醫(yī)用透明質酸鈉凝膠對腫瘤生長和轉移影響的實驗研究

蔡同凱，楊文勝，曹永兵,3，韓 華，閻 瀾 （.海軍軍醫(yī)大學藥學系，上海 00433；.同濟大學醫(yī)學院，上海0009；3.上海中西醫(yī)結合醫(yī)院脈管病研究所，上海 0008）

透明質酸鈉（圖1）又稱玻璃酸鈉，是由交替的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和葡糖醛酸（GlcA）單元組成[1]的聚合物，聚合度最大的相對分子質量（Mr）可以達到107。具有高度黏彈性、可塑性、滲透性、獨特的流變學特性以及良好的生物相容性等特點[2]。透明質酸鈉廣泛存在于人體，是構成人體細胞間質、眼玻璃體、關節(jié)滑液等結締組織的主要成分，在體內(nèi)具有保水、維持細胞外空間、調節(jié)滲透壓、潤滑、促進細胞修復等重要生理功能[3]。醫(yī)用透明質酸鈉凝膠（HA）為無色透明黏稠液體，主要成分為透明質酸鈉。HA 常用于腫瘤患者術后的抗粘連，其廣泛的生理學活性有可能使得腫瘤細胞易于擴增和轉移，文獻報道內(nèi)源性的透明質酸能促進腫瘤增殖[4-6]。因此，本研究考察外源性HA 是否會促進腫瘤的生長和轉移，以明確HA 是否可用于腫瘤患者的術后防粘連。為HA 用于腫瘤患者腹、盆腔手術術后防粘連提供實驗依據(jù)。

圖 1 透明質酸鈉的結構式

1 儀器和材料

1.1 實驗材料

醫(yī)用透明質酸鈉凝膠（HA，10 mg/ml，上海昊海生物科技股份有限公司，批號：18052122，Mr≥1.0×106），氟尿嘧啶注射液（5-Fu，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：FA1800416），胎牛血清（FBS，Gibco，批 號：1932595），McCoy’s 5A Medium（Gibco，批號：1967679），RPMI Medium 1640（Gibco，批號：1967664），MEM（Minimum Eagle’s Medium，HyClone，批號：AD20532472），胰酶（Trypsin，上海博光生物科技有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，上海博光生物科技有限公司），MTT（上海博光生物科技有限公司），無水甲醇、二甲基亞砜（DMSO，國藥集團化學試劑有限公司），生物膠（批號：217201N2）、小鼠結腸癌細胞（CT26，上海中西醫(yī)結合醫(yī)院），人宮頸癌細胞（Hela）、人結腸癌細胞（HCT116，中國科學院上海生命科學研究院）。

1.2 實驗動物

裸鼠：88 只，上海斯萊克實驗動物有限公司，SPF 級，SCXK（滬）2017-0005；64 只，上海靈暢生物科技有限公司，SPF 級，SCXK（滬）2018-0003），動物飼養(yǎng)于同濟大學滬北校區(qū)（SYXK（滬）2018-0034）。所有動物實驗過程均符合實驗動物倫理學要求。

1.3 實驗儀器

酶標儀1510-00411C（Thermo），坤宏BMB224分析天平（南京伯尼塔科學儀器有限公司），ECLIPSE TE100 顯微鏡（Nikon），細胞培養(yǎng)箱（Thermo）。

