姜黃素通過激活SIRT1調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠模型的認(rèn)知功能障礙研究*

曹 佳，楊華英，何 藝，程建紅

四川省自貢市婦幼保健院兒科（自貢643010）

膿毒癥是一種由宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的全身炎癥。膿毒癥及其并發(fā)癥是ICU 患者的主要死亡原因，病死率高達(dá)30%～70%［1］。已經(jīng)證明，膿毒癥幸存者表現(xiàn)出長期的認(rèn)知障礙，包括記憶力、注意力和整體認(rèn)知功能喪失。而膿毒癥繼發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙可發(fā)生在70%的膿毒癥患者中［2］。膿毒癥增加了神經(jīng)退行性疾病和癡呆的風(fēng)險，給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了巨大負(fù)擔(dān)。因此，必須探索新藥物來遏制患者的膿毒癥。姜黃素（Curcumin，Cur）是從姜科植物姜黃中提取的一種酚類化合物，分子式為C21H20O6，分子質(zhì)量368.39，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用［3］。已有研究表明，姜黃素對膿毒癥引起的大鼠急性肺損傷有保護(hù)作用［4］，但是其對膿毒癥小鼠模型的認(rèn)知功能障礙是否有影響尚不清楚。已有報道，姜黃素對創(chuàng)傷性腦損傷模型提供神經(jīng)保護(hù)作用［5］，預(yù)測姜黃素對膿毒癥小鼠模型的認(rèn)知功能障礙具有改善作用。本文通過盲腸結(jié)扎穿刺（Cecal ligation and puncture，CLP）法制作膿毒癥小鼠模型，探討姜黃素對膿毒癥小鼠模型的認(rèn)知功能障礙的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 材 料

1.1 動物：200 只3個月體重（25±3）g無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）級的雄性美國癌癥研究所（Institute of cancer researcch，ICR）小鼠，許可證號：SYXK（川）2017-203。實驗動物飼養(yǎng)室溫度控制在（21±2）℃、濕度控制在（55±2）%，光照／黑暗周期為12 h，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 試劑：姜黃素（HLPC≥99%），SIRT1 抑制劑EX-527，蘇木素伊紅（Hematoxylin eosin，HE）染色試劑、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒，RIPA 裂解緩沖液，BCA 試劑盒，IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒，SIRT1、Ac-NF-κB，Ac-FOXO1和Acp53抗體。

1.3 儀器：Mu LTI-SKAN GO 型全自動酶標(biāo)儀，F(xiàn)luorChem HD2 凝膠成像系統(tǒng)，視頻跟蹤系統(tǒng)XRXZ301，美國碧迪流式細(xì)胞儀FACS。

2 實驗方法

2.1 模型構(gòu)建及處理：先將120只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素中劑量組、姜黃素高劑量組、地塞米松組，每組20只。再將80只小鼠隨機(jī)分為模型組、姜黃素高劑量組、SIRT1 抑制劑組、高劑量+抑制劑組，每組20只。

盲腸結(jié)扎穿刺（Cecal ligation and puncture，CLP）誘導(dǎo)膿毒癥［6］。通過腹膜內(nèi)注射15 mg／kg氯胺酮和7.5 mg／kg甲苯噻嗪麻醉實驗小鼠。用碘伏消毒后，在腹部中線進(jìn)行2 cm 切口，露出盲腸。將糞便拖至盲腸用5／0丙烯線結(jié)扎并固定在回盲部連接桿下方，但不能引起腸梗阻。用18號針頭將盲腸穿刺10次并稍微擠壓直至出現(xiàn)一小滴糞便。將盲腸重新放于腹腔，縫合傷口。假手術(shù)動物接受了相同的剖腹手術(shù)，但沒有盲腸穿刺，并作為對照組。手術(shù)后不久，所有動物皮下注射2 ml，0.9%氯化鈉溶液。

在造模前12 h 及造模后2 h和12 h，姜黃素給藥各組小鼠，分別腹腔注射50 mg／kg、100 mg／kg、200 mg／kg姜黃素（實驗當(dāng)天溶于質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%的二甲基亞砜）［7］；假手術(shù)和模型組小鼠注射等量二甲基亞砜；地塞米松組小鼠腹腔注射1 mg／kg 地塞米松［8］；SIRT1 抑 制 劑 組 小 鼠 腹 膜 內(nèi) 注 射5 mg／kg，EX527［9］；高劑量+抑制劑組小鼠腹腔注射200 mg／kg姜黃素和5 mg／kg，EX527。每天檢測小鼠存活情況，連續(xù)1周，進(jìn)行生存分析。

