一款固體飲料的體外活性及其對(duì)斑馬魚腸道健康改善作用的評(píng)價(jià)

賈福懷 陶剛 涂宏建 晏永球 袁媛 王彩霞

摘要?以藥食同源中藥、益生元、益生菌以及谷、蔬、果、藻粉等為主要原料研發(fā)出一款固體飲料，研究其體外抗氧化活性和改善腸道健康功能作用。通過體外抗氧化試驗(yàn)研究模型，測(cè)定該款固體飲料清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力及對(duì)Fe3+的總還原力，最后通過斑馬魚模型觀察該產(chǎn)品對(duì)斑馬魚腸道健康的改善作用。結(jié)果表明該款固體飲料具有優(yōu)異的還原力、自由基清除作用及抗氧化能力，同時(shí)對(duì)斑馬魚的腸蠕動(dòng)有顯著促進(jìn)作用，有助于改善腸道健康。

關(guān)鍵詞?固體飲料，抗氧化活性，斑馬魚，腸蠕動(dòng)，腸道健康

中圖分類號(hào)?TS275.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）06-0148-04

Abstract?This paper mainly studied the antioxidant activity in vitro and the zebrafish intestinal health protection of the solid beverage，which is developed based on homology of medicine and food，prebiotics，probiotics and grain flour，vegetable powder，fruit powder and algae powder.On the basis of model of antioxidant activity in vitro， we measured the scavenging ability of the solid beverage on DPPH free radical，superoxide anion radical，hydroxyl radical and the total reducing power of Fe3+.Finally，the improvement effect of the product on the intestinal health of zebrafish was observed by zebrafish model.The solid beverage has excellent reducing power，free radicalscavenging capacity and antioxidant capacity，at the same time，it can promote intestinal peristalsis of zebrafish significantly，which is helpful for improving intestinal health.

Key words?Solid beverage，Antioxidant activity，Zebrafish，Intestinal peristalsis，Intestinal health

隨著社會(huì)飛速發(fā)展，人們的生活方式和飲食結(jié)構(gòu)正發(fā)生著巨大的變化[1]，長時(shí)間疲勞，不合理膳食和不規(guī)范生活習(xí)慣等，容易引發(fā)多種慢性疾病及亞健康狀態(tài)，具體表現(xiàn)在胃腸道功能紊亂、胃腸道微生態(tài)失衡，免疫力下降，過氧化損傷等，此時(shí)就涉及到營養(yǎng)干預(yù)、倡導(dǎo)健康的生活方式及飲食規(guī)律，這對(duì)亞健康、慢性病的預(yù)防與治療起到關(guān)鍵性的作用。人體免疫系統(tǒng)完善，則機(jī)體和諧、健康，反之機(jī)體受損，表現(xiàn)為易感染或者易生病狀態(tài)[2]?！懊褚允碁樘臁?，中國傳統(tǒng)文化講究食療、溫補(bǔ)，多種藥食同源中藥以及谷、蔬、果、藻粉等健康食材富含粗多糖、花青素、總黃酮、多酚、VC、VE等抗氧化活性物質(zhì)，能清除人體內(nèi)自由基，起到良好的抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力和保護(hù)器官的作用，同時(shí)能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，調(diào)理腸道健康。

斑馬魚（Zebrafish）是一種常見的熱帶魚，生長在印度、巴基斯坦淡水河流中，物種穩(wěn)定、繁殖周期短、體外受精、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、養(yǎng)殖方便，斑馬魚與人類基因有80%以上的同源性，因此斑馬魚在生物學(xué)中逐漸被用于人類各臟器功能和疾病的研究[3]，是疾病模型建立、毒理學(xué)評(píng)價(jià)和藥物篩選等研究領(lǐng)域的試驗(yàn)動(dòng)物“新星”[4]。胃腸運(yùn)動(dòng)的功能與食物的消化、吸收、胃腸道健康及大便排泄有著密切的關(guān)系[5]。斑馬魚腸道細(xì)胞與人類相似，具有消化液分泌、消化、蠕動(dòng)、吸收等功能，現(xiàn)已成功建立斑馬魚腸動(dòng)力模型。以尼羅紅作為標(biāo)記物，設(shè)置樣品組，陽性多潘立酮對(duì)照組及正常對(duì)照組，通過計(jì)算斑馬魚腸道內(nèi)尼羅紅的熒光強(qiáng)度來評(píng)價(jià)樣品對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用的試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)非常成熟。