2 實驗方法

2.1 MTT 法檢測腫瘤細胞的生長

將狀態(tài)良好的腫瘤細胞用胰酶消化后離心，棄上清液，分別用對應培養(yǎng)液重懸成單個腫瘤細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)，然后分別稀釋成以下濃度：Hela（2×104個/ml），CT26（5×103個/ml），HCT116（104個/ml）。取96 孔板，空白對照孔接入100 μl培養(yǎng)液，其余各孔接入腫瘤細胞混懸液，每孔100 μl，將96 孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后吸棄培養(yǎng)液，空白對照和陰性對照孔分別加入200 μl 培養(yǎng)液，測試孔分別加入100%HA、50%HA+50%培養(yǎng)液、25%HA+75%培養(yǎng)液、12.5%HA+87.5%培養(yǎng)液、6.25%HA+93.75%培養(yǎng)液，每孔200 μl；陽性對照孔分別加入5-Fu 濃度為 16、8、4、2、1 μg/ml 培養(yǎng)液，每孔200 μl，將加藥96 孔板放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別培養(yǎng)3、5 和7 d 后，吸棄上層液體，加入含0.5 mg/ml MTT 的培養(yǎng)液100 μl，培養(yǎng)4 h。避光處吸棄上層液體，每孔加入100 μl DMSO，避光反應10 min，振蕩1 min，在酶標儀波長570 nm處（630 nm 校準）測量各孔的吸光值。細胞存活率=（實驗孔吸光值—空白對照孔吸光值）/（陰性對照孔吸光值—空白對照孔吸光值）×100%。

2.2 Transwell 檢測腫瘤細胞的遷移

將狀態(tài)良好的腫瘤細胞胰酶消化、離心后，分別用對應空白培養(yǎng)液重懸成單個腫瘤細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)，然后分別稀釋成以下濃度：Hela（1.5×105個/ml），HCT116（5×105個/ml）。分別將腫瘤細胞混懸液和HA 混勻，配成50%HA+50%腫瘤細胞懸液、25%HA+50%腫瘤細胞懸液+25%空白培養(yǎng)液、12.5%HA+50%腫瘤細胞懸液+37.5%空白培養(yǎng)液、50%腫瘤細胞懸液+50%空白培養(yǎng)液。將腫瘤細胞和HA 混合液加入Transwell 上層小室中，每個小室200 μl，Transwell 下層腔室分別加入含10% FBS 對應培養(yǎng)液 600 μl。將Transwell 培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，輕輕吸棄小室內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS 洗1 遍，甲醇固定15 min。用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)層細胞，PBS 洗2 遍，加入結晶紫（0.1%）染色，室溫放置20 min，PBS 洗3 遍。顯微鏡10 倍物鏡下觀察、拍照和記數(shù)。

2.3 原位種植瘤法考察裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長

PBS 重懸HCT116 細胞，調濃度至107個/ml，將細胞接種于裸鼠皮下，每只動物0.2 ml，共12 只，作為供瘤體。視腫瘤生長情況將裸鼠處死，取出瘤塊，選取瘤塊實質性部分，用生理鹽水沖洗干凈，剪成約1 mm×1 mm×1 mm 瘤塊備用。

實驗動物腹腔麻醉，取腹部正中切口，逐層開腹，找到盲腸位置。假手術組：將盲腸拉出后放回腹腔，逐層縫合傷口。其余組：輕輕劃破結腸漿膜，用生物膠將瘤塊固定在漿膜破損處。模型組和陽性對照組在瘤塊接種處涂抹生理鹽水0.07 ml，HA 組涂抹HA 0.02 ml。逐層縫合傷口，觀察記錄裸鼠狀態(tài)，5-Fu 組腹腔注5-Fu 20 mg/kg，隔天給藥，持續(xù)3 周。

瘤塊接種4 周后將裸鼠處死，打開腹腔，用游標卡尺測量瘤塊的長短徑，按公式（V=ab2/2，a：瘤體最長直徑；b：瘤體最短直徑）計算體積，剝離瘤塊，瘤塊稱重。

2.4 原位種植瘤法考察裸鼠體內(nèi)腫瘤的轉移

建立裸鼠結腸原位種植結腸癌CT26 模型，方法同“2.3”項。瘤塊接種4 d 后，5-Fu 組腹腔注射氟尿嘧啶注射液50 mg/kg，隔3 d 給藥一次，共4 次。

