頭孢拉定微透析體外回收率及影響因素的研究

仰先蜜，許小建，王學(xué)彬，王 卓，王桐生 （.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 300；.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 00433）

微透析（microdialysis，MD）在體取樣新技術(shù)[1-4]逐漸成為藥動學(xué)研究中一種日趨成熟和實用的方法。由于其探針開發(fā)的多樣性和微型化，定位更加準確，并利用極微量（一般若干微升）的透析裝置實現(xiàn)在體、實時、在線取樣和監(jiān)測。能在微創(chuàng)條件下滿足定量、定性、定位、連續(xù)動態(tài)取樣分析等要求，且不破壞生物體內(nèi)環(huán)境對靶器官或組織內(nèi)的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)進行取樣[5-6]，在采用微透析技術(shù)進行體內(nèi)采樣測定前，必須先在體外進行微透析探針增量、減量兩種方法的回收率測定，以摸索出適合體內(nèi)測定時的條件，以確保將微透析樣品測得的濃度準確地折算為采樣部位的組織濃度。

頭孢拉定（cephradine）又稱先鋒霉素Ⅵ、頭孢菌素Ⅵ等，其結(jié)構(gòu)式見圖1，是臨床常用的第一代頭孢菌素。頭孢拉定耐酸，可以口服、吸收好、血藥濃度較高，特點是耐β 內(nèi)酰胺酶，對耐藥性金黃色葡萄球菌及其他多種對廣譜抗生素耐藥的桿菌等有迅速而可靠的殺菌作用，主要以原形經(jīng)尿排泄，尿中濃度較高。臨床主要用于呼吸道、泌尿道、皮膚和軟組織等的感染，如支氣管炎、肺炎、腎盂腎炎、膀胱炎、耳鼻咽喉感染、腸炎及痢疾等，也常用于預(yù)防外科術(shù)后感染[7]。本研究使用微透析技術(shù)與液質(zhì)（LC-MS/MS）這一靈敏度高、檢測速度快、前處理方便的分析方法相結(jié)合，測定頭孢拉定微透析體外回收率，并考察回收率的影響因素，為進一步研究頭孢拉定在前列腺組織、血液雙位點的藥動學(xué)提供可靠依據(jù)。

圖 1 頭孢拉定結(jié)構(gòu)式

1 實驗材料

1.1 儀器

G-6410 型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；DL-180A 型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；AG285 型電子分析天平（Mettler Toledo 儀器上海有限公司）；微透析系統(tǒng)包括四通道微量注射泵，雙通道微量收集器（瑞典CMA 公司）；微透析同心圓探針（瑞典CMA 公司，CMA 20Elite，膜長10 mm）。

1.2 藥品與試劑

乙腈為色譜純（美國Tedia 公司）；頭孢拉定對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度88.4%）；林格溶液（辰欣藥業(yè)股份有限公司）；水為三蒸水（海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院制劑室）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 頭孢拉定定量測定方法學(xué)

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18柱（2.1 mm ×100 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（20：80）；流速：0.2 ml/min；進樣量：1 μl；柱溫：30 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件

ESI+離子源，陽離子MRM 掃描模式，干燥氣體溫度：350 ℃，干燥氣流速：8 L/min，霧化壓力：15 psi，裂解電壓120 V，碰撞能量6 eV，定量離子對為m/z=350.1→176.1。

2.1.3 準分子離子測定

頭孢拉定標準品ESI+模式的掃描圖見圖2，主要組成為 [M+H]＋峰[8]，確定其準分子離子峰為m/z=350.1。

2.1.4 碎片離子掃描

在Product Ion 模式下對碎片離子進行定量分析，如圖3 所示，其中m/z=176.1 的碎片離子響應(yīng)值最高且穩(wěn)定。因此，選擇的監(jiān)測離子為m/z=176.1的碎片離子。

