基于數(shù)據(jù)挖掘的哮喘動(dòng)物模型應(yīng)用分析

吳 瑞，李秀敏，苗明三

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046)

支氣管哮喘(稱(chēng)為“哮喘”)，是一種以氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為病理特征和氣道高反應(yīng)性為生理特征的慢性炎癥性疾病。近年來(lái)，由于環(huán)境因素和生活方式的改變，哮喘的發(fā)病率逐年上升[1-2]。因此，醫(yī)學(xué)界越來(lái)越關(guān)注與哮喘有關(guān)的研究。由于臨床人體試驗(yàn)的局限與困難性,目前主要運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探索哮喘發(fā)病機(jī)制、評(píng)測(cè)新的治療方法、研究開(kāi)發(fā)新的治療藥物。哮喘動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的主要和中心環(huán)節(jié)是建立哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，該模型必須高度貼合人類(lèi)哮喘的病理生理學(xué)和臨床變化過(guò)程，但目前實(shí)驗(yàn)研究所使用的哮喘動(dòng)物模型存在造模方法復(fù)雜、模型吻合度低、模型成功率低等問(wèn)題。因此本文對(duì)最近10年有關(guān)建立哮喘動(dòng)物模型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)進(jìn)行了整理分析，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)、激發(fā)方式、致敏方法、檢測(cè)指標(biāo)等方面總結(jié)哮喘動(dòng)物模型的研究進(jìn)展,提出建立與臨床哮喘狀態(tài)相一致的動(dòng)物模型的完善建議，為哮喘的臨床及實(shí)驗(yàn)研究提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

以“哮喘”和“動(dòng)物模型”為主題，在中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)高級(jí)檢索界面進(jìn)行搜索，時(shí)間范圍是2009年1月至2019年8月，共檢索到期刊文獻(xiàn)248篇。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

選擇研究哮喘的全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)；會(huì)議、碩博論文等不作為納入的范疇；排除綜述類(lèi)和資料不全的文獻(xiàn)。最終有118篇文獻(xiàn)符合納入標(biāo)準(zhǔn)，將收集的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)、激發(fā)方式、致敏方法、檢測(cè)指標(biāo)等錄入Excel 2013歸納處理，以此建立哮喘動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物名稱(chēng)、種類(lèi)等均參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[3]進(jìn)行規(guī)范，統(tǒng)一處理具有不同名稱(chēng)的動(dòng)物種類(lèi)，如“荷蘭豬”統(tǒng)一為“豚鼠”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

首先對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)單獨(dú)歸納整理，分析其應(yīng)用所占比例，其次對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行整體分析，對(duì)模型建立方法和檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)性和區(qū)域化整理。

2 結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)

將錄入的118篇實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)[4-22]中的全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)排序，統(tǒng)計(jì)得出共有8類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，累積頻率118次。在這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，使用頻數(shù)≥10的共有4種，累積出現(xiàn)109次，使頻數(shù)最高的前四位分別是BALB/c小鼠(43次，36.4%)、SD大鼠(42次，35.5%)、Wistar大鼠(12次，10.2%)和豚鼠(12次，10.2%)。在118篇實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)分布情況詳情見(jiàn)表1。

2.1.2 造模激發(fā)方式

將118篇實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)所涉及的造模激發(fā)方式進(jìn)行分類(lèi)規(guī)范。統(tǒng)計(jì)得出，118篇實(shí)驗(yàn)文章涵蓋了5種激發(fā)方式。在5種激發(fā)方式中，使用最多激發(fā)方式為霧化激發(fā)(102次，86.4%)。造模激發(fā)方式分類(lèi)及使用頻數(shù)見(jiàn)表2。

2.1.3 致敏方法

將118篇實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)所涉及的致敏方法進(jìn)行分類(lèi)規(guī)范。統(tǒng)計(jì)得出，118篇實(shí)驗(yàn)文章涵蓋了6種致敏方法。在6種致敏方法中，使用最多的致敏方式為卵清白蛋白致敏(107次，90.6%)。由于這些實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)致敏時(shí)基本采用氫氧化鋁為佐劑，故其使用情況不再歸納統(tǒng)計(jì)。致敏方法分類(lèi)及使用頻數(shù)見(jiàn)表3。