瘤塊接種3 周后將裸鼠脫頸處死，打開腹腔，觀察腫瘤轉移情況，取肺和肝臟，4%多聚甲醛固定、切片、HE 染色，統(tǒng)計腫瘤轉移率和轉移病灶數(shù)。

2.5 統(tǒng)計方法

3 結果

3.1 HA 體外對腫瘤細胞生長的影響

在體外實驗中，腫瘤細胞Hela、HCT116 和CT26 在100% HA 中均不能生長（圖2）。Hela 細胞在培養(yǎng)3 d 和5 d 時不同含量HA 均不影響細胞的生長，7 d 時25%HA 和50%HA 細胞生長率低于陰性對照組（P＜0.001）。HCT116 細胞培養(yǎng)7 d 時，50%HA 細胞生長率低于陰性對照組（P＜0.01）。CT26 細胞培養(yǎng)3 d 時12.5%HA、25% HA 和50%HA細胞生長率低于陰性對照組（P＜0.001）；培養(yǎng)5 d 和7 d時，50%HA 細胞生長率低于陰性對照組（P＜0.001）。不同濃度5-Fu，培養(yǎng)3 d、5 d 和7 d 均抑制腫瘤細胞Hela、HCT116 和CT26 的生長，呈劑量相關性。

圖 2 MTT 法考察不同濃度HA 體外對腫瘤細胞Hela、CT26 和HCT116 生長的影響

3.2 HA 體外對腫瘤細胞遷移的影響

Transwell 實驗結果顯示，高濃度HA 體外抑制腫瘤細胞遷移。50%HA、25%HA 和12.5%HA 組Hela 細胞穿透數(shù)均低于陰性對照組（P＜0.01），HA 含量越高，Hela 細胞穿透數(shù)越少；50%HA 和12.5%HA 組HCT116 細胞穿透數(shù)均低于陰性對照組（P＜0.05），25%HA 組HCT116 細胞穿透數(shù)低于陰性對照組，無統(tǒng)計學差異（圖3）。

圖 3 Transwell 法考察對腫瘤細胞遷移的影響（100×）

3.3 HA 體內(nèi)對腫瘤細胞生長的影響

裸鼠結腸原位接種HCT116 瘤塊后，HA 組與模型組成瘤率均為100%，結果無差異。模型組裸鼠的瘤體體積達（339.1±258.0）mm3，5-Fu 組裸鼠的瘤 體 體 積 為（128.5±111.9）mm3，小 于 模 型 組（P＜0.01），HA 組裸鼠的瘤體體積為（293.2±190.6）mm3，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義；模型組裸鼠的瘤重為（0.359±0.219）g，5-Fu 組裸鼠的瘤重為（0.149±0.105）g，小于模型組（P＜0.001），HA 組裸鼠的瘤重為（0.330±0.187）g，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義。使用一定劑量的HA 在裸鼠體內(nèi)不影響HCT116 的成瘤率，同時也不影響HCT116 腫瘤的生長（表1）。

3.4 HA 體內(nèi)對腫瘤細胞轉移的影響

裸鼠結腸原位接種CT26 瘤塊，觀察16 d 后出現(xiàn)動物死亡，第18 天處死存活裸鼠。模型組存活率為62.5%，HA 組存活率68.8%，5-Fu 組存活率100%，體內(nèi)使用一定劑量的HA 不影響裸鼠的存活率。模型組肝臟轉移率90%，平均病灶數(shù)（2.2±1.7）；5-Fu 組肝臟轉移率0.0%，低于模型組（P＜0.001）；平均病灶數(shù)（0.0±0.0），低于模型組（P＜0.001）。HA 組肝臟轉移率36.4%，低于模型組（P＜0.05）；平均病灶數(shù)（0.6±1.0），低于模型組（P＜0.01）。模型組肺轉移率為40%，平均病灶數(shù)（0.5±0.7）；5-Fu 肺 轉 移 率6.3%，低 于 模 型 組（P＜0.05）；平均病灶數(shù)（0.1±0.3），低于模型組（P＜0.05）。HA 組肺轉移率為18.2%，平均病灶數(shù)（0.2±0.4），與模型組均無統(tǒng)計學差異，見表2、圖4和圖5。

