時間序列多組學整合分析揭示原代肝細胞體外培養(yǎng)去分化過程伴隨非降解性泛素化修飾的增加

姜正一，孫澤宇，歐陽曉希，趙亞磊，周夢豪，王保紅，李啟睿，范林驍，張賽男，李蘭娟*

State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310003, China

原代肝細胞被認為是評價藥物-代謝相互作用[1]、建立嗜肝疾病模型[2]及肝細胞移植模型的理想細胞[3]。與其他模型（如肝癌細胞系和干細胞來源的肝細胞樣細胞）相比，它的功能是無可比擬的[4]。終末分化的原代肝細胞在體內(nèi)微環(huán)境的精確調(diào)控下可以維持細胞功能穩(wěn)定，而離體的原代肝細胞在較短時間內(nèi)便會發(fā)生去分化或上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），主要表現(xiàn)為細胞形態(tài)的改變和肝功能急劇下降[5-7]。因此，去分化的發(fā)生極大地限制了原代肝細胞的應用。

近年來，大量研究對與去分化相關的機制進行了報道，包括蛋白激酶B（Akt）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）[6]、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子kappaB（NF-κB）信號通路的參與[8]；還包括肝細胞核因子（HNF）（HNF4α和HNF1）的下調(diào)、Snail的誘導[9]以及非編碼轉(zhuǎn)錄基因的紊亂[10]。研究者們已經(jīng)采取了各種策略來維持體外環(huán)境中原代肝細胞的功能，包括從內(nèi)部改變基因的表達（如過表達HNF4α），及從外部添加小分子化合物（如將其與肝非實質(zhì)細胞共同培養(yǎng)）[11-15]。Xiang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用Forskolin （FSK）、SB431542（SB43）、DAPT（Notch抑 制 劑）、IWP2（Wnt抑制劑）和LDN193189（BMP抑制劑）可維持部分肝細胞功能長達數(shù)周，這是通過阻斷轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β通路來實現(xiàn)的。然而去分化的確切機制尚不清楚，如何在體外環(huán)境中維持原代肝細胞特異性功能仍然有待進一步研究。

考慮到信使核糖核酸（mRNA）和蛋白質(zhì)表達之間的相關性很低，從轉(zhuǎn)錄組學層面對去分化進行研究是遠遠不夠的[17]。鑒于肝臟中含有大量的高豐度蛋白質(zhì)，全蛋白質(zhì)組學分析很難挖掘去分化過程中的低豐度關鍵蛋白。綜上，我們推測蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）可能會為原代肝細胞體外去分化提供更有價值的信息。

泛素是一種由76個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在泛素激活酶（E1）、泛素轉(zhuǎn)移酶（E2）和泛素連接酶（E3）的協(xié)同作用下可與底物結(jié)合。去泛素化酶（DUB）可以將泛素鏈從底物上去除，因此這一過程是可逆的[18]。泛素鏈有7個賴氨酸殘基（K）（包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）以及N端蛋氨酸殘基（M1），這些位點都可以作為延伸鏈的結(jié)合位點。不同的泛素化修飾類型介導不同的生物學功能。K48和K11連接通常與26S蛋白酶體介導的蛋白質(zhì)降解有關，而K63和K27連接通常與非降解性功能相關[19]。

研究表明，泛素化修飾在某些細胞分化或去分化過程中有著重要作用。Buckley等[20]、Choi和Baek [21]通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）靶向RNA干擾（RNAi）技術篩選出了在胚胎干細胞（ESC）分化中發(fā)揮重要作用的E3酶——FBXW7。此外，CD4+T細胞分化為輔助性T細胞也需要泛素化修飾的參與[22]。UPS的調(diào)節(jié)因子UBA1參與誘導多能干細胞（IPSC）向運動神經(jīng)元分化[23]。Lauschke等[10]從轉(zhuǎn)錄組層面開展研究，表明在肝細胞去分化過程中有泛素化通路參與。這些研究為“泛素化修飾在肝細胞去分化中發(fā)揮作用”這一假設提供了理論基礎。不同類型的翻譯后修飾之間普遍存在著協(xié)同調(diào)節(jié)，以介導細胞完成不同的功能[24]，泛素化與磷酸化之間的交流尤為緊密[19,25]。

在本研究中，我們采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術（LC-MS/MS），系統(tǒng)地分析了體外5個不同時間點的原代肝細胞泛素化和磷酸化修飾蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化。這一研究不僅對先前研究進行了補充，也為深入研究原代肝細胞去分化提供了新的思路。

2. 材料與方法

2.1. 實驗設計及統(tǒng)計原理

應用HF-X質(zhì)譜法對大鼠去分化原代肝細胞和四種細胞系的可溶性蛋白的WCP、泛素組和磷酸化蛋白質(zhì)組進行分析。為了驗證實驗所測量的生物學可靠性，我們在每個實驗對每個指標點的原代肝細胞的4個生物學重復都進行了分析。

我們使用標準配對t檢驗來確定去分化（6 h、12 h、24 h、48 h）與0 h之間是否存在統(tǒng)計學差異。

2.2. 大鼠原代肝細胞的提取及培養(yǎng)

