丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠皮質(zhì)區(qū)新生微血管的影響研究

郭荷娜，康蓓，趙婧鈺，楊謙

卒中是全球范圍內(nèi)第二大致死性疾病，而我國卒中發(fā)病率及病死率全球最高，雖然1990—2016 年我國卒中致死率及致殘率均有所下降，但其給患者家庭及社會帶來的負擔仍然很重［1］。再灌注治療是目前臨床治療早期缺血性卒中的有效手段，但該治療方法常受到溶栓治療時間窗、技術(shù)設備等因素影響，獲益人群十分有限。腦側(cè)支循環(huán)指腦血管狹窄或閉塞后出現(xiàn)的一種代償血管，是機體的一種代償性表現(xiàn)［2］。因此，促進腦側(cè)支循環(huán)開放、新生血管形成已成為治療缺血性卒中的重要治療思路。丹紅注射液是從丹參和紅花中提取的含有丹參素、丹參酚A 等成分的中藥注射液，具有抗炎、抗氧化及保護神經(jīng)等作用，目前已廣泛用于治療缺血性腦血管疾?。?］，但其具體作用機制尚未完全明確。本研究旨在探討丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠皮質(zhì)區(qū)新生微血管的影響，為進一步探究丹紅注射液治療缺血性卒中的具體作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 2018 年12 月—2019 年6 月，選取雄性SD 大鼠84 只，體質(zhì)量180～220 g，均由西安交通大學動物實驗中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫恒定為24 ℃，相對濕度為40%～60%，12 h 光照/黑暗交替進行，自由攝食及飲水，飼養(yǎng)籠、敷料及水瓶每3 d 更換1 次，且需要更換的物品均進行消毒處理。將84 只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（n=12）、模型組（n=36）及丹紅組（n=36）。

1.2 主要試劑及儀器 丹紅注射液購自山東丹紅制藥有限公司（生產(chǎn)批號：18101015），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購自Sigma 公司，鼠CD31 單克隆抗體、山羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗購自武漢博士德生物工程有限公司購自武漢博士德生物工程有限公司，蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；OLYMPUS 光學顯微鏡，載玻片、蓋玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.3 實驗方法 參照改良LONGA 線栓法［4］制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型，具體如下：采用10%水合氯醛0.35 ml/100 g 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后將大鼠固定于手術(shù)操作臺，消毒并于頸部正中做一縱行切口，分離、暴露頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，之后于左側(cè)頸總動脈分叉處近心端0.3 cm 處剪一斜形切口，沿頸內(nèi)方向緩慢插入線栓，松開頸內(nèi)動脈夾，當線栓頭端距切口1.8～2.0 cm 且略感阻力后停止插線栓，2 h 后拔出線栓并恢復血流，逐層縫合皮膚。以造模后大鼠清醒時神經(jīng)行為學評分1～3 分為造模成功，造模失敗大鼠予以排除。造模組和丹紅組大鼠制備腦缺血再灌注損傷模型；假手術(shù)組大鼠不插線栓，其他步驟同造模組。丹紅組大鼠于拔出線栓后腹腔注射丹紅注射液0.5 ml/kg，1次/d；造模組和假手術(shù)組均于相同時間點腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 觀察指標

1.4.1 神經(jīng)行為學評分 分別于造模后24 h、72 h、7 d評估三組大鼠神經(jīng)行為學評分，神經(jīng)行為學評分標準：0 分：無明顯神經(jīng)行為障礙；1 分：提尾懸空時右側(cè)前肢體屈曲、不能前伸或左側(cè)眼裂變小；2 分：置于光滑地面后向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：站立不穩(wěn)并向?qū)?cè)傾斜；4 分：軟癱不能自發(fā)行走［5］。

1.4.2 腦梗死體積 造模后24 h、72 h、7 d 分別從假手術(shù)組選取2 只大鼠、造模組選取6 只大鼠、丹紅組選取6 只大鼠并處死，取腦組織并置于-20 ℃冰箱中約15 min；在視交叉處冠狀位切腦片5 張，每片厚約2 mm，剔除嗅球、后腦及其他組織；將切好的腦片置于2% TTC 溶液中，37 ℃恒溫保存20～30 min，每6～7 min 翻動腦片，并使用相機拍照存儲。腦梗死體積=患側(cè)腦梗死體積/正常側(cè)腦體積×100%。

