養(yǎng)殖水中重金屬對(duì)斑馬魚的生物富集性試驗(yàn)

伍愛梅，衛(wèi)晉波，2，3，蘇文焯，袁 峰，劉穎云

（1.佛山英拜檢測(cè)科技有限公司，廣東佛山528000；2.佛山市環(huán)境健康與安全評(píng)價(jià)研究中心，廣東佛山528000；3.廣東微生物研究所，廣東廣州510070；4.佛山市禪城區(qū)糧油檢測(cè)中心，廣東佛山528000；5.中山市三鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，廣東中山528463）

養(yǎng)殖水中重金屬對(duì)斑馬魚的生物富集性試驗(yàn)

伍愛梅1，衛(wèi)晉波1，2，3，蘇文焯4，袁 峰4，劉穎云5

（1.佛山英拜檢測(cè)科技有限公司，廣東佛山528000；2.佛山市環(huán)境健康與安全評(píng)價(jià)研究中心，廣東佛山528000；3.廣東微生物研究所，廣東廣州510070；4.佛山市禪城區(qū)糧油檢測(cè)中心，廣東佛山528000；5.中山市三鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，廣東中山528463）

在靜態(tài)的條件下，利用斑馬魚作為受試物，測(cè)試鉈、釩、鎳、銻、硒五種金屬對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)。鉈、釩、鎳、銻、硒五種金屬分別選擇兩個(gè)濃度進(jìn)行生物富集。鉈的濃度是8.0×10-4mg·L-1，8.0×10-3mg·L-1；釩的濃度是2.7×10-2mg·L-1，2.7×10-1mg·L-1；鎳的濃度是6.3×10-2mg·L-1，6.3×10-1mg·L-1；銻的濃度是9.3×10-2mg·L-1，9.3× 10-1mg·L-1；硒的濃度是1.2×10-2mg·L-1，1.2×10-1mg·L-1。在以上的濃度連續(xù)暴露8 d，斑馬魚對(duì)鉈、釩、鎳、銻、硒的生物富集系數(shù)（BCF8d）分別為73.2，75.2，264.5，265.8，1 523.1，1 542.2，234.7，247.7，1 073.0，1 124.9。

重金屬；生物富集；斑馬魚

隨著人類社會(huì)的發(fā)展，工業(yè)和生活廢水的排放，造成的水體污染嚴(yán)重威脅了水生生物的生存環(huán)境，有害物質(zhì)的生物富集作用反過來對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大影響。其中，重金屬作為主要污染物之一，能夠和生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)及各種酶發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使它們失去活性；同時(shí)，由于重金屬很難在環(huán)境中降解，具有很強(qiáng)的生物富集性，隨廢水排出的重金屬，即使?jié)舛群苄。部稍谠孱惡偷啄嘀蟹e累，被魚和貝類體表吸附，產(chǎn)生食物鏈濃縮，進(jìn)而造成公害。

本實(shí)驗(yàn)將對(duì)鉈、釩、鎳、銻、硒五種金屬對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)進(jìn)行測(cè)試。旨在分析比較五種重金屬的慢性富集作用的強(qiáng)弱，為水體、養(yǎng)殖以及食品污染檢提供分析依據(jù)。斑馬魚為常見熱帶魚，體長3-4 cm，身軀玲瓏而纖細(xì)，易于飼養(yǎng)，發(fā)育快速，性成熟期短，繁殖力強(qiáng)，胚胎體外發(fā)育，易于觀察和操作，而且其與人類基因有著87%的高度同源性，作為模式生物的優(yōu)勢(shì)很突出，是研究脊椎動(dòng)物的理想模型，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多數(shù)情況下也適用于人體。斑馬魚的基因和人類很相近，在本試驗(yàn)中，研究重金屬對(duì)斑馬魚的生物富集性，也能很好的反映出重金屬對(duì)人體的生物富集性。由于斑馬魚的基因與人體相近，所以斑馬魚的卵細(xì)胞也被用來進(jìn)行基因變異的研究。通過有害物質(zhì)對(duì)斑馬魚的卵細(xì)胞的影響，觀察斑馬魚的卵細(xì)胞結(jié)構(gòu)，判斷卵細(xì)胞是否產(chǎn)生變異。