實驗動物：雄性SD大鼠，體質(zhì)量為250～300 g，由浙江省實驗動物中心提供。將大鼠被關在不銹鋼籠子里，將其光周期設置為12 h光期+12 h暗期，并采用兩步酶灌注法分離原代肝細胞[26]。小鼠腹腔注射4%（m/V）的水合氯醛（每100 g注射0.7 mL）麻醉。用含1 μmol·L-1乙二胺四乙酸（Sigma-Aldrich, USA）的無鈣培養(yǎng)液通過門靜脈對肝臟進行原位灌流，直至血液被完全沖走。接著在灌流裝置中加入37℃的含0.08%（m/V）消解酶（Gibco, USA）的灌流液，然后加入0.05%（m/V）膠原酶IV（Sigma-Aldrich, USA）灌注液。兩種灌注液交替輸注，直至大鼠肝臟表面出現(xiàn)微小裂隙，然后將肝臟移至裝有冷藏后的洗滌緩沖液的燒杯中，并用干凈的剪刀將其切碎。用Percoll梯度離心法對分解后的細胞進行純化（GE Healthcare, Sweden）。在之后的實驗中我們只使用存活率大于90%的肝細胞。將原代肝細胞重新在Williams E培養(yǎng)基（Sigma-Aldrich, USA）中懸浮培養(yǎng)，以每10 cm培養(yǎng)皿中1×107個細胞的密度接種于I型膠原涂層平板（BD Dickinson, USA）。Williams E培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（Gibco, USA）、1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（Life Technologies, USA）、0.1 mmol·L-1地塞米松（Life Technologies, USA）、1×谷氨酰胺（Life Technologies, USA）和1×青霉素（100 U·mL-1）或鏈霉素（100 μg·mL-1）（Sigma-Aldrich, USA）。3 h后，將培養(yǎng)基換成無胎牛血清的培養(yǎng)液。

2.3. 超級SILAC 樣本的制備

應用細胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標記法（SILAC）將Mac-RH-777、RH-35、HSC-T6和CRHR-7919細胞培養(yǎng)在含有10%透析胎牛血清、13C615N4-精氨酸（Arg10）[50 μg·(500 mL)-1]和13C615N2-賴氨酸（Lys8）[50 μg·(500 mL)-1]（SigmaAldrich, USA）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中，直至它們被完全標記，至少培養(yǎng)6代[27]。重標記裂解物以1:1:1:1的比例混合從而獲得超級SILAC混合物。

2.4. 蛋白質(zhì)的提取和分解

培養(yǎng)0 h的原代肝細胞稱為培養(yǎng)前分離的新鮮肝細胞。在指定的時間點和4個細胞系中用冷藏后的1×磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌原代肝細胞兩次，然后加入裂解緩沖液（1×蛋白酶抑制劑、1×磷酸化酶抑制劑、1× 8 mol·L-1尿素中的PR-619）。接著將裂解液在4 ℃的條件下，以11 304 r·min-1離心10 min，分離出不溶性碎片。收集離心管中的上清液并用BCA蛋白檢測試劑盒（Invitgen, USA）測定其蛋白質(zhì)濃度。在每個指定時間點將 10 mg蛋白質(zhì)與1 mg超級SILAC混合。

將混合后的蛋白質(zhì)在30 ℃的條件下用5 mmol·L-1的二硫蘇糖醇（DTT）還原30 min，接著加入15 mmol·L-1的碘乙酰胺（IAA）在室溫下避光反應30 min。然后借助Zeba旋轉(zhuǎn)脫鹽離心柱（Thermo Fisher Science, USA）用50 mmol·L-1的 碳 酸 氫 銨（ABC）代 替 裂 解 液 中 8 mol·L-1的尿素。所有樣本在37 ℃的條件下與胰酶以40:1（m/m）的比例過夜培養(yǎng)。分解后得到的多肽通過三氟乙酸（TFA）酸化，其最終濃度為1%（pH≤3）。酸化的多肽以1696 r·min-1離心15 min，上清液用預處理的Sep-pakC18固相萃取柱（Waters, USA）脫鹽[28]。將脫鹽后的多肽置于真空冷凍干燥機（Labcono, USA）中冷凍干燥48 h以上。

2.5. 抗K-ε-GG 抗體的化學交聯(lián)

我們的實驗使用針對泛素殘基（K-ε-GG）的PTMScan?試劑盒（CST, USA）和針對磷酸化絲氨酸/蘇氨酸基序[pS/T]的PTMScan?試劑盒（CST, USA）。將所有微珠在20 mmol·L-1的庚二亞氨酸二甲酯（DMP）（Sigma, USA）中重新懸浮培養(yǎng)，在室溫下進行端對端旋轉(zhuǎn)孵育30 min。為了停止交聯(lián)反應，將微珠用200 mmol·L-1的乙醇胺（pH 8.0）在4 ℃下孵育2 h。在交聯(lián)后，用1 mL冷藏后的1 × PBS洗滌這些微珠3次。

2.6. 泛素化和磷酸化多肽的富集

將干燥后的肽在1×人細胞凋亡抑制因子（IAP）緩沖液（CST, USA）中重新懸浮培養(yǎng)并在4 ℃下以9420 r·min-1離心10 min，除去其中的不溶性物質(zhì)。將上清液與洗滌過的交聯(lián)微珠在試管中孵育2 h，然后以94 r·min-1離心30 s。用1 mL冷藏后的IAP緩沖液洗滌微珠3次，用50 μL 0.15%的三氟乙酸（TFA）對泛素化的多肽進行洗脫。通過真空離心使洗脫液完全干燥并根據(jù)說明書使用PTMScan?Phospho-Enrichment IMAC Fe-NTA Magnetic Beads (CST, USA)使磷酸肽富集。

2.7. 串聯(lián)質(zhì)譜標簽

在磷酸肽富集后，用串聯(lián)質(zhì)譜（TMT）試劑盒（TMT10plex）標記已修飾的多肽。第一個重復時5個時間點的原代肝細胞被標記為126、127N、127C、128N和128C，第二個重復時5個時間點的原代肝細胞被標記為129N、129C、130N、130C和131。第三個和第四個重復時用另一種TMT10plex試劑盒標記。用100 mmol·L-1的四乙基溴化銨（TEAB）（pH 8.0）溶解多肽，并將其與8 mL的TMT標記試劑混合。室溫下反應1 h，加入5%的羥胺孵育15 min使反應停止。將所有樣本放置在一個新的試管中，并用離心法去除不溶性物質(zhì)。將上清液用自制的C18脫鹽裝置進行除鹽凍干。

