基于TGF-β1/Smad3信號通路觀察促血小板生成素對阿霉素致心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

牛 歡，陳曼麗，楊 波，何智余

(1.深圳大學(xué)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 廣東 深圳 518005； 2.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院 內(nèi)科， 廣東 深圳 518000； 3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 蘭州 730000)

原發(fā)性以及繼發(fā)性的心血管疾病的終未期主要表現(xiàn)為心室充盈或射血功能受損，被稱為慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)[1]，至今尚無根治性治療手段。據(jù)統(tǒng)計CHF的5年生存率不足50%。目前CHF的發(fā)病機制已逐漸深入到分子生物學(xué)水平，為CHF的基因靶向治療提供有力支撐[2]。研究表明[3]心肌纖維化導(dǎo)致的心室重構(gòu)(ventricular remodeling,VR)進(jìn)而造成心肌細(xì)胞的異常凋亡是CHF發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵性的病理改變。Chang等[4]研究證實抑制心肌纖維化，能降低心肌細(xì)胞的凋亡率，減輕心力衰竭的程度。已有的實驗研究表明[5]轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)直接參與心肌纖維化的病理過程。研究顯示TGF-β1可促進(jìn)成纖維細(xì)胞(cadiacfibloblast,CFs)轉(zhuǎn)化。CFs的增生刺激分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)蛋白，引起心肌組織膠原纖維積聚，進(jìn)而改變心肌的基礎(chǔ)空間結(jié)構(gòu)，造成心肌細(xì)胞異常凋亡、壞死數(shù)量增加，導(dǎo)致心臟功能障礙。Heger等[6]研究證實TGF-β1能夠促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。促血小板生成素(thromobopoietin, TPO)是機體內(nèi)調(diào)節(jié)血小板/巨核細(xì)胞系的最重要的造血蛋白生長因子，臨床應(yīng)用就是作為造血生長因子用于血小板減少癥的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)TPO對心臟具有保護(hù)作用[7]。張東濤等[8]體外研究H9C2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)， TPO通過抑制細(xì)胞凋亡實現(xiàn)對體外心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，但TPO在CHF中作用的報道較少。本研究通過建立大鼠CHF模型，從TGF-β1/Smad3的角度探討TPO對CHF的保護(hù)作用，從而為臨床上TPO的應(yīng)用提供。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

48只8-10周SPF級SD雄性大鼠，體重220～250 g，[SCXK(甘)2018-0002]，[SYXK(甘)2018-12]，由深圳大學(xué)總醫(yī)院實驗動物中心提供；室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實驗。實驗動物的使用及操作均遵守3R原則，在過程中給與與動物人道的關(guān)懷，實驗基本操作參照深圳大學(xué)總醫(yī)院動物管理委員會關(guān)于基礎(chǔ)實驗動物的的規(guī)定進(jìn)行，并經(jīng)本院實驗動物管理倫理委員會批準(zhǔn)(JG-2019-0047)。

1.2 主要試劑與儀器

促血小板生成素注射液(thrombopoietin，TPO，沈陽三生制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字：S20050048)；阿霉素(注射用鹽酸多柔比星，山西普德藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H14023879)；TGF-β1特異性抑制劑SB431542(生產(chǎn)批號：1014-JA)采購自美國Selleck公司，異氟烷(生產(chǎn)批號：521 L -A)、戊巴比妥鈉(生產(chǎn)批號：256O-0I)、鏈脲佐霉素(生產(chǎn)批號：AS-7802)、多聚甲醛(生產(chǎn)批號：WQ-2F)采購自Sigma公司；HE試劑盒(生產(chǎn)批號：KT-2018H567)、Masson染色試劑盒(生產(chǎn)批號：KT-2018M902)購自上海碧云天生物技術(shù)公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(生產(chǎn)批號：GW-147)、化學(xué)發(fā)光試劑盒(生產(chǎn)批號：GW-1857)購自廣東銳博生物科技技術(shù)股份有限公司；TGF-β1(生產(chǎn)批號：AY-T201)、p-Smad3抗體(生產(chǎn)批號：AY-S269)、兔抗大鼠Caspase-3(生產(chǎn)批號：AY-C5TH)、兔抗GAPDH(生產(chǎn)批號：AY-GT34)以及山羊抗兔IgG(生產(chǎn)批號：AY-IJ70)采購自美國abcam公司，TUNEL試劑盒(生產(chǎn)批號：RN-S069)、Western blot試劑盒(生產(chǎn)批號：RN-WR672)購自德國Rebstock公司。

熒光顯微鏡(US-2018，尼康公司，日本)，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)(8845-S型，Bio-rad公司，美國)，-80℃深冷冰箱(WF-150 V，維根斯公司，德國)，電鏡(KW-06，三菱公司，日本)，組織切片機(Leica RM2135，Leica公司，德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構(gòu)建和分組處理

