。分析原因，可能是此時(shí)L-抗壞血酸棕櫚酸酯的清除能力已經(jīng)達(dá)到飽和。如果溶液濃度繼續(xù)增大，枳椇子粗黃酮與精制黃酮對(duì)·OH的清除能力可能會(huì)大于L-抗壞血酸棕櫚酸酯。

3?結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出枳椇子黃酮粗提物與精制黃酮浸膏對(duì)DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有較好的清除作用，其濃度的增加與其清除率呈正相關(guān)。

在樣品溶液濃度為0.05～0.25 mg/mL時(shí)，枳椇子粗黃酮、精制黃酮對(duì)DPPH·的清除率高達(dá)90%左右，而L-抗壞血酸棕櫚酸酯的清除率僅為77.34%。在樣品溶液濃度為0.80 mg/mL 時(shí)，L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)羥自由基的清除率為24.23%，大于枳椇子粗黃酮與精制黃酮清除率（分別為9.24%和15.25%），在樣品溶液濃度為2.00 mg/mL時(shí)，枳椇子精制黃酮的清除率高達(dá)36.03%，而枳椇子粗黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯清除率分別為22.41%和33.68%。在樣品溶液濃度為2.00 mg/mL時(shí)，精制黃酮對(duì)超氧陰離子的清除率高達(dá)22.89%，而粗黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯清除率最高分別僅有10.69%和4.90%。對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，同濃度下枳椇子粗黃酮和精制黃酮的清除率要遠(yuǎn)大于L-抗壞血酸棕櫚酸酯，樣品的清除效果優(yōu)于陽性對(duì)照。當(dāng)樣品溶液濃度為0.40～1.60 mg/mL時(shí)，L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)·OH的清除率大于粗黃酮和精制黃酮，當(dāng)濃度達(dá)2.00 mg/mL 時(shí)對(duì)·OH的清除率精制黃酮比粗黃酮和L-抗壞血酸棕櫚酸酯要高。由此可以看出，枳椇子黃酮在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)自由基的清除率高于L-抗壞血酸棕櫚酸酯，具有較高的體外抗氧化活性，所以對(duì)枳椇子黃酮的開發(fā)利用具有很好的前景。

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