銀杏提取物50通過調(diào)節(jié)自噬降低ROS水平保護高糖對血管內(nèi)皮細胞的損傷作用

姚 媛

(四川大學華西第四醫(yī)院，成都 610011)

糖尿病，作為一種以高血糖為特征的慢性代謝紊亂，對人類的生命和健康造成嚴重威脅。今年來糖尿病逐漸發(fā)展成為一個全球性的衛(wèi)生問題，目前亞洲糖尿病的患病總人數(shù)超過2.3億(約占世界糖尿病患病人數(shù)的55%)，預計到2040年，這一數(shù)字將超過3.55億[1]。由于長期存在的高血糖，糖尿病可導致各種組織，尤其是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害等并發(fā)癥[2]。內(nèi)皮細胞功能障礙是Ⅱ型糖尿病常見的并發(fā)癥之一，患者對胰島素的不敏感化可加速動脈粥樣硬化病變和血管功能障礙，從而增加心血管疾病的發(fā)生風險[3-4]。長期高糖環(huán)境暴露可破壞內(nèi)皮細胞內(nèi)代謝平衡，現(xiàn)在的研究顯示，血管內(nèi)皮細胞損傷與糖尿病微血管病變密切相關。高糖水平下導致眼部血管內(nèi)皮細胞損傷從而引起視網(wǎng)膜病變，或抑制四肢血管生成，導致傷口愈合緩慢引發(fā)足部潰瘍[5]。

銀杏提取物50(Ginkgo Biloba Extract 50，GBE50)是一種新型銀杏葉提取物， 現(xiàn)在研究分析發(fā)現(xiàn)GBE50含有44.1%銀杏黃酮糖苷和6.4%的銀杏內(nèi)酯，且銀杏酸含量低于5 ppm[6]。一些研究表明，GBE50具有抗氧化和抗炎作用，并已用于老年人群心血管疾病的預防或治療[7]。有文獻報道，GBE50可通過抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)ROS生成起到抗凋亡作用[8]，然而在高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs的作用未見報道[9]。

本研究主要通過高葡萄糖(glucose)濃度建立細胞高糖環(huán)境，通過MTT法研究了GBE50對HUVECs細胞活性的影響，通過熒光反應法研究了谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)的含量變化，通過流式細胞實驗研究了HUVECs中活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量和GBE50對細胞自噬的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞系HUVECs購自美國ATCC(ATCC-CRL-1730TM)公司。

1.2 主要試劑與儀器

GBE50購自中國山西千匯藥業(yè)有限公司(0004320181202)。免疫熒光中鼠兔抗Anti-LC3等抗體均購買自美國Abcam公司。細胞培養(yǎng)實驗中胎牛血清(FBS)以及DEME培養(yǎng)基購買自美國Hyclone，青霉素和鏈霉素購買自美國Invitrogen。MTT和實驗中其它試劑均購自美國Sigma。細胞培養(yǎng)箱購買自美國Thermo(3111)，酶標儀購自美國Bio-Rad，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus(IX51)，流式細胞儀購自美國BD(FACSAria III)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與處理

HUVECs細胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。 DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，100 U/mL青霉素或100 μg/mL鏈霉素。取對數(shù)期細胞轉(zhuǎn)移至96孔板，在培養(yǎng)基中營造正常(5×10-3mol/L葡萄糖)和高糖環(huán)境(3×10-2mol/L葡萄糖)。GBE50以二甲基亞砜溶解后添加至培養(yǎng)基(9×10-2mol/L)，培養(yǎng)72 h后進行相關細胞實驗。

1.3.2 MTT

用MTT法檢測細胞活性。取對數(shù)期細胞接種于96孔板，培養(yǎng)基中加入5×10-2mol/L培養(yǎng)24 h，加入MTT溶液室溫孵育4 h，隨后加入DMSO溶解結晶。10 min后測量570 nm 處OD值。

1.3.3 GSH檢測

為了檢測谷胱甘肽的活性，通過特異性染料CMAC標記谷胱甘肽。取對數(shù)生長期細胞，以1×103密度接種在6孔板。培養(yǎng)一段時間后棄去培養(yǎng)基加入藍色CMAC染料 (1∶1000)，在37℃下孵育20 min，PBS沖洗兩次。檢測353～446 nm處的熒光強度。