1.4.3 腦組織病理學改變 采用HE 染色法觀察腦組織病理學改變，具體如下：造模后24 h、72 h、7 d 分別從假手術(shù)組選取2 只大鼠、造模組選取6 只大鼠、丹紅組選取6 只大鼠，麻醉滿意后打開胸腔，于心臟左心室穿針并剪開右心耳，灌注37 ℃、0.9%氯化鈉溶液100 ml至右心耳流出液變清亮，采用4%多基甲醛固定，大鼠劇烈抽動且后肢繃直即灌注成功，取全腦組織并置于4%多聚甲醛固定24 h。將腦組織制成1 cm×1 cm×0.2 cm大小后裝入脫水包埋盒，采用乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，切片機切片，采用HE 染色，光鏡下觀察大鼠皮質(zhì)區(qū)腦組織病理學改變。

1.4.4 新生微血管數(shù)目 采用免疫組化染色法觀察缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目，具體如下：將腦組織切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液高溫、高壓抗原修復15 min；滴加一抗鼠CD31 單克隆抗體，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2 min×3 次，加山羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃ 孵育30 min，PBS 漂洗2 min×3 次；DAB 顯色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并計數(shù)新生微血管，光鏡下找出缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)3 個血管密度最高區(qū)域，以CD31 標記的棕黃色微血管為新生微血管，隨機觀察5 個視野并計算平均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學評分 造模組和丹紅組大鼠均造模成功。假手術(shù)組大鼠造模后24 h、72 h 及7 d 神經(jīng)行為學評分均為0。造模組和丹紅組大鼠造模后24、72 h 神經(jīng)行為學評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；丹紅組大鼠造模后7 d 神經(jīng)行為學評分低于造模組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 造模組和丹紅組大鼠造模后不同時間點神經(jīng)行為學評分比較（±s，分）Table 1 Comparison of neurobehavioral score between model group and Danhong group at different time points after modeling

表1 造模組和丹紅組大鼠造模后不同時間點神經(jīng)行為學評分比較（±s，分）Table 1 Comparison of neurobehavioral score between model group and Danhong group at different time points after modeling

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2.2 腦梗死體積 假手術(shù)組大鼠造模后24 h、72 h 及7 d腦梗死體積均為0。丹紅組大鼠造模后24 h、72 h 及7 d腦梗死體積小于造模組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2、圖1）。

表2 造模組和丹紅組大鼠造模后不同時間點腦梗死體積比較（± s，%）Table 2 Comparison of volume of cerebral infarction between model group and Danhong group at different time points after modeling

表2 造模組和丹紅組大鼠造模后不同時間點腦梗死體積比較（± s，%）Table 2 Comparison of volume of cerebral infarction between model group and Danhong group at different time points after modeling

組別 只數(shù) 造模后24 h 造模后72 h 造模后7 d造模組 6 38.53±0.97 35.35±0.67 31.45±1.12丹紅組 6 37.14±1.08 32.69±2.33 29.43±1.67 t 值 3.314 3.829 3.480 P 值 0.003 ＜0.01 0.002

2.3 腦組織病理學改變 假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，輪廓清，排列整齊，核居于中央，胞質(zhì)淡藍色，無明顯病理學改變；造模組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元排列紊亂，有間質(zhì)性水腫及神經(jīng)元變性、壞死；丹紅組大鼠皮質(zhì)區(qū)存在間質(zhì)性水腫及神經(jīng)元變性、壞死，但數(shù)量較造模組減少，見圖2～3。

2.4 新生微血管數(shù)目 三組大鼠造模后24 h、72 h 及7 d腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；造模組和丹紅組大鼠造模后24 h腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目多于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；造模組和丹紅組大鼠造模后72 h 及7 d 腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目多于假手術(shù)組，丹紅組大鼠腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目多于造模組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。

3 討論

腦缺血可引起腦組織氧化應激及炎性反應過度激活、神經(jīng)元凋亡，而溶栓治療或血管自動再通可使腦組織發(fā)生再灌注，但再灌注過程可能會加重腦組織損傷［6］。研究表明，建立有效的腦側(cè)支循環(huán)可改善缺血性卒中患者預后，其原因主要與腦側(cè)支循環(huán)可延緩永久性神經(jīng)損傷、減少神經(jīng)損傷及縮小梗死范圍有關(guān)［7-8］。目前，腦側(cè)支循環(huán)根據(jù)開放層次大致分為三級，其中一級側(cè)支循環(huán)主要由willis 環(huán)的血管構(gòu)成，二級側(cè)支循環(huán)指眼動脈、軟腦膜及其他相對較小的側(cè)支與側(cè)支吻合支，三級側(cè)支循環(huán)指通過血管發(fā)生和血管生成等方式產(chǎn)生的新生供血血管，當一級、二級側(cè)支循環(huán)不能滿足供血需求時，新生血管形成就成為最終的側(cè)支代償途徑［9］。

