改良伸直位制動法建立兔膝骨關節(jié)炎模型的效果評價

何業(yè)文，范 磊，張 堃，張成芳，高 輝，黎建宇，粟昌金，戴林軍，謝晨輝

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院放射科，湖南 長沙 410007）

骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見的骨關節(jié)病，主要病因是軟骨退變［1］。相關研究［2］顯示，我國OA 的發(fā)病率約8.3%，65 歲以上人群放射學OA 的發(fā)病率高達50.0%。目前，OA 發(fā)病及治療干預機制的前期研究都依賴于動物實驗，因此，建立一種可行、可靠的動物模型對OA 的研究具有十分重要的意義。制動法OA 模型在模擬OA 病理生改變、藥物篩選、療效評價方面具有較大優(yōu)勢，但經(jīng)典的制動法存在造模時間長、制動管型易咬除脫落、并發(fā)癥較多等問題，因此本研究對伸直位制動法進行了改良，成功制備了兔膝關節(jié)OA 模型，現(xiàn)闡述如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇新西蘭大白兔27 只（湖南中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供），體質量（2 035±167）g；雄性14 只，雌性13 只；適應性喂養(yǎng)1 周；隨機分為2組，A 組9 只，制動2 周；B 組18 只，制動6 周。本實驗經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院倫理委員會批準（倫理審查備案號2017-0021）。

1.2 實驗器械 兔架、電子秤、醫(yī)用高分子固定繃帶（蘇州元康醫(yī)療器械有限公司）、壓舌板、繃帶、紗布、石膏剪、手術刀、手術剪、骨剪、鑷子和動物用去毛剪等。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法 ①造模前準備：將實驗兔斜俯臥位固定于實驗臺，向后上方拉直右下肢。去毛剪去毛，范圍為右側髖關節(jié)至踝關節(jié)。醫(yī)用碘伏消毒裸露皮膚，如有皮膚損傷，止血消毒后，用醫(yī)用紗布包扎。②造模：伸直右下肢膝關節(jié)，同側踝關節(jié)保持正常生理曲度。用繃帶將壓舌板纏繞固定于右下肢內側，再用醫(yī)用膠帶加固，壓舌板上端距髖關節(jié)1～2 cm，下端超過踝關節(jié)。后依次纏繞多層紗布和4 層醫(yī)用高分子固定繃帶，高分子固定繃帶纏繞松緊適中，纏繞方式為重疊二分之一螺旋狀纏繞，纏繞區(qū)域為髖關節(jié)至踝關節(jié)以下4～5 cm，裸露遠端腳趾以便后續(xù)觀察。高分子固定繃帶管型在踝關節(jié)處呈“L”型，角度為120°～150°。姿勢固定4～5 min 以待管型定型。確定姿勢固定滿意、管型位置、形態(tài)符合要求、無其他損傷后，將實驗兔放回兔籠。一兔一籠，按照實驗兔標準喂養(yǎng)，允許其在籠內自由活動和進食，飼養(yǎng)環(huán)境適宜。若管型脫落，立即重新固定；若管型過緊、遠端肢體淤血腫脹等，立即拆除管型，待患肢情況好轉后重新固定。

1.3.2 造模效果評價 造模后2 周和6 周以空氣栓塞法分別處死A 組和B 組實驗兔。以前上方入路分別解剖右側制動膝關節(jié)和左側對照膝關節(jié)，觀察膝關節(jié)有無感染、潰爛等情況，剔除周圍肌肉和韌帶等附屬組織，暴露股骨和脛骨平臺關節(jié)軟骨、半月板。大體觀察股骨內外側髁關節(jié)軟骨情況，并取股骨內側髁后部關節(jié)軟骨，以10%甲醛固定48 h，再脫水、包埋，切片后HE 染色觀察關節(jié)軟骨退變情況。

1.3.3 造模并發(fā)癥評價 造模前記錄實驗兔體質量，每天觀察實驗兔肢端血液循環(huán)、近端皮膚磨損、姿勢、制動管型脫落和咬除等情況。每周測量一次體質量。若出現(xiàn)感染，可使用抗生素治療。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示。對體質量等測定結果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，完全隨機設計多組比較用LSD 和Dunnett 法，不滿足方差分析條件時采用單因素非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis 檢驗）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2 組一般情況評價 A 組造模前和處死前體質量分別為（1 932±91）、（1 623±213）g，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。B 組造模前和處死前體質量分別為（2 087±177）、（1 851±393）g，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 骨關節(jié)炎造模效果 實驗兔右膝關節(jié)姿勢固定滿意、制動效果良好，未出現(xiàn)制動管型被咬除、脫落情況，可自由移位和進食進水。