實驗前使用標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用生理鹽水將注射用阿霉素配成2 mg/L溶液，將48只大鼠隨機分為4組，每組12只，分別為對照組、模型組、TPO干預(yù)組(治療組)、TGF-β1特異性抑制劑SB431542干預(yù)組(抑制劑組)；據(jù)文獻(xiàn)方法[9]，將阿霉素溶液分別以7 mg/kg腹腔注射到模型組、治療組、抑制劑組大鼠體內(nèi)，每周1次，持續(xù)8周，構(gòu)建心力衰竭大鼠模型；對照組大鼠腹腔注射等體積的醫(yī)用生理鹽水。8周后采用心臟彩超記錄鼠心功能指數(shù)。同時開始進(jìn)行藥物干預(yù)治療，治療組大鼠每日腹腔注射給藥5 μg/kg TPO； 抑制劑組大鼠每日腹腔注射給藥1.2 mg/kg SB431542；對照組、模型組大鼠給予等體積的生理鹽水，持續(xù)給藥28 d。

1.3.2 心臟超聲檢査心臟功能

持續(xù)給藥28 d后，異氟烷腹腔注射麻醉大鼠，固定于手術(shù)臺，心臟彩超檢查心臟功能。記錄左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室收縮期內(nèi)徑(LVDS)、舒張期內(nèi)徑(LVDd)、短軸縮短率(FS)等數(shù)據(jù)。

1.3.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變

檢查心臟彩超之后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈放血處死。在無菌操作臺上，開胸取出心臟，用無菌濾紙吸干水分，處理過后將心臟組織封存在液氮中，置于-80℃深冷冰箱中備用。取出20%心肌組織，分別用HE染色和Masson染色，制成切片，光鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理改變。

1.3.4 免疫組化法檢測心肌組織測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)

取出20%心肌組織，固定包埋并切片，脫蠟后，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)，3%的雙氧水室溫下封閉，分別加入一抗，4℃過夜孵育，次日，PBS沖洗3次后，分別加入二抗，清洗。加適量二氨基聯(lián)苯氨 (diaminobenzidin ，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結(jié)果；每個樣本獨立重復(fù)測量3次。

1.3.5 TUNEL染色檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡

取10%心肌組織，常規(guī)方法固定，冰凍切片，二甲苯浸洗兩次，梯度酒精浸洗5 min，風(fēng)干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4℃預(yù)冷乙醇上進(jìn)行如下操作：0.1% TRItonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNNEL反應(yīng)混合液，加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)1 h，溫度37℃，PBS漂洗，脫水后二甲苯透明，封片，US-2018熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.6 免疫熒光檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3的表達(dá)情況

從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，常規(guī)方法固定，冰凍切片，按照免疫熒光的試劑盒要求進(jìn)行操作觀察Caspase-3的表達(dá)情況。

1.3.7 Western blot檢測各組大鼠腦組織中Caspase-3以及信號通路相關(guān)蛋白TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)水平

從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，組織裂解勻漿器，冰浴5 min后離心，留取上清，測定蛋白濃度后，電泳轉(zhuǎn)移膜，封閉加入一抗稀釋液(均為1∶1000)，保持4℃過夜，次日清洗后，加入二抗稀釋液(均為1∶10000)，室溫下孵育2 h，顯色后Bio-rad凝膠成像儀下讀取各條帶的灰度值， 目的蛋白相對表達(dá)水平以GAPDH作為參照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心臟彩超檢測大鼠心功能的變化

各組大鼠心臟彩超檢測各組大鼠心功能后結(jié)果如圖1，表1所示，與對照組相比，模型組大鼠的LVDS、LVDd明顯出現(xiàn)升高(P<0.05)，LVEF、FS明顯出現(xiàn)下降(P<0.05)，與模型組相比，治療組、抑制劑組的LVDS、LVDd明顯下降(P<0.05)，LVEF、FS明顯升高(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療組、抑制劑組在大鼠心臟心功能指數(shù)差異不具有統(tǒng)計意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)

HE染色結(jié)果如圖2所示，對照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，清晰可辨，細(xì)胞整齊排列，細(xì)胞間質(zhì)無水腫情況，心肌橫紋清晰且規(guī)則，細(xì)胞連接緊密。模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大且不規(guī)則、細(xì)胞排列紊亂，心肌濁腫明顯，細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯及細(xì)胞外基質(zhì)增多，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維增生明顯，心肌細(xì)胞間質(zhì)充血嚴(yán)重，心肌橫紋消失；與模型組相比，治療組、抑制劑組大鼠心肌細(xì)胞較模型組排列更規(guī)則，心肌纖維變性較輕，纖維組織增生明顯減少，基本無出血點，心肌細(xì)胞損傷癥狀明顯減輕。