2.2 曠場實驗：將大鼠單獨(dú)放置在長×寬×深（100 cm×100 cm×50 cm）的箱子中，使用視頻跟蹤系統(tǒng)XR-XZ301進(jìn)行5 min內(nèi)大鼠總行駛距離（m），站立次數(shù)，梳理毛發(fā)次數(shù)。在每個小鼠測試階段后，均使用70%的酒精徹底清潔設(shè)備。

2.3 莫里斯水迷宮：Morris水迷宮裝置由高60 cm、直徑150 cm 的黑色圓形池組成，分為4個視覺象限，加（24±2）℃滿水。將直徑10 cm 的圓形平臺放置在第三象限的中心，水面下方2 cm 處。連續(xù)4 d，將大鼠放入面向墻壁的池中，每只大鼠依次從4個象限進(jìn)入，并以相同的順序進(jìn)入水里。在60 s內(nèi)未能找到平臺的大鼠被引導(dǎo)并允許在平臺上停留10 s。將大鼠用于尋找平臺的時間記錄為潛伏期。在第5天，在沒有平臺的情況下，記錄了在目標(biāo)象限中花費(fèi)的時間以及小鼠越過目標(biāo)象限的次數(shù)。

2.4 HE 染色：麻醉后處死大鼠，分離出腦海馬區(qū)組織，將腦海馬區(qū)組織用4%多聚甲醛溶液固定后，常規(guī)脫水制成石蠟切片，然后脫蠟、蘇木精液染色、1%鹽酸酒精分化、0.6%氨水返藍(lán)、0.5%伊紅液染色，接著常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在200倍顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷情況。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)：將海馬區(qū)組織裂解并用4℃生理鹽水迅速制成1∶9勻漿液，加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μLPI，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）／全部細(xì)胞×100%。

2.6 Elisa實驗：將海馬區(qū)組織用4℃生理鹽水迅速制成1∶9勻漿液，3 000 r／min 離心15 min，取上清液按照ELISA 試劑盒說明書操作檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

2.7 氧化應(yīng)激分析：根據(jù)所提供的試劑盒手冊，海馬組織中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及抗氧化酶過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性來分析海馬組織氧化應(yīng)激情況。

2.8 蛋白印跡法：提取海馬組織中總蛋白，采用BCA 蛋白檢測試劑盒進(jìn)行定量。將25μg蛋白質(zhì)樣品用12%SDS 凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，用5%牛血清白蛋白封閉過夜后，用兔抗大鼠單克隆抗體（SIRT1 1∶1000、Ac-NF-κB 1∶500，Ac-FOXO1 1∶1000和Ac-p53 1∶1000），4℃搖床上2 h，然后與山羊抗兔二抗（1∶2000）在4℃的搖床上搖1 h，ECL曝光，以β-actin為內(nèi)參，使用Quantity One軟件進(jìn)行分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0處理，圖形使用Grap HPad Prism 6.0 構(gòu)建的。實驗數(shù)據(jù)以（ˉx±s）表示，數(shù)據(jù)經(jīng)shapiro-wilk檢驗發(fā)現(xiàn)均呈正態(tài)分布，多組進(jìn)行One-Way ANOVA 分析發(fā)現(xiàn)方差齊，組間比較采用SNK 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 姜黃素增強(qiáng)膿毒癥小鼠生存 1周后，假手術(shù)組小鼠無死亡，模型組小鼠死亡7只，姜黃素低劑量組小鼠死亡4只，姜黃素中劑量組小鼠死亡3只，姜黃素高劑量組小鼠死亡1只，地塞米松組小鼠死亡2只。與模型組相比，姜黃素高劑量組和地塞米松組小鼠存活率明顯升高（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組小鼠存活率