大體病理所見股骨軟骨受損部位穩(wěn)定，位于股骨內外側髁后部，股骨內側髁軟骨病變中心距離內側骨緣5～7 mm。A 組右膝關節(jié)見關節(jié)囊增厚并關節(jié)滑膜充血，關節(jié)腔積液增多，股骨內外側髁后部關節(jié)軟骨色澤暗淡不均且發(fā)紅，表面光整（圖1a）；HE染色見軟骨表面局部不規(guī)則淺裂隙形成，軟骨細胞數(shù)量減少、局部成簇增生、結構紊亂，基質染色變淺，潮線完整（圖2a）。B 組右膝關節(jié)明顯僵直，關節(jié)滑膜增厚并部分填充到關節(jié)腔內，大部分關節(jié)腔積液增多、黏稠，少部分關節(jié)腔積液減少，股骨內外側髁后部關節(jié)軟骨失去光澤、顏色不均、發(fā)紅，較2 周時更明顯，表面不光整，可見不同程度斑片狀關節(jié)軟骨缺損，部分可見軟骨下骨暴露（圖1b）；HE 染色見軟骨表面不完整，大量潰瘍形成，大部分深達軟骨鈣化層，軟骨4 層結構顯示不清，軟骨細胞顯著減少且形態(tài)、大小不同程度改變，部分標本表層、移行層細胞稀疏，部分潮線消失（圖2b）。對照側關節(jié)軟骨透亮，色澤均勻，表面光整（圖1c）；HE 染色軟骨細胞未見明顯改變，細胞呈圓形，散在分布，潮線完整，基質染色正常（圖2c）。

2.3 并發(fā)癥 造模過程中，3 只實驗兔死亡，A 組1只，B 組2 只，3 只均出現(xiàn)明顯消瘦和持續(xù)腹瀉。所有造模動物均未出現(xiàn)嚴重淤血所致制動管型拆除、開放性骨折和明顯感染、破潰，未出現(xiàn)制動管型脫落、咬除和近端嚴重皮膚磨損等現(xiàn)象。

3 討論

OA 動物模型的造模方式主要包括手術法、自發(fā)OA 模型、非手術法［3］。其中手術是目前最常用的造模方式［4］，包括關節(jié)腔內手術（交叉韌帶切斷法［5］、半月板切除法［6］、關節(jié)軟骨劃痕法［7］等）、關節(jié)腔外手術（臀肌切斷法［8］、卵巢切除法［9］、下肢靜脈結扎法［10］等）。手術法方法可靠、造模時間短，但對生理結構破壞較大，不利于模擬慢性OA 病理過程和進行藥物治療相關研究。自發(fā)OA 模型是通過篩選具有自發(fā)OA傾向的實驗動物（Hartley 豚鼠、B6C3F1 栗鼠等［11-13］）或通過基因敲除誘導小鼠自發(fā)OA［14］。其優(yōu)點是可充分模擬OA 的病理改變、模型病理生理穩(wěn)定，對療效評估等研究也有優(yōu)勢，但造模時間長、成本高。非手術方法包括制動法、關節(jié)撞擊法、關節(jié)腔內注射藥物法等［15-16］。其中關節(jié)制動法既可模擬OA 的病理改變，又能避免手術和藥物注射對關節(jié)腔內環(huán)境的破壞，在藥物篩選和療效評估方面具有一定優(yōu)勢。

本實驗采用的伸直位制動法主要原理是通過關節(jié)制動限制關節(jié)的主被動活動，使跨越關節(jié)的肌肉和關節(jié)囊收縮、關節(jié)面壓力持續(xù)增高，造成關節(jié)軟骨變性、壞死和關節(jié)軟骨下骨骨質增生［17］。但也具有以下缺陷：①因石膏管型過于寬松或動物啃咬破壞，管型脫落的發(fā)生率較高，需反復固定，導致造模工作繁重、模型穩(wěn)定性欠佳、實驗耗材多。②制動法造模相關并發(fā)癥較多，主要包括遠端肢體血運障礙、動物一般情況差等［18-19］，造模成功率較低并增加了實驗成本。③大部分文獻［6，15，18-19］報道，制動法造模造模時間較長，需4～6 周才可達到早期OA 的效果，中期OA效果需7～10 周，明顯長于手術法的造模時間。針對以上問題，很多學者對伸直制動法進行了改良。熊勇等［20］使用伊麗莎白圈防止石膏被啃咬并在左下肢內側安置小鋁板，固定牢靠、成功率高，但自制伊麗莎白圈因實驗動物消瘦而變得過大或過松，影響效果，同時伊麗莎白圈會干擾實驗兔自由活動和進食，增加局部皮損風險。

