70株臨床分離腸球菌的毒力基因檢測(cè)與耐藥性分析

白耀霞 任建元

重慶市渝東衛(wèi)生學(xué)校，重慶 408300

腸球菌是一種常見的條件致病菌，可引起人類多種傳染病。近年來，腸球菌導(dǎo)致的院內(nèi)感染及死亡率明顯增加[1]，因此要對(duì)其引起的感染給予足夠的重視。本研究收集臨床感染的腸球菌，檢測(cè)分離菌株的毒力基因及分離株對(duì)常用抗生素的耐藥情況，然后分析腸球菌毒力基因與耐藥性二者之間的相關(guān)性，旨在為腸球菌臨床感染抗菌藥物治療提供重要指導(dǎo)，為腸球菌致病機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

表1 本研究所用引物

1 資料與方法

1.1 一般資料

試驗(yàn)菌株（70株非重復(fù)腸球菌）由蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院惠贈(zèng)，分離自蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年3月～2018年7月的臨床標(biāo)本。菌株均已經(jīng)法國Bio-Merieux公司vitek 2 Compact 60生化鑒定或法國Bio-Merieux公司vitek MS質(zhì)譜鑒定。藥敏紙片為青霉素G、萬古霉素、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、替考拉寧、氨芐西林、慶大霉素120、四環(huán)素，部分菌株采用法國Bio-Merieux公司vitek 2 AST-GP67藥敏卡藥敏分析。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）、AST-GP67陽性菌藥敏卡對(duì)分離的70株腸球菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。試驗(yàn)操作過程和結(jié)果判斷參考CLSI M100 《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》2017年版本標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 制備腸球菌DNA模板 采用水煮法制備腸球菌DNA模板：刮取血平板上新鮮培養(yǎng)物，加入有200μL滅菌蒸餾水的1.5mL EP 管內(nèi)，混勻，100℃煮沸15min，離心機(jī)12000rpm離心5min，取出上清液，即為DNA模板。于-20℃保存。

1.2.3 毒力基因的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系25μL。組成為：T3 Mix 21μL，上、下游引物各1μL，模板2μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，退火30s（退火溫度見表1），72℃ 10s，30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸1min。引物由重慶擎科生物有限公司合成，引物序列、產(chǎn)物片段大小見表1。PCR產(chǎn)物電泳后，根據(jù)片段大小進(jìn)行判斷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0軟件統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。利用雙變量相關(guān)性分析對(duì)分離株的多種耐藥率和毒力基因數(shù)關(guān)系進(jìn)行分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

臨床標(biāo)本分離得到的70株腸球菌，其中糞腸球菌為39株，所占比例為55.71%，屎腸球菌為31株，所占比例為44.29%。

2.1 腸球菌對(duì)8種抗菌藥物的敏感性結(jié)果

對(duì)腸球菌藥敏試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)所用的8種臨床常用抗生素中，均有腸球菌耐藥菌株的出現(xiàn)（見表2）。腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素、青霉素G、氨芐西林、高濃度慶大霉素的表現(xiàn)出較高的耐藥 率，分 別 為70.00%、60.00%、48.57%、48.57%、47.14%；檢測(cè)到萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧的耐藥菌株；除高濃度慶大霉素、四環(huán)素、利奈唑胺外，屎腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星、青霉素G、氨芐西林、萬古霉素、替考拉寧的耐藥率分別為90.32%、87.10%、87.10%、16.13%、12.90%，明顯高于糞腸球菌（P＜0.05）。