1　試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1受試生物

品種：斑馬魚

來源：廣州楊氏水族館

馴養(yǎng)：購買一定量的斑馬魚在相同的試驗(yàn)條件下馴養(yǎng)至少7天，保證自然死亡率小于5%［3］，試驗(yàn)前24小時(shí)停止喂食，急性毒性測(cè)定試驗(yàn)期間不喂食。

規(guī)格：從試驗(yàn)魚中隨機(jī)抽取10尾，試驗(yàn)魚的長度為20.43 mm～28.87 mm，保證重量為0.152 g～0.332 g［3］。

飼養(yǎng)條件：魚的生活環(huán)境就是水，對(duì)于魚來說，水的質(zhì)量直接影響到魚的生存。所以在本試驗(yàn)中，為了得到準(zhǔn)確的半數(shù)致死量的數(shù)據(jù)，嚴(yán)格控制養(yǎng)殖水的質(zhì)量。養(yǎng)殖用水使用經(jīng)過過濾和曝氣的自來水，總硬度為69.88 mg·L-1（以CaCO3計(jì)），pH值為7.80，水溫控制在21.0℃～25.0℃，溶解氧不低于飽和值的60%（即不低于4.95 mg·L-1）。

飼喂使用赤蟲（本次試驗(yàn)飼喂的冷凍赤蟲，必須先在水中解凍之后才能喂食，否則容易導(dǎo)致魚生病死亡），每天一次。

光照每天12小時(shí)（早上10點(diǎn)～晚上10點(diǎn)）。

1.2重金屬供試試劑

偏釩酸銨（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；硝酸鉈（西格瑪奧德里奇中國）；硝酸鎳（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；醋酸銻（西格瑪奧德里奇中國）；四氯化硒（西格瑪奧德里奇中國）；釩標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg· L-1，國家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院）；鉈標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg·L-1，國家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院）；鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg·L-1，國家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院）；銻標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg·L-1，國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg·L-1，環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所）

1.3儀器設(shè)備和試劑

儀器：原子吸收光譜儀（ICE 3500）；雙道原子熒光分光光度計(jì)（AFS 9800）；實(shí)驗(yàn)電熱板（HT-300）；鼓風(fēng)干燥箱（HKG-9055A）；電子天平（BSA 223S）；溶解氧儀（Oxi 3205）。

設(shè)備：鉈空心陰極燈、鎳空心陰極燈、釩空心陰極燈、硒空心陰極燈、銻空心陰極燈、搗碎機(jī)、聚乙烯瓶、5 mL無菌注射器、0.45 μm針孔式濾膜、0.22 μm針孔式濾膜、玻璃魚缸、一般試驗(yàn)室常用的儀器設(shè)備。

試劑：硝酸、高氯酸、硝酸鈀、硝酸鎂、過氧化氫、硼氫化鉀（優(yōu)級(jí)純）、氫氧化鈉、氬氣（純度不低于99.99%）。

檢測(cè)用水：去離子水。

2　重金屬對(duì)斑馬魚的生物富集性試驗(yàn)

2.1方法

根據(jù)斑馬魚急性毒性養(yǎng)殖試驗(yàn)得出的鉈、釩、鎳、銻、硒對(duì)斑馬魚的96h-LC50，分別計(jì)算出鉈、釩、鎳、銻、硒對(duì)斑馬魚的96h-LC50的1/ 100和96h-LC50的1/10兩個(gè)濃度。見表1。

表1　重金屬96h-LC50的1/100和1/10

每一種金屬的2個(gè)濃度各做2個(gè)平行樣品，每一個(gè)平行樣品用量為20 L；同時(shí)各做2個(gè)空白對(duì)照和溶劑對(duì)照的平行樣品。

生物富集試驗(yàn)過程采用半靜態(tài)法，控制養(yǎng)殖水溫度在21℃～25℃，每天早上10點(diǎn)～晚上10點(diǎn)為光照時(shí)間，每一個(gè)魚缸中放50尾試驗(yàn)魚，每隔24 h喂飼一次，每次每個(gè)魚缸約15 g赤蟲，在試驗(yàn)開始后的0 h、24 h、48 h、96 h、144 h、192 h分別測(cè)定水中和魚中重金屬的濃度。每天光照結(jié)束后2小時(shí)換養(yǎng)殖水，每次取養(yǎng)殖水水樣和斑馬魚樣品的時(shí)候都要求在更換試驗(yàn)溶液之前。同時(shí)每次換溶液的時(shí)候都測(cè)定一次更換前、后水中溶解氧、pH值、溫度，保證溶解氧不得低于5 mg·L-1，溫度穩(wěn)定在控制范圍內(nèi)，觀察魚的狀態(tài)。192 h后，魚缸中重金屬的濃度不得低于初始濃度的80%。