2.1.4 檢測(cè)指標(biāo)

將錄入的118篇實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)中的全部檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行分類(lèi)排序。在這些檢測(cè)指標(biāo)中，若同一組織被分成不同的檢測(cè)指標(biāo)，則分別統(tǒng)計(jì)，如肺組織在同一實(shí)驗(yàn)中既檢測(cè)肺組織病理又做肺組織免疫組化；若同一組織被同時(shí)檢測(cè)多個(gè)同類(lèi)型指標(biāo)，則歸為一類(lèi)，不再分開(kāi)統(tǒng)計(jì)，如血清中同時(shí)檢測(cè)IL-4、IL-17A、sIgE、sIgG1、sIgG2a等，則把這些指標(biāo)統(tǒng)稱(chēng)為血清指標(biāo)，同一實(shí)驗(yàn)只計(jì)入一次。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，118篇實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)涵蓋16種不同的指標(biāo)類(lèi)型，累積頻數(shù)355次。其中檢測(cè)較多的指標(biāo)為肺組織病理(92次，77.9%)、血清中生化指標(biāo)(49次，41.5%)、肺泡灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)(42次，35.6%)、肺組織免疫組化(40次，33.9%)、肺泡灌洗液上清中生化指標(biāo)(39次，33.1%)等。檢測(cè)指標(biāo)分類(lèi)及使用頻數(shù)見(jiàn)表4。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)頻數(shù)分布

表2 造模激發(fā)方式分類(lèi)及使用頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

表3 致敏方法分類(lèi)及使用頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

表4 檢測(cè)指標(biāo)分類(lèi)及使用頻數(shù)

2.2 結(jié)果分析

建立哮喘動(dòng)物模型,是利用所選種類(lèi)的動(dòng)物更加貼合地模仿哮喘疾病的病理生理過(guò)程與特征。目前還未發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)發(fā)病過(guò)程完全相同的動(dòng)物自發(fā)性哮喘模型,因此需要人工加以復(fù)制,鼠類(lèi)動(dòng)物因其基因組序列與人類(lèi)相似，常被研究者用來(lái)建立哮喘模型。通過(guò)表1可以看出，建立哮喘動(dòng)物模型多使用BALB/c小鼠、SD大鼠、Wistar大鼠和豚鼠。據(jù)報(bào)道BALB/c小鼠對(duì)致敏原較易產(chǎn)生氣道炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性，從而更加容易復(fù)刻哮喘模型，同時(shí)BALB/c小鼠也是受到國(guó)外廣泛認(rèn)同的哮喘動(dòng)物模型品系，用其進(jìn)行哮喘動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究更容易受?chē)?guó)際醫(yī)學(xué)界認(rèn)可[23-25]。SD大鼠和Wistar大鼠的來(lái)源廣泛，容易飼養(yǎng)繁殖，價(jià)格相對(duì)便宜,生物學(xué)試劑種類(lèi)多并且容易獲得,對(duì)抗原的反應(yīng)性較為一致，在測(cè)量指標(biāo)較多的情況下，研究者更傾向于選擇其作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在建立模型時(shí)，豚鼠更容易被致敏,因其反應(yīng)的靶器官為肺,接觸致敏原后容易產(chǎn)生過(guò)敏變態(tài)反應(yīng),程度較大鼠、小鼠強(qiáng),因此在研究中應(yīng)用廣泛。但因?yàn)殡嗍蠓敝陈瘦^低、飼養(yǎng)條件要求高、相關(guān)配合的免疫學(xué)試劑相對(duì)不足等原因，其使用頻次低于BALB/c小鼠和SD大鼠。此外，在統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)文章選擇雌性動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，筆者查閱資料后發(fā)現(xiàn)，霧化激發(fā)后雌鼠的氣道炎癥、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度、支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)等哮喘特征均比雄鼠更為嚴(yán)重，就建立哮喘模型來(lái)說(shuō)，雌鼠比雄鼠更有優(yōu)勢(shì)[26]。