表2 糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥率

表3 分離菌株的毒力基因分布

2.2 PCR擴(kuò)增9對(duì)毒力基因結(jié)果

PCR擴(kuò)增分別檢測(cè)每株腸球菌9個(gè)毒力基因的攜帶情況，如圖1為1株屎腸球菌（編號(hào)為607）攜帶9個(gè)毒力基因的情況。如圖1所示：ace、cpd、asa-I、esp、cyIL-A、cyIL-S、cyIL-L檢測(cè)結(jié)果為陽性，gelE、acm檢測(cè)結(jié)果為陰性。統(tǒng)計(jì)每個(gè)菌株的PCR結(jié)果（見表3）。結(jié)果顯示，70株腸球菌對(duì)cylL-L、cylL-S、cylL-A、ace、asa-I、acm、cpd、esp、gelE 9個(gè)毒力基因的攜帶率最高的是esp（61.43%），其次是acm（47.14%）；糞腸球菌和屎腸球菌對(duì)cylL-L、cylL-S、cylL-A、ace、cpd、gelE的攜帶率均為糞腸球菌高于屎腸球菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 菌株Efa607毒力基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖上樣順序：

分別研究糞腸球菌與屎腸球菌的耐藥性與所攜帶毒力基因的相關(guān)性，結(jié)果顯示：糞腸球菌和屎腸球菌的毒力基因與耐藥性之間無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

近年來，腸球菌的多重耐藥性為醫(yī)院感染治療帶來重重困難。世界衛(wèi)生組織報(bào)道，萬古霉素耐藥腸球菌VRE（Vancomycin Resistant Enterococci）比例在近四年內(nèi)呈顯著升高趨勢(shì)[2]。腸球菌感染已為全球感染控制帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

本研究初步探索了蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2014年3月～2018年7月腸球菌的菌株流行、耐藥變遷及毒力基因分布情況。所用70株腸球菌來自門診與住院患者不同感染類型。總體而言，糞腸球菌所占比例較屎腸球菌略高；糞腸球菌攜帶的毒力基因更多，而屎腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性更強(qiáng)，表現(xiàn)出的耐藥問題更為突出。這與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道相似[3-4]。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看，出現(xiàn)了5株對(duì)萬古霉素耐藥的屎腸球菌，這與本區(qū)域四年前的報(bào)道有所不同[4]。同時(shí)，這5株屎腸球菌對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林及高濃度慶大霉素均表現(xiàn)為耐藥，而對(duì)利奈唑胺均表現(xiàn)為敏感，為此建議臨床嚴(yán)格控制萬古霉素的適應(yīng)證，防止和減慢VRE的產(chǎn)生與傳播。此外，分離菌株中糞腸球菌的耐藥性與屎腸球菌存在差異，屎腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星、青霉素G、氨芐西林顯示出很高的耐藥率，分別為90.32%、87.10%、87.10%；除高濃度慶大霉素和四環(huán)素外，屎腸球菌對(duì)其他7種抗菌藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這為臨床科學(xué)合理選用抗生素提供指導(dǎo)。

由位于致病島區(qū)域的溶血素基因cylL-L、cylL-A及cylL-S等編碼的溶細(xì)胞素Cyl（cytolysin）是一種細(xì)菌外毒素。它通過溶解宿主的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞而產(chǎn)生免疫逃逸[5]。有研究報(bào)道：cyl陽性的糞腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率明顯高于cyl陰性的糞腸球菌[6]。Miyazakis等發(fā)現(xiàn)：cyl陽性的糞腸球菌對(duì)萬古霉素敏感性明顯高于cyl陰性的糞腸球菌[7]。這提示cyl的存在可能與糞腸球菌對(duì)萬古霉素敏感有關(guān)。Miyazakis等及國內(nèi)報(bào)道稱：糞腸球菌cyl的陽性率明顯高于屎腸球菌。本研究結(jié)果與其一致[2，7]。

糞腸球菌信息素誘導(dǎo)的質(zhì)粒在液體培養(yǎng)基中的高頻率轉(zhuǎn)移與聚集物質(zhì)的形成有關(guān)；聚集物質(zhì)Asa1（Aggregation factor）由質(zhì)粒編碼的聚集體AS和由染色體編碼的表面組分BS相互作用產(chǎn)生[6]。asa-I編碼聚集體AS參與細(xì)胞之間的粘附作用而使致病質(zhì)粒發(fā)生轉(zhuǎn)移或感染[8]。Baylan等研究表明：asa-I和esp為尿路感染攜帶率最高的基因（陽性率分別為26.7%、25.6%），且發(fā)現(xiàn)asa-I陽性的糞腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星的耐藥率高于asa-I陰性的分離株[9]。本研究結(jié)果顯示糞腸球菌該基因攜帶率明顯高于屎腸球菌，與國外報(bào)道結(jié)果一致[10]。