數(shù)據(jù)處理：生物富集系數(shù)（BCF）=魚體內(nèi)的重金屬含量（mg·kg-1）/水中重金屬含量（mg·L-1）

2.2重金屬含量測(cè)定條件

金屬鉈、鎳、釩使用石墨爐原子吸收光譜儀測(cè)定，金屬銻、硒使用雙道原子熒光分光光度計(jì)測(cè)定。

鉈測(cè)定條件：檢測(cè)波長為276.79 nm，工作電流5.0 mA，狹縫寬度0.5 nm，基體改進(jìn)劑5 μL（硝酸鈀與硝酸鎂混合溶液，比例為1g·L-1∶0.6 g·L-1）。石墨爐升溫程序見表2。

表2　石墨爐升溫程序

鎳測(cè)定條件：檢測(cè)波長為232.0 nm，工作電流5.0 mA，狹縫寬度0.2 nm，石墨爐升溫程序見表3。

表3　石墨爐升溫程序

釩測(cè)定條件：檢測(cè)波長為318.4 nm，工作電流12.5 mA，狹縫寬度1.0 nm。石墨爐升溫程序見下表（表4）。

表4　石墨爐升溫程序

銻測(cè)定條件：燈電流50 mA，負(fù)高壓280 V，載氣400 mL·min-1，屏蔽氣600 mL·min-1，原子化高度8 nm；硒測(cè)定條件：燈電流80 mA，負(fù)高壓350 V，載氣400 mL·min-1，屏蔽氣800 mL·min-1，原子化高度8 nm。

2.3樣品前處理

2.3.1測(cè)定鉈時(shí)養(yǎng)殖水水樣前處理和斑馬魚樣品前處理

2.3.1.1養(yǎng)殖水水樣前處理

取均勻水樣50 mL置于100 mL燒杯中，加入優(yōu)級(jí)純濃硝酸5 L，蓋上表面皿，在電熱板上加熱，使溶液在燒杯中回流半小時(shí)，打開表面皿，加熱使溶液最后剩下5 mL。取下燒杯，冷卻，用1%的硝酸定容至25 mL，待測(cè)。同時(shí)取相同體積的去離子水，按照水樣的處理操作，做試劑空白樣品。

2.3.1.2斑馬魚樣品前處理

選取5條斑馬魚，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量，記錄。放入搗碎機(jī)搗碎后的樣品全部轉(zhuǎn)移置于250 mL高型燒杯中，加入硝酸—高氯酸（體積比為4：1）20 mL，蓋上表面皿，浸泡過夜。然后放置在電熱板上加熱消解，直至溶液剩下0.5 mL后取下，冷卻，用去離子水轉(zhuǎn)移定容到25 mL容量瓶中，待測(cè)。同時(shí)取5 mL去離子水，按照魚樣品的處理操作，做試劑空白樣品。

2.3.2測(cè)定釩時(shí)養(yǎng)殖水水樣前處理和斑馬魚樣品前處理

2.3.2.1養(yǎng)殖水水樣前處理

取50 mL均勻水樣置于200 mL錐形瓶中，加入5 mL優(yōu)級(jí)純濃硝酸，置于電熱板上加熱煮沸，直至濃縮為1 mL。取下冷卻，轉(zhuǎn)移定容至25 mL容量瓶中，待測(cè)。同時(shí)取相同體積的去離子水，按照水樣的處理操作，做試劑空白樣品。

2.3.2.2斑馬魚樣品前處理

選取5條斑馬魚，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量，記錄。放入搗碎機(jī)搗碎后的樣品全部轉(zhuǎn)移置于250 mL高型燒杯中，加入20 mL硝酸，蓋上表面皿，浸泡過夜。然后放置在電熱板上加熱消解，直至溶液剩下0.5 mL后取下，冷卻，用去離子水轉(zhuǎn)移定容到25 mL容量瓶中，待測(cè)。同時(shí)取5 mL的去離子水，按照魚樣品的處理操作，做試劑空白樣。