建立哮喘動(dòng)物模型最主要是使動(dòng)物模型出現(xiàn)免疫原性及免疫應(yīng)答,防止脫敏情況發(fā)生，因此在制備哮喘模型過(guò)程先采用抗原致敏，使動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在致敏物，然后氣道局部激發(fā)，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生哮喘反應(yīng)。從表2和表3可以看出，本文統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)使用最多的致敏抗原為OVA，在全部實(shí)驗(yàn)文章的致敏方法中占比90.6%；使用最多的激發(fā)方式為霧化激發(fā)，在全部實(shí)驗(yàn)文章的激發(fā)方式中占比86.4%。研究表明OVA為異種蛋白, 有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性，能成功建立哮喘氣道慢性變應(yīng)性炎癥模型[27]。致敏后，大多采用霧化激發(fā)的方式使模型動(dòng)物口鼻完全暴露在造模激發(fā)液中，霧化器長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)激發(fā)刺激動(dòng)物，激發(fā)液經(jīng)呼吸道進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后可直接作用于氣道、肺，從而成功誘導(dǎo)肺產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[28]。在激發(fā)后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)較明顯的頭面部瘙癢、站立不穩(wěn)、腹式呼吸(呼吸短促)等類(lèi)似哮喘發(fā)作的癥狀，這些現(xiàn)象可以作為評(píng)價(jià)模型成功的重要指標(biāo)。

哮喘動(dòng)物模型應(yīng)該具備氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性、血清IgE水平增高等特征。而這些特征可以在肺組織病理、血清中生化指標(biāo)、肺泡灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)、肺組織免疫組化、肺泡灌洗液上清中生化指標(biāo)等指標(biāo)中體現(xiàn)。肺組織病理是評(píng)價(jià)哮喘模型是否成功的重要指標(biāo)，哮喘經(jīng)常會(huì)由急性炎癥反復(fù)發(fā)作而轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y,因此氣道反復(fù)損傷與修復(fù)病理組織鏡下觀察可以看到大量炎性細(xì)胞、炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)。經(jīng)過(guò)本文統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，118篇實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)中所測(cè)得血清生化指標(biāo)較多的為sIgE、IgE、TNF-α、IL-4、 IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、干擾素-γ(IFN-γ)等，這些指標(biāo)可以有效評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)情況。肺泡灌洗液中各類(lèi)炎癥細(xì)胞和上清中的生化指標(biāo)在評(píng)價(jià)氣道炎癥中發(fā)揮重要作用，例如，中性粒細(xì)胞水平與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[29]。免疫組化技術(shù)是根據(jù)抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)與化學(xué)顯色原理, 使組織切片中待測(cè)細(xì)胞的化學(xué)成分通過(guò)過(guò)氧化物酶等標(biāo)記出來(lái), 便于顯微鏡的觀察與統(tǒng)計(jì)，對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠模型成功情況的判定具有重要意義[30]。

3 討論

哮喘的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,醫(yī)學(xué)界至今還不能將其解釋清楚，但目前能確定的是哮喘的發(fā)病機(jī)制跟氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性以及免疫耐受受損相關(guān)[28]。因此在建立哮喘動(dòng)物模型時(shí)要從這些方面入手。

哮喘動(dòng)物模型的建立方法多種多樣，但目前所建立的哮喘動(dòng)物模型還不能完全等同人類(lèi)哮喘疾病的病理生理過(guò)程，所以在建立貼近臨床、結(jié)合哮喘表型、結(jié)合哮喘疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程及病理生理改變的哮喘動(dòng)物模型是未來(lái)的主要研究方向。通過(guò)對(duì)近10年哮喘實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘整理可知，使用BALB/c小鼠或SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用霧化激發(fā)的方式霧化致敏，用OVA作為致敏抗原，可以有效提高模型的成功率，指標(biāo)選取建議選取肺組織病理、血清中生化指標(biāo)、肺泡灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，此外在建立模型時(shí)還要綜合考慮到方法、給藥劑量、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皩?shí)驗(yàn)條件等。作者期望通過(guò)自己的整理能為提高造哮喘動(dòng)物模型成功率及評(píng)價(jià)受試藥物有效性提供一定的方法學(xué)參考。