1.3.4 免疫熒光

取對數(shù)生長期細胞接種于8孔板。GBE50處理72 h后，甲醇固定10 min，1% BSA封閉，0.1% TRIton X-100洗滌，與兔抗LC3一抗(1∶200)室溫下孵育1 h。PBS洗滌后熒光顯微鏡下觀察，CellSense軟件分析。

1.3.5 MDC檢測

MDC是成熟自噬空泡的特異性標記物。為了觀察MDC標記的自噬空泡，將HUVECs與MDC溶液(5×10-5mol/L)在37℃下孵育。24 h收集細胞，用PBS洗滌2次，固定于4%多聚甲醛中。通過CellSense Software Ver.1.4采集熒光圖像。熒光強度通過流式細胞儀FACSCalibu測定，使用FlowJo軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

1.3.6 ROS檢測

熒光探針DCFH-DA可在細胞內(nèi)被氧化為高熒光化合物DCF，隨后進行流式分選測定ROS陽性細胞數(shù)目。細胞與10 μmol/L DCFH-DA在37℃下洗滌30 min，再用冰涼PBS洗滌兩次.用活細胞成像系統(tǒng)(奧林巴斯LCS系統(tǒng)，日本)對細胞熒光強度進行量化。采用流式細胞儀測定GBE50處理后細胞內(nèi) ROS含量。取對數(shù)生長期細胞，在48孔板中培養(yǎng)72 h。在室溫下，加入10 μmol/L DCFDA孵育30 min，用PBS洗滌3次。FACSCalibur流式細胞系統(tǒng)測量熒光強度，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡

收集細胞經(jīng)勻漿后，經(jīng)RIPA(碧云天，上海)裂解提取蛋白。通過BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，上海)測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，PVDF膜經(jīng)封閉后，室溫分別孵育一抗(1∶1000稀釋的LC3抗體，Cell Signaling Technology，美國)1.5 h，TBST洗膜3次后，室溫孵育1∶2000稀釋的二抗(HRP標記的IgG， Cell Signaling Technology，美國)45 min，TBST洗膜3次后，利用增強的ECL化學發(fā)光試劑盒(#P0018AS，碧云天，上海)對目的條帶顯影，以β-actin(#AF0003，碧云天，上海)為內(nèi)參，采用AlphaView軟件測量目的條帶的光密度。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 高糖環(huán)境下GBE50增強HUVECs細胞活性

首先，本研究通過MTT實驗研究了GBE50對高葡萄糖環(huán)境下HUVECs細胞活性的影響。實驗結果顯示，相比于正常培養(yǎng)環(huán)境組細胞，高糖環(huán)境下(3×10-2mol/L)HUVECs細胞活性顯著降低(圖1，P<0.001)，而GBE50處理后可顯著升高HUVECs細胞活性(P<0.01)。并且我們還發(fā)現(xiàn)，在低糖環(huán)境下(5×10-3mol/L)GBE50對HUVECs細胞活性并沒有影響。

注：GBE50可緩解高糖環(huán)境引起的細胞活性降低。與Glu5 mmol/L BE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/L GBE50-相比，**P <0.01。圖1 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs細胞活性的影響Note. GBE50 alleviated high glucose-induced cell viability decreasing.###P <0.001vs Glu5mmol/LGBE50-,**P <0.01 vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 1 Effect of GBE50 on cell viability of HUVECs in a high glucose environment

2.2 高糖環(huán)境下GBE50降低HUVECs中ROS生成

隨后本研究通過流式細胞實驗研究了HUVECs內(nèi)ROS產(chǎn)物的變化情況。DCF染色后流式細胞分析結果顯示，高糖處理可顯著升高HUVECs細胞ROS產(chǎn)物累積，ROS陽性細胞比例(圖2A、2B，P<0.001)，而GBE50處理后，HUVECs ROS陽性細胞比例明顯下降(P<0.05)。因此，GBE50可顯著降低HUVECs內(nèi)ROS產(chǎn)物生成水平。