研究表明，表面蛋白Esp（Enterococci surface protein）與腸球菌在宿主細(xì)胞內(nèi)定植及延長(zhǎng)腸球菌在膀胱內(nèi)的停留時(shí)間有關(guān)[10]。屎腸球菌膠原蛋白黏附素Acm（adhesin of collagen from E.faecium）是由acm基因表達(dá)的一種能夠黏附在細(xì)胞壁上的黏蛋白，其黏附能力的高低被認(rèn)為與屎腸球菌的臨床感染能力密切相關(guān)[11]。在本研究中esp的陽性率最高，占61.42%，acm次之，占47.14%。這與國外報(bào)道結(jié)果一致[6]。Mete等研究發(fā)現(xiàn)esp在對(duì)萬古霉素耐藥的屎腸球菌中陽性率為24%，而在對(duì)萬古霉素耐藥的糞腸球菌中未檢測(cè)到該基因[8]。

膠原蛋白粘附素Ace（Adhesin to collagen from Enterococci faecalis）介導(dǎo)腸球菌的表面黏附。ace位于腸球菌染色體上。本研究中，糞腸球菌ace的陽性率高達(dá)69.23%，而在屎腸球菌中該基因的攜帶率僅為3.23%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與國外類似報(bào)道結(jié)果一致[15]。近年ace的研究備受關(guān)注，報(bào)道顯示：ace的表達(dá)受雙組分系統(tǒng)GrvR（EtaRS）和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PrfA的重要調(diào)控，利用ace缺失突變體和互補(bǔ)株研究表明ace與糞腸球菌的毒力有密切關(guān)系[12-13]；Ace單抗在腸球菌感染的大鼠心內(nèi)膜炎模型中，可降低糞腸球菌主動(dòng)脈瓣感染[14]。

腸球菌明膠酶gelE（gelatinase）可以降解宿主細(xì)胞的膠原蛋白或組織蛋白，其降解機(jī)制與腸球菌或其致病因子向周圍擴(kuò)散感染有關(guān)[16]。文獻(xiàn)報(bào)道gelE陽性率在19.6%到80.4%之間[17-19]。在本研究中，gelE基因陽性率為35.71%。國外研究報(bào)道糞腸球菌gelE基因陽性者對(duì)氨芐西林的抗性明顯高于不含這些基因的菌株，與不攜帶該基因的分離株相比，糞腸球菌gelE陽性菌株對(duì)環(huán)丙沙星、替考拉寧和萬古霉素的敏感性顯著增加[6]。毒力基因cpd編碼的腸球菌信息素是一種能夠與供體菌發(fā)生結(jié)合而表達(dá)聚集物質(zhì)的脂蛋白[20]。經(jīng)PCR檢測(cè)顯示cpd攜帶率糞腸球菌相對(duì)屎腸球菌較低，這與國外一些報(bào)道結(jié)果一致[21-22]。

綜上所述，由于腸球菌具有多種毒力因子及其細(xì)胞壁比較堅(jiān)硬等特點(diǎn)，所以在醫(yī)院感染中比較常見。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：糞腸球菌和屎腸球菌對(duì)常用抗生素具有不同的耐藥率，屎腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性更強(qiáng)，為臨床合理利用抗菌藥物提供了重要指導(dǎo)；分離出的5株耐萬古霉素腸球菌均為屎腸球菌，這說明糞腸球菌所含毒力基因?qū)θf古霉素更敏感，提示對(duì)糞腸球菌毒力基因的研究可能成為治療耐萬古霉素腸球菌感染的關(guān)注點(diǎn)。毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌攜帶的毒力基因更多。毒力基因攜帶與耐藥性之間相關(guān)性分析得出結(jié)論兩者無相關(guān)性，但由于目前腸球菌的感染機(jī)制尚未明確，因此還需要進(jìn)一步研究。