該試驗(yàn)通過體外抗氧化模型研究一款固體飲料的抗氧化活性，通過斑馬魚腸動(dòng)力模型，探討該款固體飲料對(duì)斑馬魚腸道健康的保護(hù)作用，以期為進(jìn)一步探討其對(duì)腸道健康的保護(hù)機(jī)制提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行，年齡為受精后5 d，均來自于杭州環(huán)特生物科技股份有限公司。以上斑馬魚均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μs/cm，pH為6.9～7.2，硬度為53.7～71.6 mg/L。試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.2?材料與試劑

試驗(yàn)用固體飲料，淺粉色粉末，寧波御坊堂生物科技有限公司自制，20 ℃陰涼柜保存。用10% DMSO配制成20 mg/mL母液，用養(yǎng)魚用水按需稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用，多潘立酮，白色片劑，購自西安楊森制藥有限公司，用DMSO配制成濃度為10 mg/mL的母液，-20 ℃保存，臨用時(shí)用DMSO按需稀釋。工作液中含1%DMSO，甲基纖維素（AR，Aladdin，中國上海），尼羅紅Nile Red（N3013-100MG，Sigma，美國），無水乙醇、VC、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、鄰苯三酚、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三羥基氨基甲烷、鐵氰化鉀、三氯化鐵、鹽酸（AR，Sinopharm，中國上海），H2O均為雙蒸水。

1.3?儀器與設(shè)備

紫外可見光分光光度計(jì)（TU-1810，PGENERAL，中國），水浴式恒溫?fù)u床（OLB-110X50，OLABO，中國），解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，日本），與顯微鏡相連的相機(jī)（TK-C1481EC），精密電子天平（CP214，OHAUS，美國），熒光顯微鏡（AZ100，NIKON，日本），六孔板（Nest Biotech，中國）。

1.4?試驗(yàn)分組

根據(jù)濃度摸索試驗(yàn)，該款固體飲料在所設(shè)各濃度下均不誘發(fā)斑馬魚死亡，且無明顯毒性表型。因此，確定該款固體飲料對(duì)斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）為2 000 μg/mL。將斑馬魚分為5組，正常對(duì)照組（僅給予尼羅紅）、陽性對(duì)照組（多潘立酮 30 μg/mL）、低劑量組（固體飲料 222 μg/mL，1/9MTC）、中劑量組（固體飲料 667 μg/mL，1/3MTC）、高劑量組（固體飲料 2 000 μg/mL，MTC）。

1.5?試驗(yàn)方法

1.5.1?清除DPPH自由基能力的測(cè)定[6]。取2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，加入1 mL待測(cè)樣品及1 mL H2O混勻，常溫反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定樣品吸光值A(chǔ)i。空白組用H2O代替樣品，其余操作同樣品組，測(cè)得空白組吸光值A(chǔ)0。VC作為陽性對(duì)照，其清除率計(jì)算公式為：

清除率=A0-AiA0×100%

1.5.2?清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定[7]。

取pH為8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，加入4.2 mL H2O，混勻后于25 ℃恒溫水浴中保溫20 min，同時(shí)將樣品和25 mmol/L鄰苯三酚溶液一起放入25 ℃水浴中預(yù)熱。保溫20 min后加入1 mL待測(cè)樣品及0.4 mL鄰苯三酚溶液，迅速混勻后于25 ℃下反應(yīng)5 min，之后加入1 mL 8 mmol/L的HCl終止反應(yīng)，于320 nm處測(cè)得樣品吸光值A(chǔ)i?？瞻捉M用H2O代替樣品，其余操作同樣品組，測(cè)得空白組吸光值A(chǔ)0。VC作陽性對(duì)照，其清除率計(jì)算公式為：