2.3.3測(cè)定鎳時(shí)養(yǎng)殖水水樣前處理和斑馬魚樣品前處理

2.3.3.1養(yǎng)殖水水樣前處理

取50 mL均勻水樣置于200 mL錐形瓶中，加入5 mL優(yōu)級(jí)純濃硝酸，置于電熱板上加熱，煮至近干，再加入5 mL高氯酸，繼續(xù)煮至近干。取下冷卻，用1%的硝酸轉(zhuǎn)移定容至25 mL容量瓶中，待測(cè)。同時(shí)取相同體積的去離子水，按照水樣的處理操作，做試劑空白。

2.3.3.2斑馬魚樣品前處理

選取5條斑馬魚，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量，記錄。放入搗碎機(jī)。搗碎后的樣品全部轉(zhuǎn)移置于250 mL高型燒杯中，加入20 mL硝酸，蓋上表面皿，浸泡過夜。然后放置在電熱板上加熱消解，煮至近干后取下，冷卻，用1%的硝酸轉(zhuǎn)移定容到25 mL容量瓶中，待測(cè)。同時(shí)取相5 mL的去離子水，按照魚樣品的處理操作，做試劑空白樣品。

2.3.4測(cè)定銻時(shí)養(yǎng)殖水水樣前處理和斑馬魚樣品前處理

2.3.4.1養(yǎng)殖水水樣前處理

取均勻水樣50 mL置于200 mL燒杯中，加入硝酸—高氯酸混合液（體積比1∶1）5 mL，置于電熱板上加熱至冒白煙，取下，冷卻，加入50%鹽酸溶液5 mL，繼續(xù)加熱直至黃褐色煙霧冒盡，取下，冷卻后定容至50 mL，待測(cè)。同時(shí)取相同體積的去離子水，按照水樣的處理操作，做試劑空白樣品。

2.3.4.2斑馬魚樣品前處理

選取5條斑馬魚，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量，記錄。放入搗碎機(jī)搗碎后的樣品全部轉(zhuǎn)移置于250 mL高型燒杯中，加入硝酸—高氯酸混合液（體積比1∶1）20 mL，蓋上表面皿，浸泡過夜，然后放置在電熱板上加熱，置于電熱板上加熱至冒白煙，取下，冷卻，加入50%鹽酸溶液5 mL，繼續(xù)加熱直至黃褐色煙霧冒盡，取下，冷卻后定容至50 L，待測(cè)。同時(shí)取去離子水5 mL，按照魚樣品的處理操作，做試劑空白樣品。

2.3.5測(cè)定硒時(shí)養(yǎng)殖水水樣前處理和斑馬魚樣品前處理

2.3.5.1養(yǎng)殖水水樣前處理

取均勻水50 mL樣置于200 mL燒杯中，加入硝酸—高氯酸混合液（體積比1∶1）5 mL，置于電熱板上加熱至冒白煙，取下，冷卻，加入50%鹽酸溶液5 mL，繼續(xù)加熱直至黃褐色煙霧冒盡，取下，冷卻后定容至50 mL，待測(cè)。

2.3.5.2斑馬魚樣品前處理

選取5條斑馬魚，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量，記錄。放入搗碎機(jī)。搗碎后的樣品全部轉(zhuǎn)移置于250 mL高型燒杯中，加入硝酸—高氯酸混合液（體積比1∶1）20 mL，蓋上表面皿，浸泡過夜。然后放置在電熱板上加熱，置于電熱板上加熱至冒白煙，取下，冷卻，加入50%鹽酸溶液5 mL，繼續(xù)加熱直至黃褐色煙霧冒盡，取下，冷卻后定容至50 mL，待測(cè)。同時(shí)取去離子水5 mL，按照魚樣品的處理操作，做試劑空白樣品。

2.3.6注意事項(xiàng)

因?yàn)樵诃h(huán)境當(dāng)中也含有重金屬，所以試驗(yàn)時(shí)所使用的玻璃儀器可能受到污染，為了避免污染導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，以上前處理所使用到的玻璃儀器均用5%的硝酸浸泡過夜之后才能使用。

本試驗(yàn)測(cè)定所使用的硼氫化鉀濃度為20 g·L-1（稱取2.5 g氫氧化鈉和10.0 g硼氫化鉀，溶于水，定容至500 mL）；載流液為5%的鹽酸溶液。

