2017-2018年陜西省H7N9禽流感病毒流行特征及基因進(jìn)化分析

史 偉,李 慎,吳 瑞,張俊君,李 俊,高 濤,焦亞東,張 蕾,徐 藝,張少白,余鵬博

2013年長(zhǎng)三角地區(qū)的上海市和安徽省先后報(bào)告H7N9流感病毒引起的人間感染病例，這也是全球首次報(bào)道的人類感染該亞型的流感病毒[1]。截至2017年4月，全球共報(bào)告1 344例人感染H7N9流感確診病例，其中死亡511人[2]。迄今為止，陜西省共報(bào)告7例人感染H7N9流感病例和2起禽間H7N9疫情。其中2017年5月，咸陽市一例重癥肺炎病例在西安被確診為H7N9病例，為陜西省首例H7N9流感病毒導(dǎo)致的人類感染病例[3]，此后又發(fā)現(xiàn)6例人感染病例[4]。

為評(píng)估H7N9流感病毒暴露風(fēng)險(xiǎn)，為防控工作提供科學(xué)依據(jù)，本研究對(duì)2017年5月至2018年3月陜西省H7N9流行分布和基因特性進(jìn)行整理和分析。

1 材料與方法

1.1樣本采集 陜西省在每個(gè)地市均設(shè)有監(jiān)測(cè)點(diǎn)，長(zhǎng)年開展外環(huán)境禽流感病原學(xué)監(jiān)測(cè)任務(wù)[5]。采樣方法參考《職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測(cè)方案(2011版)》[6]的要求，采集禽類糞便、禽類飲水、禽籠具表面擦拭等類型環(huán)境標(biāo)本。

H7N9報(bào)告病例檢測(cè)及禽間疫情暴露環(huán)境監(jiān)測(cè)：按照人感染H7N9禽流感疫情防控方案(第3版)》[7]和《人感染H7N9禽流感病毒標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略》[8]進(jìn)行樣本采集和流行病學(xué)調(diào)查。

1.2病毒檢測(cè)與毒株分離 待檢樣本暫存于4 ℃并于24 h內(nèi)送至當(dāng)?shù)亓鞲芯W(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。核酸提取采用凱杰公司QIAamp Viral RNA Mini Kit (Cat No.52904)提取。所有樣本先開展甲型流感初篩，陽性樣本再進(jìn)行H7亞型檢測(cè)。流感分型試劑由江蘇碩世生產(chǎn)。國(guó)家流感中心對(duì)陽性樣本進(jìn)行復(fù)核和雞胚毒株分離，并對(duì)毒株利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行全基因組測(cè)序；PCR核酸檢測(cè)陽性但未分離出雞胚株的環(huán)境樣本直接進(jìn)行測(cè)序[9]。測(cè)序結(jié)果上傳至中國(guó)流感病毒基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3病毒序列分析 采用MEGA X軟件[10]對(duì)核苷酸推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行位點(diǎn)變異比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)化樹采用Neighboring-joining法進(jìn)行繪制，Bootstrap重復(fù)值為1000。導(dǎo)出結(jié)果用FigTree進(jìn)行美化(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree)。參考毒株的基因序列來自GISAID(Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織數(shù)據(jù)庫(kù))。

2 結(jié) 果

2.12017-2018年外環(huán)境H7N9病原監(jiān)測(cè)情況 2017年5月至2018年3月，陜西省142個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)共采集活禽市場(chǎng)外環(huán)境標(biāo)本2 442份，檢出H7N9陽性標(biāo)本12份，陽性率為4.91‰。

2.2H7N9報(bào)告病例及暴露環(huán)境監(jiān)測(cè)情況 陜西省共發(fā)現(xiàn)H7N9病例7例，其中包括：咸陽[3]和榆林的兩起聚集性病例，以及西安和寶雞報(bào)告的散發(fā)病例。其中5例發(fā)病前有活禽接觸史。

對(duì)所有本地病例暴露環(huán)境進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)：咸陽采集環(huán)境樣本192份，結(jié)果均為陰性；西安采集環(huán)境樣本209份，H7N9陽性樣本11份；寶雞采集各類環(huán)境樣70份，H7N9陽性樣本3份。

另外，根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織報(bào)告，陜西省榆林市[11]和銅川市各發(fā)現(xiàn)1起禽間禽流感疫情。其中榆林市報(bào)告家禽死亡約2.2萬只，銅川市死亡蛋雞810只。具體信息和地理分布情況分別見表1和圖1。

表1 2017年至2018年陜西省H7N9標(biāo)本基本信息及檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Informations and results of specimens from Shaanxi Province from 2017 to 2018

注：*和**為聚集病例

注：圖例中雞/人(紅)代表感染高致病性H7N9，雞/人(黑)代表感染低致病性H7N9；雞頭向右代表樣本來自規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，向左代表樣本來自活禽市場(chǎng)圖1 2017-2018年陜西省H7N9病毒變異株分布情況Fig.1 Distribution of H7N9 virus mutants in Shaanxi Province from 2017 to 2018

2.3陜西省H7N9流感病毒HA和NA核苷酸序列同源性分析 選擇A/Anhui/2013和A/Guangdong/17SF062/2017、H7N9重組疫苗株A/duck/Fujian/S4170/2014為參考株，運(yùn)用MEGA X對(duì)上述14株病毒HA基因和NA基因同源性進(jìn)行分析。陜西省分離的H7N9 HA基因核苷酸的同源性分別為99.17%～99.29%、99.28%～99.89%和96.44%～96.58%；NA基因核苷酸與上述H7N9流感病毒代表株的核苷酸的同源性為99.09%～99.24%、98.51%～98.67%、95.89%～96.27%。