本實驗對經(jīng)典伸直制動法進行了以下改良：①采用醫(yī)用高分子固定繃帶。相較于傳統(tǒng)醫(yī)用石膏，醫(yī)用高分子固定繃帶具有良好的抗啃咬性能。4 層及以上高分子固定繃帶可有效減少石膏咬脫，但6 層及以上高分子固定繃帶會增加拆除難度和損傷風險。因此，采用4 層高分子固定繃帶，既能有效制動、防止啃咬脫落，又可方便拆除，可行性較高。②采用“L”型管型。與傳統(tǒng)直型管型不同，“L”型管型可通過踝關節(jié)處的自然彎曲和骨性突起，有效限制管型向下移動和滑脫，極大地降低了脫落概率。③使用壓舌板共同制動。右下肢內側增加壓舌板作為姿勢固定和制動組件，確保膝關節(jié)處于伸直位，避免了不同操作者和不同位置關節(jié)軟骨對實驗效果可能造成的影響。④無需麻醉，通過人工按壓即可完成造模，避免了麻醉對實驗兔的損傷。

通過以上改良，既保持了伸直位制動的優(yōu)勢，又克服了部分缺陷：①改良伸直制動法模擬OA 的病理改變，縮短了造模所需時間，制動2 周即可觀察到輕度關節(jié)軟骨退變，第6 周退變程度可達中晚期OA的程度，提示僅需控制制動時間，就可模擬不同程度的關節(jié)軟骨退變，滿足各種實驗的需求。②伸直制動法造模效果可靠，成功率高。本實驗所有造模側實驗標本均出現(xiàn)不同程度的軟骨退變，A、B 組內部關節(jié)退變程度基本保持穩(wěn)定，如A 組受累區(qū)域關節(jié)軟骨肉眼下以顏色改變?yōu)橹鳎匆娒黠@缺損、HE 染色觀察軟骨退變主要累及淺層，潮線均完整；B 組受累區(qū)域關節(jié)軟骨可見不同程度缺損，HE 染色可見深大潰瘍形成、均累及鈣化層、軟骨4 層結構顯示不清，潮線大部分或全部消失，退變位置相對固定，未出現(xiàn)因制動管型脫落、咬除或嚴重淤血、破潰而需重新固定的情況。③制動法在保證造模效果的同時，避免了手術和藥物對關節(jié)腔內結構的破壞，同時制動裝置未使用金屬，對影像學研究的開展十分有利。

本實驗造模過程中3 只動物死亡，原因可能為：運輸過程的高溫環(huán)境和變換飼養(yǎng)環(huán)境使部分實驗兔適應性喂養(yǎng)階段就出現(xiàn)腹瀉及進食、活動較差；造模過程對實驗兔造成了驚嚇、損傷等；制動后，實驗兔主動活動、進食、飲水受到干擾，足趾末端血運障礙等并發(fā)癥對其造成一定影響。

綜上所述，改良伸直制動法是一種簡單易行、成功率高、實驗過程靈活可控的OA 造模方法，尤其在藥物篩選、療效評估、影像評估等方面具有較大優(yōu)勢。

圖1 不同制動時間股骨髁關節(jié)軟骨大體病理圖 圖1a 制動2 周時，股骨內外側髁后部關節(jié)軟骨色澤暗淡不均且發(fā)紅，表面光整 圖1b 制動6 周時，股骨內外側髁后部關節(jié)軟骨表面不光整、不同程度軟骨缺損和軟骨下骨暴露 圖1c 正常對照，關節(jié)軟骨透亮，色澤均勻，表面光整圖2 不同制動時間股骨髁關節(jié)軟骨HE 染色圖（×100）圖2a 制動2 周時，軟骨表面局部不規(guī)則淺裂隙形成，軟骨細胞數(shù)量減少并局部增生、基質染色變淺，潮線完整 圖2b 制動6 周，軟骨大量潰瘍形成，深達軟骨鈣化層，軟骨4 層結構顯示不清，軟骨細胞顯著減少且形態(tài)、大小不同程度改變，潮線消失 圖2c 正常對照，軟骨細胞未見明顯改變，潮線完整，基質染色正常