2.8.強陽離子交換層析

將標記的多肽在80 mL 15%乙腈（ACN）和0.1%三氟乙酸（TFA）溶液中懸浮培養(yǎng)，并用自制的強陽離子交換（SCX）柱對其進行分離。分別用以下幾種方法對SCX柱進行預處理：80 μL乙腈；80 μL 80%乙腈和0.1%三氟乙酸；80 μL 15%乙腈，500 mmol·L-1乙酸銨和0.1%三氟乙酸；80 μL 15%三氟乙酸和0.1%三氟乙酸。在15%乙腈中30～250 mmol·L-1的乙酸銨中洗脫得到5個組分。標記的多肽在分離后呈現(xiàn)完全脫鹽凍干的狀態(tài)。

2.9. LC-MS/MS 分析

用0.1%的甲酸和2%的乙腈溶解凍干多肽。通過依賴于Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀的UltiMate 3000 RSLCnano系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific, USA）對多肽進行分析。起始我們采用恒定流速為400 nL·min-1及120 min 3%～80%的線性梯度的0.1%甲酸緩沖液。WCP、泛素組和磷酸化蛋白質(zhì)組的MS譜采用120 000分辨率，其質(zhì)荷比的范圍為300～1500m/z，自動增益控制目標為3E6。在MS2光譜采集過程中，分辨率為30 000，高能碰撞誘導碎裂（HCD）設置為27%。此外，我們使用依賴于數(shù)據(jù)的自動增益控制目標為2E5的方法對MS2光譜上的前20名進行了分析，設置其隔離窗口為1.0m/z。排除電荷小于2或大于7的數(shù)據(jù)，動態(tài)排除設置為30 s。

2.10. 數(shù)據(jù)庫檢索

使用MaxQuant軟件中的UniProtKB數(shù)據(jù)庫對多肽進行鑒定及定量[26]。在檢索時，選擇半胱氨酸烷基化（arbamidomethyl, C）作為固定修飾。在尋找泛素化位點時，選擇氧化（oxidation）、N端乙酰化（acetyl protein N-term）及絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾[phosphor（STY）]作為可變修飾。胰蛋白酶對于分解蛋白質(zhì)具有特異性，將允許的最大漏切數(shù)設置為2。我們使用20 ppm (1 ppm = 10-6)進行第一次離子耐受性研究，使用4.5 ppm進行普遍離子耐受性研究。設置肽段鑒定時假陽性率標準為FDR＜0.01。將磷酸化位點和泛素化位點定位概率大于0.9定義為高可信度修飾位點。除了上述參數(shù)外，我們還應用了MaxQuant軟件中的默認參數(shù)。

質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學的數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)集標識符PXD015897已經(jīng)通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)資源共享系統(tǒng)iProX一起存至ProteomeXchange數(shù)據(jù)庫中[29]。

2.11. 生物信息學分析

采用配對樣本t檢驗進行差異分析。顯著性差異的蛋白質(zhì)或位點需滿足：差異倍數(shù)（FC）＞1.5且與0 h相比P＜ 0.05，而差異明顯的蛋白質(zhì)或位點只需滿足FC＞1.5而P值不受限制。

GO、KEGG通路分析是采用ORA分析，通過WebGestalt數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)[4]。使用WebLogo3分析多肽基序的相似性[30]。使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡[31]。使用Cytoscape工具將功能性蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡可視化[32]。使用CytoHubba篩選hub基因 [33]。使用Perseus軟件進行時間序列聚類分析[34]。

2.12. Western 免疫印跡

用12%的聚丙烯酰胺凝膠分離出20 μg的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維濾膜上（Bio-Rad, USA）。使用1×封閉緩沖液（Beyotime, China），在室溫條件下封閉膜30 min。然后將膜與抗HNF1α抗體（Cat#: 89670S; 1:2000; CST, USA）、抗E-鈣黏蛋白抗體（Cat#: 76055; 1:1000; Abcam, USA）、 抗N-鈣 黏 蛋 白 抗 體（Cat#: 98952; 1:1000; Abcam, USA），或抗波形蛋白抗體 （Cat#: 92547; 1:1000; Abcam, USA）在4 ℃過夜培養(yǎng)，并且在和相應的二次抗體孵育前使用1×洗滌緩沖液沖洗膜3次。

2.13. 流式細胞術

在使用Percoll液純化后，使用1×PBS洗滌5×106個·mL-1的原代肝細胞兩次，然后用4%多聚甲醛在室溫下固定15 min。使用Triton-100幫助滲透。根據(jù)制造商的方案，其使用濃度為1:500（m/m）的白蛋白抗體（Cat#: ab207327; Abcam, USA）。

2.14. 免疫熒光

使用1×PBS洗滌蓋玻片上培養(yǎng)的5×106個·mL-1原代肝細胞兩次，用4%多聚甲醛在室溫下固定15 min，然后用0.5% Triton X-100在室溫下透化肝細胞10 min，并且用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min。將其與抗E-鈣黏蛋白抗體（Cat#: 76055; 1:1000; Abcam, USA）、抗N-鈣黏蛋白抗體（Cat#: 98952; 1:1000; Abcam, USA），或抗波形蛋白抗體（Cat#: 92547; 1:1000; Abcam, USA）在4 ℃過夜培養(yǎng)，再和相應的二次抗體共同孵育1 h。觀察前，細胞核在室溫下用DAPI（Abcam, USA）染色4 min。

2.15.實時定量PCR 分析

使用Trizol（Sigma-Aldrich, USA）提取總RNA，并使用cDNA第一鏈合成試劑盒（Roche Applied Science, Germany）對其進行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green PCR master Mix（Roche Applied Science, Germany）和QuantStudio5 PCR系統(tǒng)（Thermo Fisher Science, USA）進行聚合酶鏈反應（PCR）。這些引物列在附錄A的表S1中。

2.16.微列陣分析

我們在每個時間點進行了三次重復。樣本由上海OE生物技術有限公司采用Agilent大鼠IncRNA基因芯片V3（8 × 60 K，設計ID：084409）。本研究中的基因不僅在5個時間點均被檢測到，而且在相鄰時間點之間也存在顯著性差異（P＜ 0.05, FC ＞ 1.5）。