2.4H7N9流感病毒種系進(jìn)化樹分析 寶雞、榆林、西安、銅川分離毒株HA氨基酸發(fā)生插入突變?yōu)镻EVPKRKRTAR↓GLF，咸陽、西安、寶雞為PEIPKGR↓GLF。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)江三角洲地區(qū)是公認(rèn)的原始來源地，珠三角地區(qū)作為H7N9的額外暴發(fā)源[12]。從進(jìn)化上將H7N9分為長(zhǎng)江三角洲分支(Yangtze River Delta)和珠江三角洲分支(Pearl River Delta)，而陜西省分離到的毒株均屬于長(zhǎng)江三角洲分支。陜西省所發(fā)現(xiàn)的H7N9高致病株HA序列與2016年底在廣東最早發(fā)現(xiàn)的高致病株高度同源，見圖2左圖所示。NA遺傳進(jìn)化特點(diǎn)與HA一致，即陜西高致病性H7N9變異株與廣東2016高致病株NA基因高度同源。見圖2右圖所示。

圖2 2017-2018年陜西省H7N9流感病毒HA(左)和NA(右)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees for HA (left)and NA(right) genes of the influenza H7N9 viruses in Shaanxi Province

2.5H7N9陜西株編碼蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 結(jié)合表1信息和所有毒株核酸序列信息，對(duì)H7N9關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)：寶雞、榆林、西安、銅川分離毒株HA氨基酸發(fā)生插入突變?yōu)镻EVPKRKRTAR↓GLF，系高致病性H7N9流感病毒(High Pathogenic，HP)；咸陽、西安、寶雞為PEIPKGR↓GLF，系低致病性H7N9流感病毒(Low Pathogenic，LP)。部分病毒HA蛋白出現(xiàn)Q226L改變，提示這幾株病毒具有結(jié)合人類和禽類的雙受體結(jié)合特性。3株毒株P(guān)B2蛋白分別出現(xiàn)E627V或E627K改變，提示病毒發(fā)生與毒力增強(qiáng)相關(guān)的突變[13-15]。所有毒株P(guān)B1蛋白473V改變，提示在哺乳動(dòng)物中的復(fù)制能力增強(qiáng)[16]；M1蛋白30和215位點(diǎn)均發(fā)生與毒力增強(qiáng)相關(guān)的突變[17]；M2蛋白S31N改變，提示所有毒株對(duì)烷胺類藥物耐藥[18]；NS1蛋白中80-84位點(diǎn)氨基酸未發(fā)生缺失[19]。詳見表2。

表2 2017年至2018年陜西省H7N9標(biāo)本基本信息及檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Information and results of specimens from Shaanxi Province from 2017 to 2018

3 討 論

人感染H7N9流感病毒是2013年首次被發(fā)現(xiàn)[1]，在之后數(shù)年在我國(guó)安徽、上海、浙江、福建、廣東等多省均有報(bào)道[2, 20]。陜西作為內(nèi)陸省份，外環(huán)境一直未監(jiān)測(cè)到[5]。直到2017年5月才報(bào)道首例人感染H7N9病例[3]。據(jù)報(bào)道，陜西省多個(gè)縣區(qū)開展活禽養(yǎng)殖業(yè)務(wù)[21]，人群暴露在病毒環(huán)境下的可能性較高。因此，評(píng)估人群暴露風(fēng)險(xiǎn)、研究本省H7N9禽流感病毒的分子特征至關(guān)重要。

2017年5月至2018年3月，陜西省142個(gè)活禽市場(chǎng)監(jiān)測(cè)點(diǎn)H7N9核酸陽性率為4.91‰，提示陜西省活禽市場(chǎng)整體污染狀況較低。但從H7N9病例追溯其接觸的活禽市場(chǎng)中環(huán)境樣本有病毒檢出，提示從業(yè)人員應(yīng)注意禽流感暴露的風(fēng)險(xiǎn)。

從進(jìn)化來分析陜西14株H7N9流感病毒基因信息。它們與長(zhǎng)三角地區(qū)的H7N9高度同源，但卻又分成低致病性和高致病性兩個(gè)分支，也反映了病毒來源的復(fù)雜性。這可能和兩方面原因有關(guān)：一方面陜西有豐富的自然資源，適宜鳥類的生存與遷徙[22-23]；另一方面，陜西地處交通要道，周邊省份發(fā)現(xiàn)H7N9病例后關(guān)閉活禽市場(chǎng)[24]，病禽很可能流通到本地。

編碼蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)序列分析發(fā)現(xiàn)：H7N9裂解位點(diǎn)的突變導(dǎo)致其對(duì)家禽致病力增強(qiáng)，給活禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅。同時(shí)，HA蛋白Q226L突變?cè)黾恿瞬《緦?duì)人α-2,6唾液酸受體結(jié)合力增強(qiáng)；PB1蛋白473V改變、PB2蛋白E627V/K改變、M1蛋白30D和215A均提示病毒致病力和對(duì)哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性在增強(qiáng)。M蛋白均發(fā)生S31N突變，提醒我們?cè)谂R床診療中選擇針對(duì)性的藥物[25]。

因此，為更好的防控H7N9流感，需要加強(qiáng)人H7N9流感疫情的檢測(cè)并密切關(guān)注病毒變異情況。規(guī)范活禽市場(chǎng)管理，加強(qiáng)禽類H7N9流感病毒的監(jiān)測(cè)和控制。

利益沖突：無

引用本文格式：史偉，李慎，吳瑞，等.2017-2018年陜西省H7N9禽流感病毒流行特征及基因進(jìn)化分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(2)：124-129. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.014