山楂飲片及類黑素對雙歧桿菌和大腸桿菌體外生長的影響

王 云，呂 敏，梁 杰，孫 華，張夢琪，蘭澤倫，萬 軍，周 霞 （.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 6003；.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)重點研究室，成都 60036）

山楂為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂 Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實，焦山楂為其炒制品[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，焦山楂抑菌作用強于生山楂，而某些特定菌群與消化功能密切相關(guān)[2]。而山楂炒焦后產(chǎn)生新的物質(zhì)—類黑素，類黑素是在食品熱處理過程中形成的。目前，類黑素的抗菌活性已得到證實。大多數(shù)類黑素對微生物作用的研究都是在特定的微生物生長培養(yǎng)基中進行的，這些研究表明類黑素可以刺激微生物生長[3]，也可以抑制微生物生長[4-5]。腸道菌群與人體健康密切相關(guān)，藥物和功能食品可能通過調(diào)節(jié)腸道微生物來改善胃腸功能，幫助消化[6-7]。雙歧桿菌和大腸桿菌是典型的有益菌和有害菌，雙歧桿菌常被加入酸奶飲品中幫助消化。乙酸是雙歧桿菌的主要代謝物質(zhì)，隨著乙酸的增多，pH 值降低從而抑制大腸桿菌的生長繁殖。本實驗通過研究山楂，焦山楂以及焦山楂炒制過程中產(chǎn)生的類黑素對大腸桿菌、雙歧桿菌以及其代謝物乙酸的影響，探究“山楂炒焦長于消食導(dǎo)滯”的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

低溫培養(yǎng)箱（美墨爾特有限公司，德國），生物安全柜（賽默飛世爾科技公司，美國），高壓滅菌鍋（三洋公司，日本），純水機（密理博公司，美國），厭氧罐（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，北京）；紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司，上海）；7890B 型氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司，美國）；HP-FFAP 型毛細管柱（貨號：19091F-413，安捷倫科技有限公司，美國）；GM900 型非接觸紅外測溫儀（深圳聚茂源科技有限公司，深圳）。

1.1.2 實驗試劑

MRS 固體培養(yǎng)基、PYG 液體培養(yǎng)基、厭氧產(chǎn)氣袋和厭氧指示劑（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；蛋白胨、酵母粉（英國OXOID 公司）；乙酸（98.85%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，中國）；其余試劑均為分析純。

1.1.3 山楂和實驗菌株

凈山楂飲片（四川同善堂中藥飲片有限責(zé)任公司，批號：180501）；雙歧桿菌（GDMCC1.1258）、大腸桿菌（ATCC25922）（中國科學(xué)院微生物研究所）。

1.2 方法

1.2.1 焦山楂的炮制

參照2015 版《中國藥典》一部山楂項下制備焦山楂。取生山楂150 g，中火（380～420）℃炒制10 min，至藥材表面呈焦黃或焦褐色，內(nèi)部顏色加深，并具有焦香氣味，取出，常溫封存，即得。

1.2.2 生山楂，焦山楂和類黑素浸膏的制備

（1）生山楂和焦山楂浸膏的制備

取生山楂和焦山楂各100 g 進行水浸提，料液比為1：15，浸提8 h，浸提2 次。生山楂和焦山楂浸提液分別在4 ℃下以3 600 r/min 離心10 min，取上層清液各1 000 ml。將500 ml 上層清液進行蒸發(fā)濃縮至膠狀，停止加熱，余溫使其自然干燥，得生山楂浸膏13.75 g，焦山楂浸膏14.02 g。

（2）焦山楂中類黑素的提取

取焦山楂100 g，按照“1.2.2”項中⑴的方法提取得到1 000 ml 上層清液。取500 ml 上層清液蒸發(fā)濃縮得棕褐色濃縮液50 ml，進行大孔樹脂吸附，室溫吸附流速1.5 ml/min，60%乙醇作為洗脫劑，洗脫至色譜柱上無棕色為止，收集洗脫液500 ml。洗脫液蒸發(fā)濃縮至膠狀，停止加熱，余溫使其自然干燥，得焦山楂類黑素浸膏13.12 g。