2.4鉈、釩、鎳、銻、硒五種金屬加標(biāo)回收的測(cè)定

2.4.1鉈樣品加標(biāo)回收的測(cè)定

2.4.1.1養(yǎng)殖水水樣鉈的加標(biāo)回收測(cè)定

分別移取養(yǎng)殖水50.0 mL于兩個(gè)250 mL燒杯中，分別準(zhǔn)確加入50 μg·L-1鉈標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL、4.0 mL，加去離子水至100 mL，使兩個(gè)樣品的加標(biāo)濃度為4.0×10-3mg·L-1、8.0×10-3mg·L-1。以同樣方法每個(gè)加標(biāo)濃度做3個(gè)平行樣品。前處理同3.3.1.1。

2.4.1.2斑馬魚樣品鉈的加標(biāo)回收測(cè)定

選取5尾斑馬魚，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量，記錄，放置于搗碎機(jī)中搗碎，全部轉(zhuǎn)移至6個(gè)250 mL燒杯中，三個(gè)一組分別準(zhǔn)確加入100 μg·L-1鉈標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL、4.0 mL，使兩組加標(biāo)濃度為8.0×10-3mg·L-1、1.6× 10-2mg·L-1，放置15 min。前處理同3.3.1.2。

2.4.2釩樣品加標(biāo)回收的測(cè)定

2.4.2.1養(yǎng)殖水水樣釩的加標(biāo)回收測(cè)定

分別移取養(yǎng)殖水50.0 mL于兩個(gè)250 mL燒杯中，分別準(zhǔn)確加入20 μg·L-1釩標(biāo)準(zhǔn)溶液3.38 mL、33.75 mL，加去離子水至100 mL，使兩個(gè)樣品的加標(biāo)濃度為2.7×10-3mg·L-1，2.7×10-2mg·L-1。以同樣方法每個(gè)加標(biāo)濃度做3個(gè)平行樣品。前處理同3.3.2.1。

2.4.2.2斑馬魚樣品釩的加標(biāo)回收測(cè)定

選取5尾斑馬魚，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量，記錄，放置于搗碎機(jī)中搗碎，全部轉(zhuǎn)移至6個(gè)250 mL燒杯中，三個(gè)一組分別準(zhǔn)確加入10 μg·L-1釩標(biāo)準(zhǔn)溶液12.5 mL、25.0 mL，使兩組加標(biāo)濃度為5.0×10-3mg·L-1、1.0× 10-2mg·L-1，放置15 min。前處理同3.3.2.2。

2.4.3鎳樣品加標(biāo)回收的測(cè)定

2.4.3.1養(yǎng)殖水水樣鎳的加標(biāo)回收測(cè)定

分別移取養(yǎng)殖水50.0 mL于兩個(gè)250 mL燒杯中，分別準(zhǔn)確加入10 μg·L-1鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液7.50 mL、15.75 mL，加去離子水至100 mL，使兩個(gè)樣品的加標(biāo)濃度為3.0×10-3mg·L-1、6.3×10-3mg·L-1。以同樣方法每個(gè)加標(biāo)濃度做3個(gè)平行樣品。前處理同3.3.3.1。

2.4.3.2斑馬魚樣品鎳的加標(biāo)回收測(cè)定

選取5尾斑馬魚，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量，記錄，放置于搗碎機(jī)中搗碎，全部轉(zhuǎn)移至6個(gè)250 mL燒杯中，三個(gè)一組分別準(zhǔn)確加入10 μg·L-1鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液3.75 mL、5.0 mL，使兩組加標(biāo)濃度為1.5×10-3mg·L-1、2.0× 10-3mg·L-1，放置15 min。前處理同3.3.3.2。

2.4.4銻樣品加標(biāo)回收的測(cè)定

2.4.4.1養(yǎng)殖水水樣銻的加標(biāo)回收測(cè)定

分別移取養(yǎng)殖水50.0 mL于兩個(gè)250 mL燒杯中，分別準(zhǔn)確加入10 μg·L-1銻標(biāo)準(zhǔn)溶液25.0 mL、50.0 mL，加去離子水至100 mL，使兩個(gè)樣品的加標(biāo)濃度為5.0×10-3mg·L-1、1.0×10-2mg·L-1。以同樣方法每個(gè)加標(biāo)濃度做3個(gè)平行樣品。前處理同3.3.4.1。