2.3 高糖環(huán)境下GBE50升高HUVECs中GSH的表達

隨后本研究通過CMAC熒光反應研究了HUVECs中GSH的表達情況。實驗結果顯示，相比于正常培養(yǎng)條件下細胞，高糖環(huán)境下HUVECs中GSH熒光強度顯著降低(圖3A、3B，P<0.001)，而GBE50處理后可顯著升高GSH的表達(P<0.01)。

2.4 高糖環(huán)境下GBE50降低HUVECs細胞自噬

為了研究GBE50對HUVECs細胞自噬的影響，本研究通過丙二醛(Malondialdehyde，MDA)標記HUVECs自噬空泡，通過流式細胞實驗篩選MDA陽性細胞。實驗結果顯示，高糖環(huán)境可顯著升高HUVECs中MDA熒光密度(圖4A、4B，P<0.001)，說明高糖環(huán)境增強了細胞正常自噬。而GBE50處理后，MDC陽性細胞數(shù)顯著降低(圖4B，P<0.01)。因此，GBE50可顯著降低HUVECs在高糖環(huán)境下的自噬水平。

注：A：HUVECs中的ROS產(chǎn)物含量；B：ROS陽性細胞百分比。與Glu5 mmol/L GBE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/L GBE50-相比，**P <0.01。圖2 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs中ROS生成的影響Note. A， Representative flow cytometric analysis of ROS contents in HUVECs. B， Percentage of ROS-positive cells.###P<0.001vs Glu5mmol/LGBE50-,**P<0.01 vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 2 Effect of GBE50 on ROS content in HUVECs in a high glucose environment

注：A：GSH熒光染色示意圖；B：熒光密度統(tǒng)計圖。與Glu5 mmol/L GBE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/LGBE50-相比，**P <0.01。圖3 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs中GSH表達的的影響Note. A， Representative immunofluorescence images of glutathione (GSH). B， Fluorescence intensity of GSH in HUVECs.###P<0.001vs Glu5mmol/LGBE50-,**P<0.01vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 3 Effect of GBE50 on GSH expression in HUVECs in a high glucose environment

注：A：MDC陽性細胞流式細胞結果示意圖；B：MDC陽性細胞比。與Glu5 mmol/L GBE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/L GBE50-相比，**P <0.01。圖4 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs細胞自噬的影響Note. A, Representative flow cytometric analysis of MDC contents in HUVECs.B, Percentage of MDC-positive cells. ###P<0.001vs Glu5mmol/LGBE50-,**P<0.01vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 4 Effect of GBE50 on autophagy in HUVECs in a high glucose environment

2.5 高糖環(huán)境下GBE50降低HUVECs中LC3表達

為了進一步研究GBE50對HUVECs細胞自噬的影響，本研究通過免疫熒光實驗研究了微管相關蛋白1輕鏈3-β(microtubule-associated protein1light chain3-β,MAP1LC3-Ⅱ,LC3)的表達情況。免疫熒光實驗結果顯示，高糖環(huán)境下LC3熒光強度明顯升高(圖5A、5B，P<0.001)。而GBE50處理可顯著降低LC3熒光水平，統(tǒng)計結果顯示LC3陽性細胞比例明顯下降(圖5A、5B，P<0.01)。隨后，本研究使用蛋白印跡實驗觀察了LC3-II/LC3-I的表達水平，高糖處理時，LC3-II/LC3-I比值顯著增加而GBE50降低了LC3-II/LC3-I比值。以上結果進一步證明了GBE50可顯著降低細胞自噬水平。

注：A：LDC熒光染色示意圖；B：熒光密度統(tǒng)計圖；C：LC3-II/ LC3-I蛋白印跡實驗及其統(tǒng)計圖。與Glu5 mmol/L GBE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/L GBE50-相比，**P <0.01。圖5 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs中LC3表達的影響Note. A, Representative immunofluorescence images of LC3. B, Statistical results of LC-3 positive cells (%). C, Representative western blot of LC3-II/LC3-I and statistical results.###P<0.001 vs Glu5mmol/LGBE50-,**P<0.01 vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 5 Effect of GBE50 on LC3 expression in HUVECs in a high glucose environment