圖1. 原代肝細胞在體外經(jīng)歷去分化改變。（a）流式技術顯示原代肝細胞分泌白蛋白。FL1指對照組（左邊）和實驗組（右邊）中第一個通道FITC連接的二抗的比例。FL1 (-99.1)表示對照組中99.1%的細胞不分泌白蛋白。FL1 (+0.93)指對照組中0.93%的細胞分泌白蛋白。FL1 (-0.095)指實驗組中0.095%的細胞不分泌白蛋白。FL1 (+99.9)指實驗組中99.9%的細胞分泌白蛋白。（b）細胞免疫熒光顯示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關分子標志物在去分化過程中發(fā)生改變。0 h表示細胞剛從肝臟中分離，未在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)之前（比例尺，100 nm）。（c）免疫印跡顯示HNF1a及三種上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換分子標志物的改變。GAPDH作為內(nèi)參。（d）～（g）柱狀圖顯示與（c）圖相對應的四種蛋白質(zhì)的相對定量變化。*, **, ***分別表示與0 h相比，P ＜ 0.05, 0.01和0.001。誤差線表示均值±標準差。

3.1. 體外培養(yǎng)過程中原代肝細胞去分化相關標志物表達量持續(xù)升高

我們發(fā)現(xiàn)采用兩步酶解灌流法分離得到的細胞，白蛋白高表達[圖1（a）和圖S1]，vWF（肝竇內(nèi)皮細胞標志物），CD163（枯否細胞標志物）和desmin、CK-43、a-SMA（肝星狀細胞標志物）低表達（圖S2）。這表明分離純化的細胞為原代肝細胞。在體外單層培養(yǎng)6 h后，上皮標志蛋白E-鈣黏蛋白表達明顯降低，培養(yǎng)24 h后間質(zhì)標志蛋白N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達明顯上升，此結(jié)果與以前的報道結(jié)果相似[圖1（b）～（g）][7]。正如圖S3中所示，其相應的mRNA結(jié)果呈現(xiàn)出相同的趨勢。此外，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原代肝細胞逐漸喪失了肝細胞的正常形態(tài)——72 h后類似于成纖維細胞樣（圖S4）。

總之，這一部分表明，體外培養(yǎng)48 h的大鼠原代肝細胞是研究去分化相關機制的良好模型。

3.2. TMT 和super-SILAC 的聯(lián)合應用

由于細胞內(nèi)泛素化修飾蛋白的含量很低，因此研究泛素化修飾需要較大的起始蛋白質(zhì)量（＞ 10 mg）。我們前期預實驗發(fā)現(xiàn)，一只大鼠所分離的原代肝細胞只能獲得大約5 mg蛋白質(zhì)，因此很難在每個指定的時間點獲得足夠的細胞。最終，我們決定收集多只大鼠的肝細胞樣本，之后按照相同時間點進行合并。我們將40只SD大鼠的原代肝細胞隨機分成4組（即4個生物學重復），并將來自同一時間點的同一組內(nèi)的細胞樣本放到同一個試管中（圖2）。這種方法為進一步研究后續(xù)泛素化修飾組學提供了足夠的蛋白質(zhì)量和生物重復。

圖2. 多組學分析流程圖，包括蛋白質(zhì)純化、酶解、多肽富集及生物信息學分析。Ub表示泛素化修飾；GG表示雙甘氨酸肽；P表示磷酸化修飾；IP表示蛋白免疫共沉淀。

考慮到多肽水平的免疫沉淀（IP）富集效率不同，可能會引起較大的誤差。我們首先制作了super-SILAC內(nèi)參：通過重標的穩(wěn)定同位素將4種代表性細胞系（RH-35、CHRH-7799、HSC-T7和MAD-25）實現(xiàn)完全標記，然后以1:1:1:1（m/m）的比例進行混合[27]。

在起始蛋白酶解之前，我們就將super-SILAC添加至樣本中，因為對蛋白質(zhì)水平進行定量檢測比多肽水平的定量檢測更準確。在已報道的研究中，使用的super-SILAC和樣品是等量混合的[27]。目前借助TMT技術，我們一次可以檢測10個樣本。各個樣本中原本含量較低的泛素化位點，可以通過TMT的“累計效應”來提高泛素化位點的檢出率。因此，我們使用的super_SILAC與樣本的比例為1:10。最終，在super-SILAC內(nèi)參中，我們定量了63個泛素化位點和270個磷酸化位點。但這個方法有一個明顯的缺點：super-SILAC用量的減少會導致樣本覆蓋率的降低。為了解決這個問題，我們在總體水平上校正了質(zhì)譜鑒定結(jié)果，而不是依賴于樣本和super-SILAC中定量的單個蛋白質(zhì)或通過建立低豐度蛋白質(zhì)的正態(tài)分布[27,35]。具體地說，我們根據(jù)下面的公式確定了第1組（包括生物重復1和2）和第2組（包括生物重復3和4）的校正系數(shù)：

第1組校正系數(shù)=生物重復1（或2）在6 h（或12 h、24 h、48 h）的super-SILAC平均強度/生物重復1在0 h的super-SILAC平均強度。

第2組校正系數(shù)=生物重復3（或4）在6 h（或12 h、24 h、48 h）的super-SILAC平均強度/生物重復3在0 h的super-SILAC平均強度。

為了使數(shù)據(jù)結(jié)果具有可比性，我們首先對WCP進行分析，然后對泛素化和磷酸化修飾位點進行富集，并將上述校正標準應用于這三種組學。

這次研究中將TMT和super-SILAC聯(lián)合用于WCP、泛素化修飾和磷酸化修飾蛋白質(zhì)組分析，是一次新的嘗試。

圖3. 去分化過程中的全蛋白質(zhì)組學。（a）維恩圖表示在各個生物重復中定量的蛋白質(zhì)數(shù)目及其之間的交集。（b）維恩圖表示本實驗中定量的蛋白質(zhì)數(shù)目和外部數(shù)據(jù)集間的交集。（c）在全蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)中波形蛋白的表達量隨時間遞增（*代表P ＜ 0.05)。（d）熱圖顯示各個時間點不同生物重復間皮爾森相關系數(shù)。Rep代表各個生物重復。