2.4.4.2斑馬魚樣品銻的加標(biāo)回收測(cè)定

選取5尾斑馬魚，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量，記錄，放置于搗碎機(jī)中搗碎，全部轉(zhuǎn)移至6個(gè)250 mL燒杯中，三個(gè)一組分別準(zhǔn)確加入10 μg·L-1銻標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL、10.0 mL，使兩組加標(biāo)濃度為1.0×10-3mg·L-1、2.0× 10-3mg·L-1，放置15 min。前處理同3.3.4.2。

2.4.5硒樣品加標(biāo)回收的測(cè)定

2.4.5.1養(yǎng)殖水水樣硒的加標(biāo)回收測(cè)定

分別移取養(yǎng)殖水50.0 mL于兩個(gè)250 mL燒杯中，分別準(zhǔn)確加入20 μg·L-1硒標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL，5.0 mL，加去離子水至100 mL，使兩個(gè)樣品加標(biāo)濃度為1.0×10-3mg·L-1，2.0×10-3mg·L-1。以同樣方法每個(gè)加標(biāo)濃度做3個(gè)平行樣品，前處理同3.3.5.1。

2.4.5.2斑馬魚樣品硒的加標(biāo)回收測(cè)定

選取5尾斑馬魚，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量，記錄，放置于搗碎機(jī)中搗碎，全部轉(zhuǎn)移至6個(gè)250 mL燒杯中，三個(gè)一組分別準(zhǔn)確加入20 μg·L-1硒標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 mL、20.0 mL，使兩組加標(biāo)濃度為4.0×10-3mg·L-1、8.0× 10-3mg·L-1，放置15 min。前處理同3.3.5.2。

2.4.6注意事項(xiàng)

進(jìn)行斑馬魚的加標(biāo)過程中，應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)溶液均勻的加在魚體中，不能集中在同一位置上，否則在放置的時(shí)間中，標(biāo)準(zhǔn)溶液極易損失，導(dǎo)致回收率偏低。標(biāo)準(zhǔn)溶液均勻加在魚體中，被魚體吸附，測(cè)定結(jié)果回收率在正常范圍80%～120%之間。

3　結(jié)果

3.1試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.1鉈的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用鉈標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1），用1%硝酸逐步稀釋至100 μg·L-1。分別吸取0 mL，0.25 mL，0.5 mL，1.25 mL，2.0 mL，2.5 mL，5.0 mL置于25 mL容量瓶中，用1%硝酸定容。在鉈的石墨爐原子吸收的條件下測(cè)定，以濃度為x軸，吸光度為y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 35x+9.850 25，相關(guān)系數(shù)為R= 0.998 0，如圖1。

圖1　鉈的標(biāo)準(zhǔn)曲線　

3.1.2釩的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用釩標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1），用1%硝酸逐步稀釋至100 μg·L-1。分別吸取0 mL，0.25 mL，0.5 mL，1.25 mL，2.5 mL，5.0 mL，7.5 mL置于25 mL容量瓶中，用1%硝酸定容。在釩的石墨爐原子吸收的條件下測(cè)定，以濃度為x軸，吸光度為y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.002 44x+0.263 834，相關(guān)系數(shù)為R= 0.997 0。如圖2

圖2　釩的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.3鎳的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用鎳標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1），用1%硝酸逐步稀釋至100 μg·L-1。分別吸取0 mL，0.10 mL，0.25 mL，0.50 mL，1.25 mL，2.0 mL，2.5 mL置于25 mL容量瓶中，用1%硝酸定容。在鎳的石墨爐原子吸收的條件下測(cè)定，以濃度為x軸，吸光度為y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.003 9x+0.318 431，相關(guān)系數(shù)為R= 0.996 5。如圖3。

3.1.4銻的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用銻標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1），用5%鹽酸逐步稀釋至10 μg·L-1。分別吸取0 mL，0.5 mL，1.0 mL，2.5 mL，5.0 mL，10.0 mL，25.0 mL，40.0 mL，50.0 mL、置于50 mL容量瓶中，用5%鹽酸定容。在銻的原子熒光的條件下測(cè)定，以濃度為x軸，吸光度為y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=86.580x+5.004 91，相關(guān)系數(shù)為R=0.999 0。如圖4。