清除率=A0-AiA0×100%

1.5.3?清除羥基自由基能力的測(cè)定[8]。

取10 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、待測(cè)樣品各1 mL，混勻后37 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min，之后加入1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液終止反應(yīng)，于510 nm處測(cè)得樣品吸光值A(chǔ)i?？瞻捉M用H2O代替樣品，其余操作同樣品組，測(cè)得空白組吸光值A(chǔ)0，Ai0為不加H2O2的本底吸光值。VC作為陽性對(duì)照，其清除率計(jì)算公式為：

清除率=Ai-Ai0A0×100%

1.5.4?總還原力的測(cè)定[9]。取2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，2.5 mL1%的K3Fe（CN）6溶液和2 mL待測(cè)樣品，混勻后50 ℃水浴保溫30 min，之后加入2.5 mL H2O和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，于700 nm處測(cè)得樣品吸光值A(chǔ)i。空白組用H2O代替樣品，其余操作同樣品組，測(cè)得空白組吸光值A(chǔ)0。VC作為陽性對(duì)照，其總還原力計(jì)算公式為：

總還原力=Ai-A0

1.5.5?最大耐受濃度（MTC）的測(cè)定。隨機(jī)選取210尾受精后5 d（5 dpf）的野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔（試驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予該款固體飲料 100、250、500、1 000、1 500和2 000 μg/mL濃度（終濃度含1% DMSO），同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（養(yǎng)魚用水處理斑馬魚），每孔（試驗(yàn)組）容量為3 mL。該款固體飲料處理6 h后，觀察記錄斑馬魚的表型和死亡情況，確定該款固體飲料對(duì)斑馬魚的MTC。

1.5.6?對(duì)腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用評(píng)價(jià)。

隨機(jī)選取150尾受精后5 d（5 dpf）的野生型AB品系斑馬魚，水溶給予尼羅紅16 h建立斑馬魚胃腸動(dòng)力促進(jìn)劑篩選模型。尼羅紅移除后，將斑馬魚隨機(jī)分配于六孔板中，每孔（試驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予該款固體飲料222、667和2 000 μg/mL濃度，陽性對(duì)照藥多潘立酮30 μg/mL濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，每孔（試驗(yàn)組）容量為3 mL。該款固體飲料處理24 h后，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，用NIS-Elements D 3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算統(tǒng)計(jì)斑馬魚腸道內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度（S），根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)價(jià)該款固體飲料對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，該款固體飲料對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用計(jì)算公式如下：

腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用=S（正常對(duì)照組）-S（供試品組）S（正常對(duì)照組）×100%

用方差分析和Dunnetts T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表明具有顯著性差異，提供具有代表性的試驗(yàn)圖譜。

2?結(jié)果與分析

2.1?該款固體飲料體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1?清除DPPH自由基能力。

該款固體飲料和VC對(duì)DPPH自由基的清除效果見圖1，由圖可見兩者的清除率與其濃度均表現(xiàn)出明顯的正比關(guān)系。試驗(yàn)范圍內(nèi)測(cè)得該款固體飲料的IC50 值為825.6 μg/mL，VC的IC50值為35.2 μg/mL。結(jié)果表明該款固體飲料對(duì)DPPH自由基的清除效果較好，但低于同濃度下的VC。

2.1.2?清除超氧陰離子自由基能力。

該款固體飲料和VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果見圖2，由圖可見兩者的清除效果均與濃度呈正比。VC的IC50值為858.4 μg/mL，而該款固體飲料的IC50值為3 829.5 μg/mL，表明該款固體飲料對(duì)超氧陰離子自由基有一定的清除能力但其清除效果遠(yuǎn)低于同濃度下的VC。