3.3. 與原代肝細胞去分化相關的WCP

目前關于肝細胞去分化的組學相關研究，主要包括基因轉(zhuǎn)錄組、microRNA或蛋白質(zhì)組，而很少有研究關注翻譯后修飾組學的作用[36-38]。為了使我們的研究更加可靠準確，我們首先深入分析了該模型中的WCP。

我們總共鑒定了2196種蛋白質(zhì)，其中，2188種蛋白質(zhì)在至少兩次生物重復中被定量，其中有1928種蛋白質(zhì)在所有重復中被定量[圖3（a）]。與Cliff Rowe在2010年獲得的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)相比[38]，在我們的WCP數(shù)據(jù)中有1929種新的蛋白質(zhì)被定量[圖3（b）]。波形蛋白是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要標志物[7]。我們觀察到，在所有生物學重復中，波形蛋白在48 h顯著上調(diào)，并且與Western印跡和免疫熒光結(jié)果一致[圖3（c）]。super-SILAC校正后，我們對各時間點的蛋白質(zhì)豐度進行相關性分析，其相關性良好，相關性系數(shù)介于0.87～0.99 [圖3（d）]?？傮w而言，我們進行了重復WCP分析并對肝細胞去分化過程中的相對蛋白質(zhì)豐度進行了量化。在之后的實驗中，我們將使用蛋白質(zhì)豐度的變化來校正PTM的變化。

為了確定肝細胞去分化過程中蛋白質(zhì)豐度的變化，我們比較了6 h、12 h、24 h和48 h（去分化階段）和0 h（未去分化階段）的蛋白質(zhì)豐度。結(jié)果顯示，隨著體外培養(yǎng)時間延長，有顯著性差異（FC ＞ 1.5，P＜ 0.05）的蛋白質(zhì)數(shù)量逐漸增加（6 h時為35個，48 h時為110個）[圖3（e）和表S2]。GO-CC分析表明，差異性顯著的蛋白質(zhì)在24 h前主要分布在線粒體中，48 h時主要分布在細胞骨架中，GO-BP顯示差異蛋白在氧化還原反應中富集。KEGG分析顯示肝臟代謝功能（如脂肪酸降解、代謝和碳代謝）出現(xiàn)下降[圖3（f）]。

3.4. 肝細胞去分化過程中基因轉(zhuǎn)錄與對應蛋白質(zhì)豐度的相關性較小

細胞內(nèi)蛋白質(zhì)豐度是蛋白質(zhì)產(chǎn)生和降解的綜合結(jié)果。為了確定蛋白質(zhì)的減少/增加是否由降低/增加的mRNA翻譯或蛋白質(zhì)降解所導致，我們對同一時間點的轉(zhuǎn)錄組（GSE138071）和WCP進行了聯(lián)合分析。在同一時間點，不同生物重復轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)的Pearson相關系數(shù)都在0.9以上，這表明其具有良好的重復性[圖4（a）]。我們將同一時間點的肝細胞放在一起，通過對轉(zhuǎn)錄組的無監(jiān)督主成分分析（PCA），我們發(fā)現(xiàn)相同時間點的生物重復相互聚集，不同時間點的生物重復相互遠離。其中，24 h和48 h的樣本彼此靠近，0 h的樣本和它們的距離較大[圖4（b）]。轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)覆蓋了WCP中85% [圖4（c）]。此外，我們發(fā)現(xiàn)在去分化過程中轉(zhuǎn)錄組和對應蛋白質(zhì)豐度之間的相關性很小[Pearson相關系數(shù)在0.02～0.23之間，圖4（d）]。我們發(fā)現(xiàn)顯著改變的mRNA對應的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中，超過93%的在各個時間點都保持不變。此外，數(shù)個蛋白質(zhì)含量的變化方向與其相關的mRNA改變趨勢相反：4種蛋白（ac1873、纖維蛋白原β鏈、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、載脂蛋白C-I）在24 h時其表達水平顯著升高，而其mRNA水平顯著降低。載脂蛋白C-I、肌球蛋白輕鏈1/3、骨骼肌異構(gòu)體和載脂蛋白E在48 h時也有相似的變化趨勢。Hsp90 ATPase活性因子1在24 h時mRNA表達上調(diào)而蛋白質(zhì)豐度降低（圖S5）。

因此，我們認為翻譯后修飾是引起去分化過程中，基因轉(zhuǎn)錄水平和WCP表達水平不一致的重要原因。

3.5. 原代肝細胞去分化過程中的泛素化修飾水平的動態(tài)圖譜

為了獲得準確定量的泛素化修飾位點，我們使用super-SILAC作為參考進行矯正。我們一共鑒定出了2056個泛素化修飾位點，其中有1952個被準確定量，它們歸屬于1028個蛋白質(zhì)[圖5（a）]。在這1028個泛素化修飾蛋白中，有437個蛋白質(zhì)只在泛素化修飾組學中被定量。這表明泛素化修飾位點的富集，能夠幫助發(fā)現(xiàn)在WCP中未能檢測到的蛋白質(zhì)[圖5（b）]。其中，只有一個泛素化修飾位點的蛋白質(zhì)占61% (63 100)，含有多個泛素化修飾位點的蛋白質(zhì)占39% (39 700) [圖5（c）]。核糖體結(jié)合蛋白1含有高達31個泛素化修飾位點。其他含有10個或10個以上泛素化修飾位點的蛋白質(zhì)包括熱激同源71 kDa蛋白、細胞色素P450 2E1、醛酮還原酶家族成員1D1、過渡型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶、角蛋白和II型細胞骨架8、4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶。對泛素化多肽進行基序分析后，我們發(fā)現(xiàn)K殘基附近沒有相對保守基序（圖S6）。各個時間點的生物重復的相關系數(shù)在0.61～0.96之間，這個結(jié)果證明我們采用的是一種重復性良好的泛素化位點富集流程[圖5（d）]。與0 h相比，在6 h、12 h、24 h和48 h顯著上調(diào)的泛素化修飾位點數(shù)目增多（FC ＞ 1.5，P＜ 0.05）。這表明體外培養(yǎng)時間越長，泛素化修飾水平波動越明顯[圖5（e）]。通過KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)24 h前顯著上調(diào)的泛素化蛋白在細胞色素P450（CYP450）與外源物質(zhì)的糖酵解/糖異生途徑中富集。48 h時，顯著下調(diào)的泛素化蛋白在鐵死亡中富集（圖S7）。GO-CC分析表明，顯著減少的泛素化蛋白主要分布在細胞膜上。