圖3　鎳的標(biāo)準(zhǔn)曲線　

圖4　銻的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.5硒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用硒標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1），用5%鹽酸逐步稀釋至100 μg·L-1。分別吸取0 mL，0.5 mL，1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL置于50 mL容量瓶中，用5%鹽酸定容。在硒的原子熒光的條件下測(cè)定，以濃度為x軸，吸光度為y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=87.438x+2.394 39，相關(guān)系數(shù)為R=0.999 9。如圖5。

圖5　硒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.6備注

鉈、釩、鎳標(biāo)準(zhǔn)曲線使用石墨爐原子吸收測(cè)定，相關(guān)系數(shù)R值要求≥0.995；銻、硒標(biāo)準(zhǔn)曲線使用原子熒光測(cè)定，相關(guān)系數(shù)R值要求≥0.999。

3.2試驗(yàn)的加標(biāo)回收

在空白的養(yǎng)殖水水樣中和斑馬魚中，按照4.4分別添加鉈、釩、鎳、銻、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照4.2儀器條測(cè)定，計(jì)算回收率。

鉈在養(yǎng)殖水水樣中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為90.2%～98.2%，在斑馬魚中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為89.5%～94.2%；釩在養(yǎng)殖水水樣中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為90.5%～110.6%，在斑馬魚中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為90.3%～97.2%；鎳在養(yǎng)殖水水樣中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為95.2%～105.2%，在斑馬魚中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為92.4%～103.2%；銻在養(yǎng)殖水水樣中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為96.3%～104.7%，在斑馬魚中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為92.9%～99.2%；硒在養(yǎng)殖水水樣中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為94.3%～102.5%，在斑馬魚中2個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率為90.9%～97.1%。

3.3生物富集系數(shù)的結(jié)果

鉈、釩、鎳、銻、硒生物富集試驗(yàn)結(jié)果見表5至表9。鉈在兩個(gè)富集濃度中對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為73.2，75.2；釩在兩個(gè)富集濃度中對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為264.5，265.8；鎳在兩個(gè)富集濃度中對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為1 523.1，1 542.2；銻在兩個(gè)富集濃度中對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為234.7，247.7；硒在兩個(gè)富集濃度中對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為1 073.0，1 124.9。

每組濃度的試驗(yàn)水中結(jié)束濃度都大于初始濃度的80%，符合“評(píng)價(jià)準(zhǔn)則”的要求。在試驗(yàn)的過程中，斑馬魚的死亡率為0%，空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組都沒有檢測(cè)出目標(biāo)金屬元素（鉈、釩、鎳、銻、硒）。

表5　鉈的生物富集試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表6　釩的生物富集試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表7　鎳的生物富集試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表8　銻的生物富集試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表9　硒的生物富集試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

4　討論與總結(jié)

4.1討論

本試驗(yàn)過程中，存在其他因素可能導(dǎo)致斑馬魚的死亡，影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。例如，在試驗(yàn)過程中，配制試驗(yàn)養(yǎng)殖水的時(shí)所使用的酸可能導(dǎo)致斑馬魚的死亡（在配制鉈、釩、鎳的試驗(yàn)養(yǎng)殖水時(shí)使用了硝酸；在配制銻、硒試驗(yàn)養(yǎng)殖水時(shí)使用了鹽酸）。為了排除硝酸和鹽酸導(dǎo)致斑馬魚死亡，需要設(shè)置硝酸溶劑對(duì)照組和鹽酸溶劑對(duì)照組。

試驗(yàn)過程中，養(yǎng)殖水的pH值變化范圍是7.20～7.54；溫度變化范圍是22.3～24.2℃；鉈試驗(yàn)時(shí)溶解氧的變化范圍是72%～92%；釩試驗(yàn)時(shí)溶解氧的變化范圍是68%～92%；鎳試驗(yàn)時(shí)溶解氧的變化范圍是66%～92%；銻試驗(yàn)時(shí)溶解氧的變化范圍是64%～92%；硒試驗(yàn)時(shí)溶解氧的變化范圍是68%～92%。192 h后，魚缸中重金屬的濃度均不低于初始濃度的80%。

在硝酸溶劑對(duì)照組和鹽酸對(duì)照組中，斑馬魚的死亡率為0%，可以排硝酸及鹽酸對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