圖 2 頭孢拉定全掃描質(zhì)譜圖

圖 3 頭孢拉定碎片離子掃描質(zhì)譜圖

2.1.5 對照品溶液的配制

精密稱取頭孢拉定對照品適量溶于50 ml 的棕色容量瓶中，加林格溶液超聲溶解使成濃度為50 μg/ml 的對照品儲備液。將此溶液放于4 ℃冰箱中避光保存。

2.1.6 線性關(guān)系考察

吸取適量“2.1.5”項下對照品儲備液，用林格溶液稀釋成系列濃度為20 000、10 000、2 000、500、100、25、10 ng/ml 的頭孢拉定標準品溶液，按上述液質(zhì)條件進樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標（X，ng/ml），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，繪制標準曲線，以加權(quán)平均數(shù)得回歸方程為：Y = 34.096 2X + 150.818 5，r = 0.999，表明頭孢拉定在10～20 000 ng/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為10 ng/ml。

2.1.7 專屬性考察

在本實驗條件下，分別取林格溶液空白樣品、微透析溶液對照品進樣，記錄峰面積。結(jié)果表明林格溶液對頭孢拉定的測定無干擾，如圖4。

圖 4 頭孢拉定的專屬性考察A.空白林格溶液；B.微透析溶液對照品

2.1.8 精密度、準確度考察

同法配置濃度為25、500、10 000 ng/ml 的低、中、高頭孢拉定對照品溶液，同一日平行操作6 次，連續(xù)測定3 d，按《中國藥典》（2015 年版）生物樣品定量分析方法計算日內(nèi)精密度、準確度和日間精密度、準確度。結(jié)果顯示，頭孢拉定對照品連續(xù)進樣6 次，連續(xù)測定3 d，計算結(jié)果見表1，說明方法的精密度、準確度良好。

表 1 頭孢拉定的日內(nèi)和日間精密度、準確度考察結(jié)果(n=6)

2.1.9 穩(wěn)定性考察

用林格溶液配制濃度為10 000、100 ng/ml 的頭孢拉定對照品溶液，分別在0、1、2、4、6、8、12 h進樣測定，將結(jié)果與0 h 進行比較。按《中國藥典》（2015 年版）生物樣品定量分析方法計算所得的低、高濃度在室溫25 ℃和4 ℃的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2，表明頭孢拉定對照品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表 2 頭孢拉定不同溫度穩(wěn)定性考察結(jié)果

表 2 頭孢拉定不同溫度穩(wěn)定性考察結(jié)果

檢測濃度（%）標準濃度（ng/ml）室溫（25 ℃） 低溫（4 ℃）低濃度（100） 101.64±4.24 103.73±6.30高濃度（10 000） 104.29±2.51 103.79±1.73

2.2 頭孢拉定微透析同心圓探針回收率及其影響因素

2.2.1 微透析實驗[9]

減量法：將同心圓探針（膜截留相對分子質(zhì)量2 000）浸入裝有空白林格溶液的200 ml 微透析體外回收率校正實驗反應(yīng)瓶中，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速200 r/min，水浴溫度設(shè)置為（37.0±0.5）℃，用含有一定頭孢拉定濃度（C灌流液）的林格溶液以一定流速進行灌注。平衡0.5 h 后收集一個空白樣品，每種灌流速度下收集 5 份樣品，每份30 μl，且每個流速之間平衡20 min。在所建立的液質(zhì)條件下測定透析液中藥物含量（C透析液）。減量法公式：

增量法：將同心圓探針（膜截留相對分子質(zhì)量2 000）浸入含有一定頭孢拉定濃度（C灌流液）的200 ml微透析體外回收率校正實驗反應(yīng)瓶中，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速200 r/min，水浴溫度設(shè)置為（37.0±0.5）℃。微透析灌流液為一定灌流速度的空白林格溶液，平衡0.5 h 后收集樣品，每更換一次灌流速度后平衡20 min，每種灌流速度下收集5 份樣品，每份30 μl，共收集15 份。在所建立的液質(zhì)條件下測定透析液中藥物含量（C透析液）。增量法公式：