如果一種蛋白質(zhì)只有一個被顯著調(diào)控泛素化修飾位點，那么該位點的變化就代表了這一蛋白質(zhì)修飾水平的改變。對于含有多個泛素化修飾位點的蛋白質(zhì)，我們計算了所有顯著性改變的泛素化修飾位點的“平均比率”，并用這一指標代表蛋白質(zhì)泛素化修飾水平的改變。在此基礎上，我們利用歐氏距離將泛素化修飾程度顯著變化的蛋白質(zhì)分為3簇[圖5（f）和表S3]。第1簇含有138個蛋白質(zhì)。GO-CC分析表明第1簇的泛素化蛋白主要位于胞質(zhì)核糖體、過氧化物酶體和線粒體。GO-MF分析顯示，第2簇在氧化還原反應中富集，而第3簇與多種轉(zhuǎn)運蛋白活性有關。通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，第3簇蛋白質(zhì)在與CYP450相關的外源物質(zhì)代謝中富集（圖S8）。CYP450是各種E3連接酶的重要靶點，尤其在氧化應激期間（圖S8）[37,39]。在CYP450s中，我們一共定量了81個泛素化位點，它們歸屬于23個CYP450s。與0 h相比，其中，有55個位點（歸宿于19個CYP450s）發(fā)生了改變（圖S9）。其中，有16個CYP450（69.6%）有多個泛素化修飾位點（圖S10）。CYP2e1有10個泛素化發(fā)生改變：K159、K194、K237、K243、K249、K275、K324、K420、K428和K94（圖S9）。CYP2e1上的Lys324泛素化修飾位點在其他研究中已有報道，但其對CYP2e1周轉(zhuǎn)的影響尚未發(fā)現(xiàn)[40,41]。這一修飾位點的真正作用還有待進一步研究。

接著，我們比較了泛素化修飾蛋白豐度和相應全蛋白豐度之間的相關性。在WCP和泛素組中總共有591個蛋白質(zhì)同時被定量[圖5（b）]。隨著去分化時間的延長，大部分蛋白質(zhì)在全蛋白水平上保持不變[圖5（g）]。然而，其中大多數(shù)蛋白質(zhì)的泛素化修飾水平發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào)[圖5（h）]。這表明真正發(fā)生變化的是泛素化修飾位點的水平，而不是蛋白質(zhì)含量。此外，由于泛素組圖譜與相應的蛋白質(zhì)之間沒有發(fā)現(xiàn)相反方向的變化，我們推測蛋白酶體的降解可能不是去分化中泛素化修飾的主要類型，而非降解泛素化可能在去分化轉(zhuǎn)化中起重要作用。為了驗證我們的假設，我們分析了這一過程中泛素鏈本身的動態(tài)變化。除K33外，其他5種典型的泛素鏈包括K6、K11、K29、K48和K63都在我們的數(shù)據(jù)集中被定量。其中K27是引起非降解性泛素化修飾的類型[42]，也是唯一一個在去分化過程中顯著上調(diào)的類型，這與我們的假設是一致的[圖5（i）和圖S13]。

圖4. 細胞去分化過程中全蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學之間相關性較弱。（a）不同時間點，各生物重復之間轉(zhuǎn)錄組的皮爾森相關系數(shù)顯示較好的重復性。（b)主成分分析顯示各時間點各生物重復的聚集情況。（c）維恩圖顯示全蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)之間的交集。（d）顯示全蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)之間的相關性。

圖5. 去分化過程中泛素化蛋白質(zhì)組學的動態(tài)變化。（a）去分化過程中發(fā)生顯著改變的泛素化蛋白的時間序列聚類分析。（b）柱狀圖顯示591個蛋白質(zhì)中在各時間點發(fā)生顯著改變的蛋白質(zhì)的數(shù)目。（c）顯示各時間點差異表達的全蛋白質(zhì)和差異表達的泛素化修飾蛋白之間的差異。（d）柱狀圖顯示各時間點K27修飾位點的豐度變化。*, **, ***分別表示與0 h相比，P ＜ 0.05, 0.01和0.001。誤差線表示均值±標準差。

綜上所述，我們對去分化過程中泛素化圖譜的全面動態(tài)變化進行了評估，并發(fā)現(xiàn)了非降解性泛素化修飾的作用。

3.6. 去分化過程中伴隨著磷酸化蛋白質(zhì)修飾組學的改變

考慮到磷酸化修飾和泛素化修飾常常相互結(jié)合，共同決定蛋白質(zhì)分子的功能和最終命運，我們采用Fe-NTA富集策略進一步分析了PHC去分化過程中的磷酸化修飾蛋白譜的動態(tài)變化[43,44]。