2.1.3?清除羥基自由基能力。

該款固體飲料和VC對(duì)羥基自由基的清除效果如圖3所示，由圖可見兩者的清除率均與其濃度存在明顯的量效關(guān)系。VC的IC50值為221.6 μg/mL，而該款固體飲料的IC50值為2 358.6 μg/mL，表明該款固體飲料對(duì)羥基自由基具有一定的清除能力但效果低于同濃度下的VC。

2.1.4?總還原力。該款固體飲料和VC對(duì)Fe3+的總還原力結(jié)果如圖4所示，由圖可知，在一定濃度范圍內(nèi)，VC和該款固體飲料的總還原力隨濃度增大而增強(qiáng)，具有明顯的量效關(guān)系，但同濃度下該款固體飲料的總還原力遠(yuǎn)低于VC。

2.2?該款固體飲料對(duì)斑馬魚腸道健康改善作用試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1?最大耐受濃度（MTC）。

該款固體飲料在100～2 000 μg/mL 濃度下，未引起斑馬魚死亡，且未產(chǎn)生任何明顯的毒副作用（表1）。確定該款固體飲料對(duì)斑馬魚的MTC為2 000 μg/mL（此濃度為最大耐受濃度檢測(cè)上限）。

2.2.2?對(duì)腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用。

正常對(duì)照組斑馬魚腸道內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度總和為456 546像素。陽性對(duì)照藥多潘立酮30 μg/mL斑馬魚腸道內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度總和為167 095像素，與正常對(duì)照組比較P<0.001，對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用為63%，說明多潘立酮對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)有促進(jìn)作用。該款固體飲料222、667和2 000 μg/mL濃度組斑馬魚腸道內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度總和分別為209 245、125 427和83 985像素，腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用分別為54%、73%和82%，與正常對(duì)照組比較，222、667和2 000 μg/mL濃度組均P<0.001，表明固體飲料在222、667和2 000 μg/mL濃度條件下均能顯著促進(jìn)斑馬魚腸蠕動(dòng)（表2、圖5～7）。

3?結(jié)論與討論

活性氧能夠引起細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)失控，造成氧化脅迫和氧化損傷[10]，比如說破壞核酸DNA、RNA，修飾氨基酸、使肽鏈斷裂，使酶失活，損害生物膜，導(dǎo)致細(xì)胞衰老和死亡，加速人體老化進(jìn)程等。該款固體飲料采用多種藥食同源中藥以及谷、蔬、果、藻粉制成，其中的主要原料來源于蘋果[11]、甘藍(lán)[12]、西蘭花[13]、苦瓜[14]、荷葉[15]、綠茶[16]、藍(lán)莓[17]等，其富含花青素、總黃酮、多酚、VC、VE等抗氧化活性物質(zhì)，能清除人體內(nèi)自由基，起到良好的抗氧化、抗衰老和保護(hù)器官的作用。該款固體飲料采用的益生元低聚果糖具有潤腸通便、提高腸

道蠕動(dòng)、改善腸道健康的作用[18]。試驗(yàn)通過體外活性評(píng)價(jià)模型試驗(yàn)結(jié)果的分析，總結(jié)出此款固體飲料的體外抗氧化活性低于同濃度的VC，其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基具有較好的清除能力，對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力較弱，對(duì)Fe3+有一定的還原能力。證實(shí)此款固體飲料具有一定的體外抗氧化活性，其活性具有明顯的量效關(guān)系，說明它具有

較好的抗氧化作用。該研究利用野生型AB品系斑馬魚，水溶給予尼羅紅16 h建立起斑馬魚腸動(dòng)力促進(jìn)劑篩選模型，給予不同濃度樣品，設(shè)置陽性對(duì)照及正常對(duì)照組處理24 h，選取斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，計(jì)算斑馬魚腸道內(nèi)尼羅紅的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)價(jià)此款固體飲料對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明此款固體飲料對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)有顯著的促進(jìn)作用，反映出其對(duì)腸道健康具有良好的改善作用。綜上所述，此款固體飲料不僅具有良好的抗氧化作用，有利于延緩機(jī)體的氧化損傷及衰老，而且還具有改善腸道健康狀況的作用。

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