4 討論

很多胚胎遷移和增殖速率與胚胎組織中高濃度的透明質酸有關，而腫瘤組織和胚胎發(fā)育很相似，幾十年前已經(jīng)提出透明質酸可能對腫瘤生長很重要[7-9]。然而，本研究的HA 為外源性高分子量HA，結果與內(nèi)源性透明質酸結果不一致。在體外實 驗 中，Hela、CT26 和HCT116 的 細 胞 無 法 在100% HA 中生長，表明HA 不能作為腫瘤細胞培養(yǎng)基。此外，細胞生長速率隨著HA 的增加而不同程度的降低，說明高濃度HA 可以抑制腫瘤生長，在低濃度時雖然沒有明顯的抑制作用，但也未促進腫瘤的增殖。體內(nèi)結果證明，外源性HA 對腫瘤細胞的生長無促進作用。

表 1 HA 在裸鼠體內(nèi)對HCT116 腫瘤生長的影響

表 1 HA 在裸鼠體內(nèi)對HCT116 腫瘤生長的影響

**P＜0.01、***P＜0.001，與模型組比較

組別 動物數(shù)（只） 成瘤數(shù)（只） 成瘤率（%） 瘤體積（V/mm3） 瘤重（m/g）假手術組 16 0 0 0.0 ± 0.0 0.000 ± 0.000模型組 16 16 100 339.1 ± 258.0 0.359 ± 0.219 HA組 16 16 100 293.2 ± 190.6 0.330 ± 0.187 5-Fu組 16 14 87.5 128.5 ± 111.9** 0.149 ± 0.105***

表 2 HA 在裸鼠體內(nèi)對CT26 腫瘤轉移的影響

表 2 HA 在裸鼠體內(nèi)對CT26 腫瘤轉移的影響

*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，與模型組比較

肝轉移 肺轉移組別 動物數(shù)（只） 成活率（%）轉移率（%） 病灶數(shù) 轉移率（%） 病灶數(shù)假手術組 15 100.0 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 0.0 ± 0.0模型組 16 62.5 90.0 2.2 ± 1.7 40.0 0.5 ± 0.7 HA 組 16 68.8 36.4* 0.6 ± 1.0** 18.2 0.2 ± 0.4 5-Fu 16 100.0 0.0*** 0.0 ± 0.0*** 6.3* 0.1 ± 0.3*

圖 4 HA 體內(nèi)對CT26 腫瘤細胞肺轉移的影響（40×）

圖 5 HA 體內(nèi)對CT26 腫瘤細胞肝轉移的影響（40×）

內(nèi)源性低分子質量透明質酸（low molecular weight hyaluronan，LMWHA）可誘導細胞運動[10-11]，促進血管生成，增加炎癥免疫刺激和誘導高爾基體應激的能力[12]，從而能促進腫瘤的遷移。而Aikaterini 等[13-14]研究顯示，透明質酸酶2(Hyal-2)低表達同時透明質酸合成酶（HAS1 和HAS2）表達增高，導致產(chǎn)生高分子量透明質酸（high molecular weight hyaluronan，HMWHA）并在HT1080 細胞的周圍基質中沉積蓄積，結果HT1080 細胞遷移能力顯著降低，同時外源性HMWHA 顯著抑制HT1080細胞的遷移，當加入透明質酸酶后，HT1080 細胞運動性顯著增加。外源性透明質酸會促進透明質酸合成酶高表達[15]，促進內(nèi)源性HA 合成作用，使機體合成HMWHA。本研究建立裸鼠原位種植瘤轉移模型，結果HA 組結腸癌的肝轉移率在體內(nèi)低于模型組（P＜0.05）。HA 在體內(nèi)能抑制腫瘤的轉移，可能與外源性HA 能促使機體合成HMWHA 有關。

本研究的主要目的是探討HA 是否會對腹部和盆腔腫瘤患者產(chǎn)生不良影響。結果表明，外源性HA 未見對上述腫瘤的增殖有促進作用，在轉移模型中HA 表現(xiàn)出一定的抑制腫瘤遷移的作用，符合HA 在腫瘤患者中應用的要求,但其機制還需進一步研究。