總體而言，我們一共鑒定了4932個磷酸化修飾位點，其中，4496個位點至少在兩次生物重復中被成功定量，且具有高的置信度（定位可能性大于0.9）。這些磷酸化修飾位點對應于2295個磷酸化修飾蛋白[圖S14（a）]。與WCP定量結(jié)果共同分析發(fā)現(xiàn)，有1590個低豐度蛋白質(zhì)只在磷酸化修飾組中被成功定量，而在WCP中未被定量[圖S14（b）]。此外，我們觀察到單磷酸化修飾位點是去分化過程中的主要修飾類型（超過50%）[圖S14（c）]。經(jīng)過super-SILAC內(nèi)參校正后，我們發(fā)現(xiàn)各個時間點之間磷酸化修飾多肽強度的皮爾遜相關系數(shù)均超過0.5，表明實驗的重復性良好[圖S14（d）]。我們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)——絲氨酸/精氨酸重復矩陣2——含有高達40個磷酸化修飾位點，但是沒有一個位點在PHC去分化過程中任一時間點有顯著性改變（表S4）。我們觀察到大多數(shù)磷酸化修飾位點（4319，87.57%）位于絲氨酸殘基上，而蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化修飾分別只有555（11.25%）和58（1.18%）[圖S14（e）]。除了酪氨酸修飾位點，我們觀察到高度富集基序，包括Ser（xxSPxx）和Thy（xxTPxx）的基序[圖S14（f）]。與0 h時相比，我們發(fā)現(xiàn)有29個磷酸化位點在6 h被顯著調(diào)節(jié)。而在之后的12 h、24 h和48 h，顯著變化的磷酸化修飾位點分別增加到31個、45個和58個[圖S14（g）和表S5]。這表明PHC在體外去分化過程中磷酸化修飾波動愈發(fā)明顯。

我們發(fā)現(xiàn)髓磷脂表達因子2的S422位點和肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A 1的T19位點在各個時間點都有顯著性改變。這提示去分化在不同的時間點具有獨特的磷酸化譜[圖6（a）]。我們還觀察到有兩種蛋白質(zhì)在同一時間點同時包含上調(diào)和下調(diào)的磷酸化修飾位點，包括24 h時血影蛋白β鏈的T2133位點（上調(diào)，log2FC = 1.00）和S2111位點（下調(diào)，log2FC = -1.02），以及24 h時緊密連接蛋白2的T905位點（上調(diào)，log2FC = 0.76）和T958位點（下調(diào)，log2FC = -0.80）[圖6（b）]。根據(jù)歐幾里德距離進行時間序列聚類分析，將99個發(fā)生顯著改變的磷酸化修飾蛋白分為3簇[圖6（c）和表S6]。來自簇1的60個磷酸化修飾蛋白強度在最初的24 h內(nèi)保持不變，然后從24 h到48 h之間開始增加，提示它們在后期維持去分化狀態(tài)中起著重要作用。根據(jù)GO-CC分析，該簇中的蛋白質(zhì)多定位于細胞骨架。KEGG分析它們與緊密連接和局部黏附有關（圖S15）。簇2中磷酸化修飾蛋白強度在最初的12 h內(nèi)未改變，隨之急劇下降，12 h之后再保持穩(wěn)定。GO-BP分析表明，TGF-β2（可促上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）的生成在該簇中富集[40][圖6（d）]。相反，GO-CC分析發(fā)現(xiàn)（圖S15），簇3中的磷酸化修飾蛋白在前24 h迅速增加，并且主要位于線粒體中。這一發(fā)現(xiàn)與Wanet等[45]的研究結(jié)論相一致，他們證明了線粒體重塑在人類肝臟去分化過程中不可或缺的作用。KEGG分析顯示，許多代謝途徑，包括脂肪酸生物合成、氮代謝和精氨酸生物合成，在簇3中富集（圖S15）。此外，一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡類型——鐵死亡——也在簇3中富集，這一現(xiàn)象將在后面進行討論（圖S15）。

3.7. 原代肝細胞體外去分化過程中泛素化修飾和磷酸化修飾的共同調(diào)節(jié)

總之，我們一共定量了404種同時具有泛素化和磷酸化修飾位點的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中71%具有多個泛素化或多磷酸化修飾位點[圖7（a）、（b）]。我們將泛素化和磷酸化位點同時發(fā)生明顯變化的蛋白質(zhì)定義為“共同調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)”（FC ＞ 1.5）。按照這一標準，我們在所有時間點中共鑒定出32種共調(diào)節(jié)蛋白[圖7（c）]。為了揭示去分化過程中32個共調(diào)節(jié)蛋白中的關鍵蛋白，我們進行了PPI網(wǎng)絡分析，然后通過5種不同的cytoHybba排序方法找尋潛在的hub蛋白[33,46]（表1）。最后，我們找到了4個hub分子，包括Ptbp1、Hnrpd、Hnrnpu和Srrm2[圖7（d）]。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)，它們的蛋白質(zhì)水平是不變的，但是它們的泛素化位點顯著上調(diào)，并且伴隨著磷酸化位點增加[圖7（e）、（f）和圖S16]。這表明與蛋白質(zhì)水平相比，翻譯后修飾會發(fā)揮更重要的作用。UniProt數(shù)據(jù)庫顯示Hnrpd調(diào)控肝細胞去分化過程，我們的研究結(jié)果與此一致。

4. 討論和結(jié)論

圖6. 原代肝細胞體外培養(yǎng)去分化過程中磷酸化蛋白質(zhì)組學的動態(tài)變化。（a）維恩圖顯示各時間點間發(fā)生顯著性變化的磷酸化位點的交集。 （b）顯示兩個同時具有上調(diào)和下調(diào)的磷酸化修飾位點的蛋白質(zhì)。（c）具有顯著差異表達的磷酸化蛋白質(zhì)的時間序列分析。（d）聚類2中磷酸化修飾蛋白的生物學功能分析。

圖7. 原代肝細胞體外培養(yǎng)去分化過程中的共修飾蛋白譜。（a）維恩圖顯示泛素化蛋白組和磷酸化蛋白組之間的交集。（b）柱狀圖顯示單位點和多位點泛素化及磷酸化修飾蛋白的數(shù)目。（c）維恩圖顯示各時間點之間同時具有泛素化修飾和磷酸化修飾的蛋白質(zhì)交集。（d）維恩圖顯示五種不同的算法預測的hub分子間的交集。（e）柱狀圖顯示各時間點上Hnrnpu分子中泛素化修飾位點和磷酸化修飾位點的變化情況。（f）柱狀圖顯示各時間點上Hnrpd分子中泛素化修飾位點和磷酸化修飾位點的變化情況。*, **, ***, ****分別表示與0 h相比，P ＜ 0.05, 0.01, 0.001和0.0001；誤差線表示均值±標準差。MCC：最大團中心性。EPC：邊緣擴散組件。

