臍帶間充質(zhì)干細胞對卵巢早衰家兔性激素、CYR61和CTGF表達的影響

張 娟，王 晶，周 麗，庹 平，王 剛，朱楚超

(1.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430070； 2.湖北中醫(yī)藥大學，武漢 430065； 3.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗科，武漢 430070)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指40歲以下的婦女卵巢內(nèi)卵泡迅速減少，沒有或幾乎沒有卵泡殘留的一種疾病，臨床以無生育能力和閉經(jīng)為主要表現(xiàn)[1]。該病臨床發(fā)病率為1%，但一旦發(fā)病，常給患者帶來身體上和心理上的雙重打擊，患者會出現(xiàn)焦慮、抑郁等精神癥狀[2]。研究顯示，該病的發(fā)生可能與自身免疫、代謝、感染和醫(yī)源性因素等有關(guān)[3-4]。目前臨床上普遍的治療方法為激素替代療法[5]，雖能改善臨床癥狀，但很難恢復卵巢功能，而且長期使用會增加患癌癥的風險，所以臨床上亟待尋求一種更加有效和安全的治療方法。研究闡明[6]，臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UCMSCs)具有自我更新、多方向分化、促進損傷修復和調(diào)節(jié)免疫等功能，并且有取材簡單、免疫原性低、無倫理學爭議等優(yōu)點。近來有研究顯示[7-8]，UCMSCs能依賴于旁分泌提高卵巢儲備，在治療POF中起到一定療效，是針對POF的非常有前景的一種療法。本實驗研究以家兔為對象，觀察UCMSCs治療后富半胱氨酸蛋白61(CYR61)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達、mRNA的表達和激素水平變化，探討研究UCMSCs對卵巢早衰的治療作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取普通級5月齡雌性未交配日本大耳兔10只，體重2.6～2.8 kg，購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司[SCXK(鄂)2016-0011]，飼養(yǎng)于中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心[SYXK(鄂)2014-0082]，室溫為(22±2)℃，相對濕度為50～60%，12 h明暗交替光照，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，經(jīng)陰道脫落細胞涂片檢查確定其動情周期正常后開始實驗。實驗方案經(jīng)我院倫理委員會批準(2016020)，按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

注射用環(huán)磷酰胺(Baxter Oncology GmbH，注冊證號：H20110407)；兔雌二醇酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博歐特生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：orb409999)；兔促卵泡激素酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博歐特生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：orb410001)；cDNA第一鏈合成試劑盒(RevertAid RT Reverse Transcription Kit，K1621，Thermo)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SYBR FAST qPCR Master Mix，KK4604，sigma)；CRY61兔抗兔多克隆抗體(Novus，NB100-356)；CTGF兔抗兔多克隆抗體(Boster，BA0752)；GAPDH小鼠抗兔單克隆抗體(Abcam，ab8245)；流式抗體APC Mouse anti-Human CD29 (BD，559883)、PE Mouse anti-Human CD34(BD，550761)、PE Mouse anti-Human CD44 (BD，561858)、BB515 Mouse anti-Human CD45(BD，564585)；LightCycle 96型熒光定量PCR儀(ROCHE)；L600型離心機(湘儀儀器廠)；RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機(上海徠卡儀器有限公司)；BX51型奧林巴斯熒光顯微鏡；YD-6 L生物組織包埋機(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

圖1 UCMSCs流式細胞儀檢測結(jié)果Figure 1 Changes of UCMSCs detected by flow cytometry

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

根據(jù)團隊前期研究[9]，以50 mg/kg劑量連續(xù)注射2 d是建立環(huán)磷酰胺(CTX)誘導家兔POF模型的最佳造模方式。故本實驗采取CTX腹腔注射的方法建造POF模型，10只家兔均用CTX 50 mg/(kg·d)腹腔注射，連續(xù)注射2 d。造模后家兔出現(xiàn)不同程度脫毛，進食減少，活動反應(yīng)降低，體重下降等癥狀，并且采血檢查顯示有血清雌二醇(E2)水平下降，促卵泡生成素(FSH)水平上升。

1.3.2 分組

采用隨機數(shù)字表法將10只家兔隨機分為模型組和治療組各5只。

1.3.3 干預

(1)UCMSCs培養(yǎng)及鑒定

取中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，產(chǎn)婦簽署知情同意書，并報醫(yī)院倫理委員會批準。所取標本用PBS沖洗干凈，并剔除血管，將組織處理至1～2 mm，加入培養(yǎng)基(10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液)，置于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7 d后第1次傳代后每3 d按1∶3比例傳代，進行擴增培養(yǎng)。取第3代UCMSCs，制成單細胞懸液200 μL于EP管，分別加入抗體CD29-APC(20 μL)、CD34-PE(20 μL)、CD44 -PE(20 μL)、CD45-BB515(5 μL)，室溫避光孵育20 min，流式細胞儀檢測結(jié)果示：貼壁細胞表達CD29和CD44，不表達CD34和CD45，為人體臍帶間充質(zhì)干細胞。詳見圖1。