生物富集試驗(yàn)兩個(gè)富集濃度下鉈對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為73.2、75.2；釩對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為264.5、265.8；鎳對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為1 523.1、1 542.2；銻對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為247.7、234.7；硒對(duì)斑馬魚的生物富集系數(shù)分別為1 073.0、1 124.9。

4.2總結(jié)

在生物富集性試驗(yàn)中，鎳的生物富集系數(shù)最大，富集最強(qiáng)，其次是硒、釩、銻、鉈。

對(duì)于生物富集強(qiáng)的金屬元素應(yīng)該關(guān)注其在養(yǎng)殖物體內(nèi)的富集程度，除在養(yǎng)殖期要注意觀察養(yǎng)殖水的質(zhì)量外，更應(yīng)該重視養(yǎng)殖物在銷售流通環(huán)節(jié)的抽樣檢測(cè)，避免外觀正常但體內(nèi)已富集一定程序有毒有害物質(zhì)的養(yǎng)殖物進(jìn)入餐飲環(huán)節(jié)，危害消費(fèi)者的健康。同時(shí)，我們?cè)谄綍r(shí)生活中，也應(yīng)多加留意有害物質(zhì)在身體上的富集，避免有毒有害物質(zhì)富集后產(chǎn)生不可治療的后果。

［1］OECD.Guidelines for the testingofchemicals，NO.203 fish acute toxicitytest［S］.Paris：OECD，1992：1-10.

［2］國家環(huán)境保護(hù)總局，化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則［M］.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2004：203.

［3］GB/T31270.12-2014化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則第12部分：魚類急性毒性試驗(yàn)［S］.24-25.

［4］GB-T21858-2008化學(xué)品生物富集半靜態(tài)式魚類試驗(yàn)［S］.1-19.

［5］楊瀚凌，劉娟，王津，陳永亨，吳穎娟，王春霖.生物體對(duì)鉈富集作用的研究進(jìn)展［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：地球科學(xué)版，2015 （S1）：1503-1518.

［6］FISHER J A，TANGUAY R L.Bio-compatibilityofsilver nanomaterials using the embryonic zebrafish bioassay［J］.Nanotech，2013（3）：457-460.

［7］DINGGH，ZHANGJ，CHENYH，et al.Acute ToxicityEffect ofPFOSon Zebrafish Embryo［J］.Advanced Materials Research，2011，356-360：603-606.

【責(zé)任編輯：鄧軍文dengjunwen69@126.com】

A study of biological enrichment of heavy metals to zebra fish with cultured water

WUAi-mei1，WEI Jin-bo1，2，3，SUWen-zhuo4，YUANFeng4，LIUYing-yun5

（1.Foshan En-biodetection technologyCo.，ltd，528000，China；2.Foshan Center for environmental health and safetyassessment 528000，China；3.TestingCenter ofFood and Oil ofFoshan ChanchengDistrict，F(xiàn)oshan 528000，China；4.Guangdonginstitute of microbiology510070，China；5.Animal husbandryand veterinarystation ofSanxiangTower，Zhongshan 528463，China）

This paper discusses the biological enrichment factors of five heavy metals，thallium，vanadium，nickel，antimony and selenium，to zebra fish with cultured water in static condition.Two different concentrations of five metals were chosen to carry out the biological enrichment.The concentrations of thallium was 8.0×10-4mg·L-1，8.0×10-3mg·L-1，as vanadiumwas 2.7×10-2mg·L-1，2.7×10-1mg·L-1，nickel was 6.3×10-2mg·L-1，6.3×10-1mg·L-1，antimony was 9.3×10-2mg·L-1，9.3×10-1mg·L-1，selenium was 1.2×10-2mg·L-1，1.2×10-1mg·L-1. Living exposure continuously in the concentrations above for 8 days，the coefficient of biological enrichment （BCF8d）tozebra fish were 73.2，75.2，264.5，265.8，1 523.1，1 542.2，234.7，247.7，1 073.0，1 124.9.

heavymetals；biological enrichment；zebra fish

S65

A

1008-0171（2016）04-0085-09

2016-05-20

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A040401002）；佛山高新區(qū)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目；佛山市高校和醫(yī)院科研基礎(chǔ)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（2014AG10007）廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B010600001）；國家發(fā)改委項(xiàng)目

伍愛梅（1990-），女，廣東廣州人，佛山英拜檢測(cè)科技有限公司助理工程師。