3 討論

本研究表明GBE50處理HUVECs能逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境對細胞的損傷作用，并能增強抗氧化能力。本研究結果顯示，GBE50對HUVECs的保護作用與降低細胞自噬水平相關。糖尿病是一組以慢性高血糖為主要特征的分泌代謝性疾病，主要分為Ⅰ型糖尿?、蛐吞悄虿『腿焉锾悄虿10]，近年來我國糖尿病的患病率正逐年提升。現(xiàn)在的研究認為，糖尿病是遺傳因素免疫功能和環(huán)境因素共同作用的結果[11]。由于患者體內(nèi)長期較高的血糖水平而引起的一系列多系統(tǒng)器官慢性并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病變、腎病、神經(jīng)疾病、心臟疾病等[11-13]是現(xiàn)在臨床糖尿病主要面臨的挑戰(zhàn)。血管內(nèi)皮作為血管保護屏障，最容易受到血液微環(huán)境變化的影響，長期暴露于高糖水平下可導致內(nèi)皮細胞動態(tài)平衡紊亂[14]。

現(xiàn)在臨床用于治療和預防糖尿病血管病變的藥物效果仍然具有局限性，并且具有降低患者體重等副作用[15]。如今，抗氧化治療作為對抗糖尿病患者氧化損傷的一種方法已經(jīng)引起了極大的關注，是接下來十年控制或預防糖尿病血管病變最有希望的候選藥物[16]。GBE50是從銀杏葉中提取的綜合活性成分，其主要成分為銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯。最近的研究表明，GBE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的作用范圍。GBE能調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元功能，起到抗氧化和清除自由基的作用，減輕細胞損傷。此外，銀杏葉提取物還能降低一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶-2的表達，并降低細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平[17]。沈建穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)，GBE50可顯著降低缺氧引起的HUVECs內(nèi)ROS水平并抑制細胞凋亡，對缺氧所致的內(nèi)皮細胞功能障礙有一定的保護作用，然而GBE50在高糖環(huán)境引起的內(nèi)皮細胞功能障礙中的作用并不清楚。

本研究通過高葡萄糖濃度建立細胞高糖環(huán)境，首先通過MTT法研究了GBE50對HUVECs細胞活性的影響。實驗結果顯示，GBE50可顯著提高高糖環(huán)境下HUVECs細胞活性。有研究表明高葡萄糖含量可誘導細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，導致內(nèi)皮功能障礙甚至細胞凋亡。糖尿病中的高糖環(huán)境激活了葡萄糖代謝途徑，并導致細胞過氧化[19]。本研究實驗結果同樣顯示，在流式細胞實驗中，高糖環(huán)境下HUVECs中ROS陽性細胞比率明顯升高，而GBE50可顯著降低ROS生成。谷胱甘肽是細胞內(nèi)主要的非酶抗氧化防御系統(tǒng)，可清除體內(nèi)氧自由基[20]，保護許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基。隨后本研究通過CMAC熒光標記HUVECs中GSH，實驗結果顯示，GBE50可顯著升高高糖環(huán)境下HUVECs中GSH含量。

在氧化條件下，氧化生物分子和受損的DNA可能觸發(fā)自噬機制和相關信號通路。自噬是一個動態(tài)的、維持生命的細胞降解過程，通過降解蛋白質(zhì)和受損細胞器來保護細胞，而過度自噬將會引起細胞凋亡[21]。在高糖濃度引起的細胞應激中，自噬現(xiàn)象在早期階段產(chǎn)生[21]。隨后本研究通過MDA標記了細胞自噬空泡，評估GBE50對HUVECs細胞自噬的影響。流式細胞實驗結果顯示，GBE50可顯著降低HUVECs在高糖環(huán)境下MDA陽性細胞比率，說明細胞自噬水平下降。自噬反應啟動后，LC3-I與 LC3-II的相互轉(zhuǎn)化是自噬早期的標志[22]。隨后本研究通過免疫熒光實驗研究了LC3的表達情況。實驗結果顯示，GBE50可顯著降低HUVECs中LC3熒光水平，此結果進一步證明了GBE50降低了高糖環(huán)境下細胞自噬水平。

綜上，本研究揭示了GBE50可通過降低細胞自噬水平、降低ROS產(chǎn)物含量降低高糖環(huán)境對血管內(nèi)皮細胞細胞活性的影響，本研究的研究為糖尿病血管損傷并發(fā)癥提供了新的治療手段。