2 姜黃素改善膿毒癥小鼠認(rèn)知障礙 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠總行駛距離、站立次數(shù)和梳理毛發(fā)次數(shù)及在目標(biāo)象限時間和穿越區(qū)域的次數(shù)明顯減少（P＜0.01），潛伏期時間明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素低劑量組無明顯變化，姜黃素中、高劑量組和地塞米松組小鼠總行駛距離、站立次數(shù)和梳理毛發(fā)次數(shù)及在目標(biāo)象限時間和穿越區(qū)域的次數(shù)明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），潛伏期時間明顯減少（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠認(rèn)知障礙情況

3 姜黃素改善膿毒癥小鼠腦損傷 假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，細(xì)胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞核清晰；模型組神經(jīng)細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮，存在嚴(yán)重的炎癥因子浸潤；與模型組相比，姜黃素中、高劑量組和地塞米松組大鼠神經(jīng)細(xì)胞體積變小、細(xì)胞核皺縮和炎癥因子浸潤情況均有不同程度減輕。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素低劑量組無明顯變化，姜黃素中、高劑量組和地塞米松組小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯減少（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組小鼠腦損傷情況

4 姜黃素改善膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激與假手術(shù)組相比，模型組小鼠海馬組織中IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA 含量均明顯增加（P＜0.01），SOD 和CAT 活性明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素低劑量組無明顯變化，姜黃素中、高劑量組和地塞米松組小鼠海馬組織中IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA 含量均明顯減少（P＜0.05），SOD 和CAT 活性明顯升高（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組小鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激情況

5 姜黃素增加膿毒癥小鼠腦組織中SIRT1的表達(dá)并降低了Ac-FOXO1、Ac-NF-κB和Ac-p53水平與假手術(shù)組相比，模型組小鼠海馬組織中SIRT1表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），Ac-FOXO1、Ac-NF-κB 和Acp53表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素低劑量組無明顯變化，姜黃素中、高劑量組和地塞米松組海馬組織中SIRT1 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），Ac-FOXO1、Ac-NF-κB和Ac-p53表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）（圖5）。

圖5 蛋白印跡法檢測小鼠海馬組織中SIRT1、Ac-FOXO1、Ac-NF-κB和Ac-p53表達(dá)

6 姜黃素通過激活SIRT1改善膿毒癥小鼠模型的認(rèn)知功能障礙 與模型組相比，SIRT1抑制劑組膿毒癥小鼠存活率無明顯變化，膿毒癥小鼠總行駛距離、站立次數(shù)和梳理毛發(fā)次數(shù)及在目標(biāo)象限時間和穿越區(qū)域的次數(shù)明顯減少（P＜0.05），潛伏期時間明顯增加（P＜0.05），神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），海馬組織中IL-6、TNF-α、IL-1β和MDA 含量均明顯增加（P＜0.05），海馬組織中SOD 和CAT 活性明顯減少（P＜0.05），海馬組織中SIRT1表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05），海馬組織中Ac-FOXO1、Ac-NF-κB 和Ac-p53表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P＜0.05）；與姜黃素高劑量組相比，高劑量+抑制劑組膿毒癥小鼠存活率無明顯變化，膿毒癥小鼠總行駛距離、站立次數(shù)和梳理毛發(fā)次數(shù)及在目標(biāo)象限時間和穿越區(qū)域的次數(shù)明顯減少（P＜0.01），潛伏期時間明顯增加（P＜0.01），神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01），海馬組織中IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA 含量均明顯增加（P＜0.01），海馬組織中SOD 和CAT 活性明顯減少（P＜0.01），海馬組織中SIRT1表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01），海馬組織中Ac-FOXO1、Ac-NF-κB和Ac-p53表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖6、7）。

圖6 激活SIRT1改善膿毒癥小鼠模型的認(rèn)知障礙的影響

圖7 激活SIRT1改善膿毒癥小鼠模型的腦損傷、氧化應(yīng)激和炎癥的影響

討 論

膿毒癥是一種常見且可能致命的全身性疾病，常常導(dǎo)致不可控制的炎癥、組織損傷和多器官功能衰竭，膿毒癥及其并發(fā)癥是ICU 患者的主要死亡原因［10］。同理，本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠生存率降低，而姜黃素能夠增加膿毒癥小鼠的生存率。認(rèn)知障礙是膿毒癥所致多器官功能障礙中的一種，嚴(yán)重影響膿毒癥患者生存和預(yù)后。本實驗用曠場實驗反應(yīng)小鼠活動和探索能力，Morris水迷宮試驗反應(yīng)學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力發(fā)現(xiàn)：膿毒癥小鼠活動探索能力和學(xué)習(xí)認(rèn)知能力均減弱，而姜黃素能夠增加膿毒癥小鼠活動探索能力和學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。初步說明姜黃素對膿毒癥認(rèn)知功能障礙具有改善作用。