注：A:對照組；B：模型組；C：治療組；D:抑制劑組。圖1 各組大鼠心臟超聲結(jié)果Note. A， control group. B， model group. C， treatment group. D, inhibitor group.Figure 1 Cardiac ultrasound results of rats in each group

表1各組大鼠心功能指數(shù)比較

Table1Comparison of the heart function index of rats in each group

分組Groups左室收縮期內(nèi)徑(mm)LVDS舒張期內(nèi)徑(mm)LVDd左室射血分?jǐn)?shù)(%)LVEF短軸縮短率(%)FS對照組control group5.01±0.353.47±0.1684.14±1.5255.25±0.38模型組model group7.65±0.27*5.85±0.18*62.15±2.15*28.49±0.63*治療組treatment group6.21±0.13#4.35±0.11#75.05±3.26#38.35±0.87#抑制劑組 inhibitor group6.18±0.15#4.33±0.13#75.15±3.14#37.18±1.28#

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

Note. Compared with the control group.*P<0.05. Compared with the model group.#P<0.05.

注：A:對照組;B：模型組;C：治療組;D:抑制劑組。圖2 HE染色結(jié)果Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group.Figure 2 HE staining

注：A:對照組;B：模型組;C：治療組;D:抑制劑組。圖3 Masson染色結(jié)果Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group.Figure 3 Masson staining

光鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞Masson染色，心肌細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色，本研究中Masson染色結(jié)果如圖3所示，對照組只是少量的膠原纖維散在細(xì)胞間隙中；模型組心肌細(xì)胞及血管周圍均可見大片藍(lán)色的心肌膠原纖維分布；與模型組相比，治療組、抑制劑組心肌細(xì)胞及血管周圍的膠原纖維明顯減少。

2.3 免疫組化法檢測心肌組織測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)

免疫組化結(jié)果如圖4所示：與對照組相比，模型組、治療組、抑制劑組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)明顯的升高(P<0.05)。與模型組相比，在進(jìn)行藥物干預(yù)后，治療組、抑制劑組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)出現(xiàn)明顯的下降(P<0.05)，治療組、抑制劑組在大鼠心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計意義(P>0.05)。推斷促血小板生成素和抑制劑SB431542均可抑制心衰大鼠心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。

2.4 TUNEL染色檢測各組大鼠心肌組織中的細(xì)胞凋亡

TUNEL染色結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，模型組大鼠的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，治療組、抑制劑組大鼠的細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，治療組和抑制劑組相比，細(xì)胞凋亡率的差異(P>0.05)，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 免疫熒光檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3的表達(dá)情況

Caspase-3作為細(xì)胞程序性凋亡的最終執(zhí)行分子。本研究中免疫組化和Western blot結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，模型組Caspase-3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組、抑制劑組Caspase-3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；治療組和抑制劑組相比，大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)差異(P>0.05)，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

注：A:對照組;B：模型組;C：治療組;D:抑制劑組。a:Ⅰ型膠原蛋白；b:Ⅲ型膠原蛋白。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖4 免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)結(jié)果Note. A， control group. B， model group. C， treatment group. D， inhibitor group. a, type I collagen. b, type III collagen. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 4 Immunohistochemical staining of type I and III collagen

注：A:對照組；B：模型組；C：治療組；D:抑制劑組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖5 TUNEL染色檢測心肌組織中的細(xì)胞凋亡Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group. Compared with the control group,*P < 0.05. Compared with the model group,#P < 0.05.Figure 5 TUNEL staining for the detection of cell apoptosis in myocardial tissue

注：A:對照組；B：模型組；C：治療組；D:抑制劑組。a：免疫組化檢測各組大鼠心肌組織Caspase-3的表達(dá)；b：Western blot檢測各組大鼠心肌組織Caspase-3的表達(dá)；c：各組大鼠心肌組織中Caspase-3的表達(dá)差異。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖6 各組大鼠心肌組織中的Caspase-3的表達(dá)Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group.a， Immunofluorescence detection of the expression caspase-3. b, Western blot detection of the expression of caspase-3. c, Difference in the expression of caspase-3. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05. Figure 6 Expression of Caspase-3 in myocardial tissue of rats in each group

2.6 Western blot檢測TGF-β1、p-Smad3蛋白的表達(dá)

本研究采用Western blot檢測各組大鼠心臟組織TGF-β1、p-Smad3蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞的TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組、抑制劑組大鼠心肌細(xì)胞的TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。治療組、抑制劑組在大鼠心臟心肌細(xì)胞TGF-β1、p-Smad3表達(dá)差異不具有統(tǒng)計意義(P>0.05)。