圖1 三組大鼠造模后不同時間點腦片TTC 染色結(jié)果Figure 1 TTC staining results of brain slices in the three groups at different time points after modeling

圖2 三組大鼠造模后7 d 腦組織病理學檢查結(jié)果（HE 染色，×400）Figure 2 Pathological examination results of brain tissue in the three groups 7 days after modeling

圖3 三組大鼠造模后72 h 腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管情況（免疫組化染色，×400）Figure 3 Neovascularization in cortex with cerebral ischemia-reperfusion in the three groups 7 days after modeling

表3 三組大鼠造模后不同時間點腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目比較（±s，條）Table 3 Comparison of number of neovascularization in cortex with cerebral ischemia-reperfusion in the three groups at different time points after modeling

表3 三組大鼠造模后不同時間點腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目比較（±s，條）Table 3 Comparison of number of neovascularization in cortex with cerebral ischemia-reperfusion in the three groups at different time points after modeling

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與造模組比較，bP＜0.05

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丹紅注射液主要有效成分為丹參、紅花提取物，具有活血化瘀、通脈舒絡等功效。本研究結(jié)果顯示，造模組和丹紅組大鼠造模后24、72 h 神經(jīng)行為學評分間無統(tǒng)計學差異，但丹紅組大鼠造模后7 d 神經(jīng)行為學評分低于造模組，提示丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護作用較緩慢。本研究結(jié)果還顯示，丹紅組大鼠造模后24 h、72 h 及7 d 腦梗死體積小于造模組，提示丹紅注射液能有效縮小腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積。

CD31是分子量為130 kD的細胞膜表面單鏈糖蛋白，屬于免疫蛋白超家族成員，主要表達于血管內(nèi)皮，在相鄰內(nèi)皮細胞及經(jīng)內(nèi)皮間遷移、介導同型白細胞黏附方面具有重要作用［10-11］。目前，由CD31 標記的新生微血管密度是公認的評價新生血管形成的標準［12］。因此，本研究通過觀察CD31 表達情況而分析腦缺血再灌注損傷大鼠腦血管新生及側(cè)支循環(huán)代償情況，結(jié)果顯示，造模組和丹紅組大鼠造模后24 h 腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目多于假手術(shù)組；造模組和丹紅組大鼠造模后72 h 及7 d 腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目多于假手術(shù)組，丹紅組大鼠腦缺血再灌注皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)目多于造模組，提示丹紅注射液能有效增加腦缺血再灌注損傷大鼠梗死區(qū)新生微血管數(shù)目。既往研究表明，丹紅注射液可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達而促進缺血心肌、糖尿病足小鼠缺血肢體血管再生及斑馬魚節(jié)間血管再生［13-14］。VEGF 除與缺血區(qū)域微血管密度及新生血管數(shù)量有關(guān)外，還與神經(jīng)保護、抗細胞凋亡、促進神經(jīng)元再生關(guān)系密切［15-16］。因此，筆者所在課題組推測丹紅注射液可能通過某種信號通路上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠皮質(zhì)區(qū)VEGF 的表達而促進血管新生，進而保護神經(jīng)功能、縮小腦梗死面積，下一步將從分子學水平探討丹紅注射液治療缺血性卒中的具體作用機制。

綜上所述，丹紅注射液可有效增加腦缺血再灌注損傷大鼠皮質(zhì)區(qū)新生微血管數(shù)量，改善腦側(cè)支循環(huán)，進而減輕神經(jīng)功能缺損、縮小腦梗死體積。

作者貢獻：郭荷娜進行文章的構(gòu)思與設計，研究的實施與可行性分析，對文章整體負責，監(jiān)督管理；趙婧鈺進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析，負責撰寫論文；郭荷娜、趙婧鈺進行結(jié)果分析與解釋；康蓓進行論文的修訂；楊謙負責文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。