（3）類黑素的紫外檢測

取類黑素浸膏1 g，蒸餾水溶解定容至100 ml，取10 ml 溶液，分別定容至50 ml；因波長420 nm處是類黑素的特征吸收波長，測其特征吸收下的吸光度值，焦山楂類黑素浸膏吸光度值為0.492，說明焦山楂中類黑素提取成功。

1.2.3 山楂炮制品及類黑素對腸道菌群生長繁殖的影響

（1）雙歧桿菌測試菌菌液的制備

以接種環(huán)自雙歧桿菌標準菌種管挑取菌種，劃線接種至MRS 固體培養(yǎng)基，36 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種至PYG 液體培養(yǎng)基，36 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，以生理鹽水調(diào)整濃度至1.0 麥氏濃度，作為受試菌初始菌液，按10：1 濃度加入試驗體系。

（2）大腸桿菌測試菌液的制備

以接種環(huán)自大腸桿菌標準菌種管挑取菌種，劃線接種至LB 固體培養(yǎng)基（配方：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15 g，加入1 L 蒸餾水，以5 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至7.0，121 ℃高壓滅菌15 min 備用），36 ℃有氧培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基（配方：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，加入1 L 蒸餾水，以5 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至7.0，121 ℃高壓滅菌15 min 備用），36 ℃有氧培養(yǎng)6 h，以生理鹽水調(diào)整濃度至0.5 麥氏濃度，作為受試菌初始菌液，按10：1 濃度加入試驗體系。

（3）樣本藥液的處理

準確稱取生山楂，焦山楂和類黑素浸膏各10 g，加入100 ml 去離子水，超聲振蕩處理，期間手動震搖數(shù)次，直至樣本完全溶解，配制10%母液，并經(jīng)115 ℃高壓滅菌處理15 min 后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）乙酸含量測定

①樣本前處理：將經(jīng)過微生物培養(yǎng)的溶液1 ml，經(jīng)過高速離心機4 000 r/min 離心，之后再過0.2 μm有機相濾頭于進樣瓶，樣品量大于0.5 ml，或者使用內(nèi)插管，上機測定。

②標準溶液及標準曲線：稱取60.05 g 乙酸于100 ml 容量瓶，用一級水定容至刻度，搖勻，作為儲備標準溶液，濃度為101.33 mmol/L。將標準儲備溶液依次稀釋1、3、10、20、100、200 倍得標準工作溶液。

③色譜條件：洗針液為甲醇，進樣量0.5 μl，進樣口溫度240 ℃；壓力6.1219 psi；分流比10：1，流量為1.0 ml；升溫程序：初始溫度：100 ℃，保持0 min；梯度一：以5 ℃/min 升到120 ℃，保持0 min；梯度二：以20 ℃/min 升到200 ℃，保持10 min；總運行時間：18 min；檢測器（FID）溫度：240 ℃；空氣流量：300 ml/min；氫氣流量：33 ml/min；尾吹氮氣流量：20 ml/min；數(shù)據(jù)采集頻率/峰寬：20 Hz/0.01 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0 進行獨立樣本t 檢驗，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（）表示，P＜0.05 認為存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 乙酸標準曲線的建立

乙酸濃度在0.51～101.33 mmol/L 線性關(guān)系良好。以乙酸峰面積（Y）為縱坐標，乙酸含量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=3.670 5X-4.300 8，r=0.999 0，殘留標準誤差為6.644 2，如圖1 所示。