注：A:對照組；B：模型組；C：治療組；D:抑制劑組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖7 Western blot檢測各組大鼠心臟組織TGF-β1、p-Smad3蛋白的表達(dá)Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.Figure 7 Western blot detection of the expression of TGF-β1 and p-Smad3 proteins

3 討論

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是以心臟收縮或舒張功能障礙為標(biāo)志的器質(zhì)性心血管系統(tǒng)的綜合癥[10]，死亡率高，預(yù)后不佳。近年來，隨著研究的深入，許多學(xué)者從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等角度研究證實心肌細(xì)胞凋亡是CHF發(fā)生、發(fā)展中的重要生理病變過程。

細(xì)胞異常凋亡致使心肌細(xì)胞數(shù)量驟減，心室充盈壓失常、心房排血量減少，最終導(dǎo)致心室壁變薄，心腔擴大，心肌肥大等心肌重構(gòu)(Ventricular remodeling,VR)發(fā)展成CHF[11]。促血小板生成素(thromobopoietin, TPO)具有介導(dǎo)血小板生成和調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞增殖、分化的功能[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)TPO還能在其他系統(tǒng)發(fā)揮作用[13]。王曉東等[14]研究發(fā)現(xiàn)TPO能促進(jìn)小鼠神經(jīng)細(xì)胞的增殖，穩(wěn)定線粒體膜電位，發(fā)揮抗凋亡的作用。Besbes等[15]研究發(fā)現(xiàn)TPO能夠影響卵巢細(xì)胞的增殖和凋亡。而TPO對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用引起關(guān)注[16]。Wang等[17]TPO能保護(hù)H9C2細(xì)胞免受多柔比星誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)的作用。Chan等[18]采用TPO 治療心梗大鼠發(fā)現(xiàn)TPO能明顯改善其左心室功能，促進(jìn)血管新生，減小心梗面積。但是TPO 在CHF中的作用未見有研究報道。

阿霉素(adriamycin)是一線抗腫瘤化療藥物，但是由于其心臟毒性，限制了在臨床上的應(yīng)用[19]。本研究中在給與阿霉素8周后，大鼠心臟LVDS、LVDd明顯升高，LVEF、FS明顯降低，與人CHF癥狀相似。CHF大鼠模型建立成功。阿霉素造成CHF的機制上不明確，有研究報道[20]證實大鼠在注射阿霉素后，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，致使心肌細(xì)胞數(shù)量驟減，心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，心室功能降低。本研究中模型組大鼠心臟LVDS、LVDd明顯升高(P<0.05)，LVEF、FS明顯降低(P<0.05)，心肌細(xì)胞及血管周圍均可見心肌膠原纖維沉積，心肌CHF損傷癥狀明顯；細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。細(xì)胞凋亡是有許多分子共同調(diào)控的結(jié)果，Caspase-3是凋亡過程中的最重要的效應(yīng)蛋白[21]。模型組大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)明顯升高。在經(jīng)過TPO治療后，治療組大鼠心臟功能明顯改善，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；治療組大鼠心肌細(xì)胞及血管周圍的膠原纖維明顯減少，心肌細(xì)胞CHF損傷癥狀明顯減輕。由此可推斷促血小板生成素能夠抑制有阿霉素導(dǎo)致的心肌凋亡，改善心臟功能。

TGF-β1主要在成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，TGF-β1是激活成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵因子，可刺激膠原纖維的合成[22]。研究表明[23]TGF-β1/ Smad3信號通路在心臟重塑和CHF的過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。研究證實[24]抑制TGF-β1的作用能夠有效的抑制由糖尿病等導(dǎo)致的CHF的中的心室重構(gòu)；動物實驗研究證實[25]在心肌梗死早期抑制TGF-β1信號通路，能夠明顯改善心功能。本研究中免疫組化結(jié)果顯示，模型大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)均明顯升高，在使用TPO和TGF-β1抑制劑干預(yù)后，治療組、抑制劑組大鼠心肌膠原纖維表達(dá)明顯下降，兩組大鼠CHF病理指標(biāo)改善差異不明顯，初步推斷TPO可能通過抑制說TGF-β1的表達(dá)來改善大鼠CHF癥狀。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞的TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)明顯升高；與模型組相比，治療組、抑制劑組大鼠心肌細(xì)胞的TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)明顯降低，推斷TPO 能抑制說TGF-β1的表達(dá)。

綜上所述，TPO能夠改善由阿霉素導(dǎo)致CHF大鼠的心臟功能，降低心肌細(xì)胞凋亡率，其機制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路有關(guān)。雖然TPO對心臟的保護(hù)作用在動物實驗中效果令人欣慰，但是就TPO在臨床上治療心力衰竭的安全性、用藥的最佳時間、以及最佳劑量等問題還需要進(jìn)一步研究。