過度的炎癥、氧化應(yīng)激以及嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是膿毒癥誘發(fā)的腦損傷和認(rèn)知障礙的潛在機(jī)制［11］。海馬在學(xué)習(xí)、記憶、情緒、內(nèi)分泌及內(nèi)臟活動中具有至關(guān)重要的作用。本研究可知，膿毒癥小鼠神經(jīng)細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮，存在嚴(yán)重的炎癥因子浸潤，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加，這與Wang等［12］的研究相一致。同時本文發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠減弱這種病理改變。氧化應(yīng)激和炎癥離子都是觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死的最重要因素［13］。膿毒癥中，氧化應(yīng)激的發(fā)生和促炎性細(xì)胞因子和趨化因子（例如IL-6、IL-1β和TNF-α）的釋放是神經(jīng)元死亡的主要原因［14］。因此，減輕氧化應(yīng)激和炎癥應(yīng)激是膿毒癥認(rèn)知障礙的重要治療方法。姜黃素通過減輕大鼠氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡來減輕粘菌素誘導(dǎo)的腎毒性和神經(jīng)毒性［15］。同樣本文研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素明顯減少膿毒癥小鼠海馬組織中IL-6、TNF-α、IL-1 β、MDA 含量，升高SOD 和CAT活性，說明姜黃素能減弱膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

沉默信息調(diào)節(jié)劑1（Silent information regulator 1，SIRT1）是重要的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白賴氨酸脫乙酰酶，可調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、炎癥信號、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老［16］。SIRT1的活化抑制細(xì)胞凋亡，氧化和炎癥離子，從而減輕膿毒癥引起的多器官損傷，包括肺，腎和肝［17］。SIRT1的神經(jīng)保護(hù)作用已在顱腦外傷，缺血性損傷和許多神經(jīng)退行性疾病中得到證實［18］。本文發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠上調(diào)SIRT1表達(dá)，說明姜黃素可能通過激活SIRT1來改善膿毒癥小鼠認(rèn)知功能障礙。SIRT1激活發(fā)揮抗凋亡、抗氧化和抗炎作用，與SIRT1介導(dǎo)下游信號蛋白（如FOXO1、p53和NF-κB）的脫乙酰作用密切相關(guān)。FOXO1被視為是一種代謝和抗氧化劑調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)SOD 和CAT 的合成。SIRT1直接使FOXO1脫乙酰，從而刺激介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用基因的表達(dá)［19］。p53是具有強(qiáng)大促凋亡作用轉(zhuǎn)錄因子，是SIRT1的第一個非組蛋白脫乙?；饔冒袠?biāo)，SIRT1對p53的脫乙酰作用與p53轉(zhuǎn)錄功能降低相關(guān)，從而抑制了凋亡。NF-κB 的激活通過增強(qiáng)包括IL-6、IL-1β和TNF-α在內(nèi)的各種促炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄而參與敗血癥的發(fā)生和發(fā)展。SIRT1可以使NFκB脫乙酰化并抑制NF-κB 的活性，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［9］。本文研究可知，姜黃素下調(diào)膿毒癥小鼠Ac-FOXO1、Ac-NF-κB 和Ac-p53 表 達(dá)。本 文 還 發(fā)現(xiàn)，加入一種非競爭性SIRT1抑制劑EX-527后，消除了姜黃素對膿毒癥小鼠的作用，進(jìn)一步證實了姜黃素通過激活SIRT1對膿毒癥小鼠模型的認(rèn)知功能障礙起調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，姜黃素通過激活SIRT1增強(qiáng)膿毒癥小鼠存活率，增加膿毒癥小鼠活動探索能力和學(xué)習(xí)認(rèn)知能力，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，這與FOXO1、p53和NF-κB 的脫乙酰作用密切相關(guān)。這為膿毒癥認(rèn)知功能障礙的治療提供參考數(shù)據(jù)，但其確切的機(jī)制仍需要進(jìn)一步充分研究。