表1 從共調(diào)節(jié)蛋白鑒定出的hub蛋白

關于人及其他動物原代肝細胞去分化過程中的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學研究已經(jīng)有大量報道，這些研究為揭示肝細胞去分化的潛在機制提供了許多有價值的見解。但是只有少數(shù)研究關注了翻譯后修飾在這一過程中的作用[2,4,10,37,47]。在這項研究中，我們聯(lián)合了轉(zhuǎn)錄組、全蛋白質(zhì)組、泛素化和磷酸化修飾組，擴展了對肝細胞去分化的現(xiàn)有認識。需要注意的是，盡管使用人原代肝細胞樣本對這項研究更有價值，但使用大鼠肝細胞仍舊是一個必然選擇。通常細胞中的泛素化修飾蛋白含量極低，必須有大于10 mg的蛋白質(zhì)量來滿足質(zhì)譜檢測的最低限值。此外，為了提高泛素化多肽鑒定率，蛋白酶體抑制劑MG132被廣泛用于提高泛素化修飾位點的水平[48,49]。然而，MG132可以影響細胞周期和細胞應激相關的途徑，而對蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)生影響[50,51]；因此，它破壞了細胞內(nèi)的原始真實狀態(tài)，可能導致與實際狀態(tài)不同的結(jié)果。因此，我們決定實驗過程中不使用MG132，以避免這種可能的干擾。這一方案無疑增加了檢測泛素化位點的難度。體外原代肝細胞的自發(fā)凋亡和非增殖特性也使培養(yǎng)過程中蛋白質(zhì)量逐漸減少[8]。綜合以上些因素，幾乎不可能從人類供體中獲得足夠量的肝細胞來開展泛素化修飾組學研究。

考慮到細胞中泛素化修飾蛋白的低化學豐度，我們利用TMT標記的累積效應。為了精確定量具有較低豐度的修飾蛋白質(zhì)（位點），我們將super-SILAC與樣品的比例從1:1降低到1:10，并從整體水平上對蛋白質(zhì)（位點）水平進行校正[52,53]?？偟膩碚f，我們的研究提供了肝細胞去分化過程中泛素化修飾和磷酸化修飾水平的動態(tài)圖譜。通過蛋白質(zhì)豐度和基因轉(zhuǎn)錄的聯(lián)合分析，我們揭示了它們之間的低相關性。在許多其他研究中也觀察到了類似的現(xiàn)象，如CD4+T細胞激活，這表明mRNA和蛋白質(zhì)表達之間的非同步性是一種常見的現(xiàn)象，PTM可能在這一生物學過程中發(fā)揮重要作用[54-56]。作為生物功能的最終執(zhí)行者，蛋白質(zhì)及其修飾應該得到更深入的研究。應該注意的是，在不添加蛋白酶體抑制的情況下，我們的泛素化數(shù)據(jù)集可能只代表了豐度相對較高的泛素化修飾位點，而可能忽略了那些豐度相對較低的泛素化位點。另一個需要解決的問題是，我們無法識別泛素化位點上泛素鏈的具體類型及空間結(jié)構(gòu)。如何以良好的富集效率保持泛素鏈與底物之間共價連接的完整性仍有待探索。在整合泛素化修飾組和WCP后，我們發(fā)現(xiàn)在去分化過程中K27介導的非降解性泛素化增加。應該注意的是，二甘氨酸殘基也來自泛素樣蛋白，包括NEDD8和ISG15 [57]，NEDDylated或ISGylated殘基在我們的泛素化蛋白質(zhì)組學中的貢獻度仍需要進一步評估。對磷酸化蛋白質(zhì)組進行GO分析后，我們發(fā)現(xiàn)鐵死亡可能參與去分化過程。為了驗證去分化過程中的鐵死亡的作用，需要進一步關注活性氧（ROS）的積累、無染色質(zhì)濃縮的正常大小的細胞核以及具有退化嵴特定形態(tài)特征的致密微型線粒體[58,59]。

PTM之間的交流增加了信息處理的特異性和復雜性，這一領域仍然缺乏大規(guī)模的研究。目前，PTM間交流主要有三種類型：

（1）同一條肽上出現(xiàn)兩個以上的PTM。由于酶消化后氨基酸序列相對較短，使得其很難被檢測到[25]。

（2）在擾動后或在一個時間依賴過程中，一個蛋白質(zhì)上相繼或同時出現(xiàn)兩個或兩個以上的修飾。然而，PTM發(fā)生的真實順序以及它們?nèi)绾螀f(xié)調(diào)仍不清楚[25]。

（3）修飾發(fā)生在空間上相互接近而非序列上相互靠近的不同蛋白質(zhì)上。

在我們的數(shù)據(jù)集中，我們沒有檢測到類型（1）。類型（3）可以在相關進化學的幫助下進行分析[60]。

總的來說，這些有價值的數(shù)據(jù)集揭示了肝細胞去分化的動態(tài)泛素化和磷酸化修飾的改變。我們的工作為進一步研究去分化機制，奠定了重要的基礎，從而為拓寬原代肝細胞的體外應用提供可能。

致謝

本工作得到了國家重點研究發(fā)展項目（2016YFC1101304/3）、國家自然科學基金（81400589，81790630，81790633）和中國醫(yī)學科學院傳染病與微生態(tài)研究所（2019RU021）支持。

Compliance with ethics guidelines

Zhengyi Jiang, Zeyu Sun, Xiaoxi Ouyang, Yalei Zhao, Menghao Zhou, Baohong Wang, Qirui Li, Linxiao Fan, Sainan Zhang, and Lanjuan Li declare that they have no conflicts of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.02.011.