2.2.2 灌流速度對頭孢拉定體外回收率的影響

分別采用增量法、減量法研究流速對探針回收率的影響。以500 ng/ml 的頭孢拉定藥物溶液，灌流速度依次為1.0、2.0、3.0 μl/min 測定，并按公式計算探針回收率，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，灌流速度從1 μl/min 增至3 μl/min 時，隨著流速增加，回收率降低。而且，頭孢拉定濃度為25、10 000 ng/ml的回收率試驗結(jié)果與此相似。

圖 5 不同流速對探針回收率的影響，n=5）

2.2.3 濃度對探針體外回收率的影響

分別用增、減量法研究流速為2 μl/min，頭孢拉定溶液濃度分別為25、500、10 000 ng/ml 時的回收率，結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，當以2 μl/min 的流速進行灌流時，同一探針不同濃度采用單因素方差分析測得的回收率均無顯著性差異（P＞0.05）。表明探針回收率與藥物濃度高低無關(guān)。

圖 6 不同濃度對探針回收率的影響（，n=5）

3 討論

MD 最初可追溯到20 世紀60 年代，當時不同類型的在體取樣技術(shù)首次用于測定藥物、介質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)和代謝組織濃度[10-11]，其原理是利用物質(zhì)的擴散性和半透膜的選擇透過性，探針頭部半透膜位于組織內(nèi)，且導(dǎo)管內(nèi)液體與細胞內(nèi)液體保持平衡，類似一個封閉的無孔毛細血管。這是一項為處在具有明顯界限隔室里的游離型藥物提供連續(xù)信息的微創(chuàng)技術(shù)。例如，成為測量細胞內(nèi)和細胞外靶區(qū)濃度的標準工具。許多綜述文章[12-17]已經(jīng)證實MD 是臨床前和臨床藥學(xué)研發(fā)的有效工具。MD 用于本研究的原理是基于血液-組織屏障的存在，屏障存在對血液濃度的依賴可能誤導(dǎo)靶區(qū)濃度及藥效學(xué)。在多年不斷的研究中，人們發(fā)現(xiàn)血-前列腺屏障（BPB）的存在是影響前列腺炎藥物治療不可忽視的重要因素[18-20]。受采樣和測定技術(shù)的限制，截止目前尚未明確BPB 的具體部位和物質(zhì)基礎(chǔ)，故而很難研究其藥物分布的特點和屏障作用的機制[21-23]。而MD 有望解決前列腺組織特殊的部位和大小對技術(shù)上的高要求。有利于后期動物前列腺實驗的開展。

微透析探針的回收率分為體內(nèi)和體外，校正方法也有體內(nèi)和體外之分。而體內(nèi)校正應(yīng)用反透析法即減量法的前提是探針的回收率與傳遞率近似相等，所以需要進行體外增、減量法的回收率試驗。本實驗結(jié)果可看出，體外回收率與流速成反比，與探針周圍液體濃度無關(guān)，結(jié)果與多數(shù)報道相符[9,24]，由于待測部位的藥物濃度是動態(tài)變化的，說明微透析技術(shù)可以用于體內(nèi)藥物濃度的測定。MD 樣品體積也與灌流速度成正比，在相同時間內(nèi)流速越高體積越大，但是探針回收率也有所降低，這就要求分析方法檢測限更低；而流速越低，透析液濃度越接近組織濃度，但為了收集足量樣品體積用于檢測，同時考慮時間分辨率問題須選擇合適流速。此外，增、減量法所得到頭孢拉定體外回收率結(jié)果相近，說明減量法即反透析法可以用于頭孢拉定的體內(nèi)回收率實驗，并以此為體內(nèi)藥動學(xué)實驗提供參考。