圖 1 乙酸標準曲線

2.2 山楂飲片及類黑素對雙歧桿菌體外生長的影響

生山楂和焦山楂加速生長期雙歧桿菌的生長繁殖，達穩(wěn)定期后，由于生山楂中多種物質(zhì)被分解，菌群產(chǎn)生大量代謝廢物，于衰亡期加速雙歧桿菌的衰亡；由于焦山楂中多種物質(zhì)被分解，菌群產(chǎn)生大量代謝廢物，于衰亡期加速雙歧桿菌的衰亡；但因焦山楂中存在類黑素且其他物質(zhì)較少，衰亡速率慢于生山楂組；類黑素加速生長期雙歧桿菌的生長繁殖，但由于無其他物質(zhì)，其生長速率慢于生山楂組，但在衰亡期中明顯改變雙歧桿菌生長規(guī)律，使生長期延長（生長速率變緩），雙歧桿菌衰亡延后，如圖2。

2.3 山楂飲片及類黑素對大腸桿菌體外生長的影響

生山楂促進大腸桿菌生長期前期的生長繁殖，但由于代謝廢物的逐漸增加，乙酸堆積，使生長速率逐漸變緩；焦山楂促進大腸桿菌生長期前期的生長繁殖，但由于類黑素及代謝廢物的影響使生長期變短，穩(wěn)定期提前；類黑素對大腸桿菌生長期前期無明顯影響，但生長期后期明顯促進大腸桿菌的生長繁殖，如圖3 所示。

圖 2 對雙歧桿菌體外培養(yǎng)乙酸代謝的影響

圖 3 對大腸桿菌體外培養(yǎng)乙酸代謝的影響

3 討論

3.1 焦山楂炮制工藝研究

《中國藥典》一部中對焦山楂炮制方法為：取凈山楂，中火條件下炒至藥材表面焦褐色，內(nèi)部焦黃色，并具有焦香氣味。因無可控工藝參數(shù)，焦山楂炮制過程中易出現(xiàn)飲片表面以及內(nèi)部顏色不均一，山楂炒制成品質(zhì)量不穩(wěn)定等情況。結(jié)合課題組前期實驗，采用分別100、150、200 和250 g 凈山楂為炮制對象，中火條件為（340～380）℃、（380～420）℃和（420～460）℃，炮制時間為8、10、12 和14 min；不同質(zhì)量同一批號的凈山楂在不同的中火條件下炮制不同的時間，采用非接觸式紅外測溫儀檢測炒制溫度，并以炒鍋初溫和山楂藥材炒制末溫輔助控溫。實驗篩選出150 g 凈山楂中火條件（380～420）℃下炒制10 min，可得到質(zhì)量穩(wěn)定，顏色均一的焦山楂。

3.2 焦山楂類黑素提取工藝研究

類黑素的提取方法主要是水浸提法，Borrelli等[8]在90 ℃條件下，采用1：6 料液比，對咖啡中的類黑素進行水提；Langner 等[9]在室溫條件下采用1：12 料液比，水浸提1 h，提取到土豆類黑素粗制品。類黑素成分復(fù)雜，提純困難。目前，主要的純化方法有大孔樹脂、超濾和凝膠層析等方法。何健[10]等發(fā)現(xiàn)X-5 大孔樹脂是曲霉型豆豉類黑素的最佳吸附樹脂。秦禮康等[11]利用S-8 樹脂分離得到豆豉兩個類黑素組分。本實驗在水浸提法的基礎(chǔ)上進行改良，最終獲得最優(yōu)提取工藝。結(jié)果顯示類黑色素在420 nm 處有較強吸收[12]。

3.3 氣相色譜條件的篩選

實驗采用氣相色譜法檢測菌群代謝物乙酸的含量。參照文獻[13-14]，結(jié)果顯示其色譜條件對于本樣品分析效果不佳；在柱溫選擇中，恒溫法對乙酸檢測效果不理想，峰形不穩(wěn)定，因此實驗采取梯度升溫。經(jīng)反復(fù)試驗，最終獲得正文中的檢測參數(shù)，分離效果好，可作為本實驗乙酸檢測條件。