(2)干預治療

治療組5只POF家兔在造模一周后，通過耳緣靜脈注射5×106/mL的UCMSCs，每天注射2 mL，連續(xù)注射3 d。模型組注射等量的滅菌用水。

1.3.4 觀察指標

(1)激素水平測定

UCMSCs治療后0 d、7 d、14 d和28 d，分別取模型組和治療組家兔各3只，抽取靜脈血查激素水平。

(2)卵巢組織CYR61和CTGF蛋白表達

采用蛋白免疫印跡法檢測。治療28 d后，將兩組家兔處死后取一側(cè)卵巢，切取適量新鮮組織液氮速凍，放入-80℃冰箱中，后取100 mg剪切成細小的碎片，加入1000 μL RIPA裂解液，勻漿，充分裂解，12000 r/min離心5 min，取上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。每個樣本取40 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳，至溴酚藍剛出膠。將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，按150 mA恒流轉(zhuǎn)膜。稀釋一抗(CRY61∶1/200，CTGF：1/1000，GAPDH：1/2000)，4℃過夜，二抗(TBST溶解的5%脫脂牛奶)稀釋10000倍，室溫下30 min，TBST洗膜，滴加等體積混勻ECL顯影液，放入凝膠成像儀中曝光成像。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J 1.8.0軟件分析灰度值。

(3)卵巢組織CYR61和CTGF mRNA表達

采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測。卵巢組織按Trizol法提取總RNA，測定純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄后進行擴增。引物：GAPDH：上游5’-TTCCACGGCAC GGTCAAG-3’，下游5’-ACTCGGCACCAGCATCAC-3’；CYR61：上游5’-GAAGTCTCCCGAAGCAGTCAG-3’，下游5’-GTCTCGCCGTCCTCACAG-3’；CTGF：上游5’-GGAGTGGGTGTGTGACGAG-3’，5’-CCGC AGGTCTTGGAACAGG-3’，采用2-△△Ct法進行相對表達量分析。

(4)免疫組化檢測卵巢組織CYR61和CTGF蛋白表達

除上述凍存新鮮組織外，剩余組織放入4%多聚甲醛常溫固定，石蠟包埋后，6 μm連續(xù)切片使用，切片組織脫蠟、抗原修復后封閉，滴加100 μL稀釋的一抗(CRY61∶1/200、CTGF：1/100)，4℃過夜，PBS沖洗。滴加100 μL生物素標記二抗工作液(1/150稀釋)，37℃孵育30 min，PBS沖洗，孵育SABC，滴加DAB顯色液，室溫顯色。滴加200 μL蘇木素染色液孵育30 s，飽和磷酸氫二鈉溶液浸泡1 min返藍，以中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組激素水平比較

模型組和治療組在未治療前血清E2和FSH水平無差異，有可比性(P>0.05)。治療后家兔血清E2水平上升，F(xiàn)SH水平下降，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著時間出現(xiàn)周期性波動；而模型組家兔一直處于低E2和高FSH水平，隨著時間未出現(xiàn)周期性的波動。詳見表1、2和圖2、3。

2.2 兩組CYR61和CTGF蛋白表達比較

模型組CYR61和CTGF蛋白表達較低，分別為0.390±0.040和0.186±0.054，治療組蛋白表達量明顯增多，分別為0.756±0.085和0.693±0.098，與模型組相比較，差異均有統(tǒng)計學意義(tCYR61=8.688，P<0.05；tCTGF=10.142，P<0.05)，見圖4和圖5。

2.3 兩組CYR61和CTGF mRNA表達比較

模型組CYR61和CTGF mRNA表達水平較低，分別為0.003±0.001和0.002±0.001，而治療組mRNA的表達水平明顯升高，分別為0.010±0.001和0.016±0.002，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(tCYR61=38.156，P<0.05；tCTGF=14.646，P<0.05)，詳見圖6。

表1 兩組不同采血點E2水平比較

注：F組間=321.914，P組間<0.001；F時間=51.745；P時間<0.001；F交互=186.620，P交互<0.001。

Note.Fintergroup=321.914,Pintergroup<0.001.Ftime=51.745.Ptime<0.001.Finteraction=186.620,Pinteraction<0.001.

表2 兩組不同采血點FSH水平比較

注：F組間=694.561，P組間<0.001；F時間=33.990；P時間<0.001；F交互=126.616，P交互<0.001。

Note.Fintergroup=694.561,Pintergroup<0.001.Ftime=33.990.Ptime<0.001.Finteraction=126.616,Pinteraction<0.001.

圖2 兩組不同采血點E2水平比較Figure 2 Comparison of E2 levels at different blood collection points in the two groups

圖3 兩組不同采血點FSH水平比較Figure 3 Comparison of FSH levels at different blood collection points in the two groups

圖4 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF蛋白表達(1-5：治療組，6-10：模型組)Figure 4 Expression of CYR61 and CTGF in ovarian tissue of rabbits (1-5， treatment group. 6-10, model group)

圖5 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF蛋白相對表達量比較Figure 5 Comparison of relative expression levels of CYR61 and CTGF in ovarian tissues of rabbits

2.4 兩組免疫組化檢測結(jié)果比較

圖7、8可知，CYR61和CTGF蛋白表達在模型組較少，散在分布，平均光密度值分別為(0.166±0.009)和(0.193±0.008)；治療組表達明顯增多，呈深棕色顆粒狀，主要表達在顆粒細胞和卵泡細胞膜，在卵泡細胞膜處更是呈深棕色環(huán)狀，平均光密度值分別為(0.222±0.030)和(0.224±0.014)，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(tCYR61=3.981，P<0.05；tCTGF=4.111，P<0.05)。

圖6 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF mRNA相對表達量比較Figure 6 Comparison of relative expression levels of CYR61 and CTGF mRNA in ovarian tissues of rabbits

注：A：模型組;B：治療組，CYR61檢測；C：模型組;D：為治療組,CTGF檢測。圖7 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF表達Note. A, Model group. B, Treatment group, CYR61. C, Model group. D, Treatment group, CTGF.Figure 7 Expression of CYR61 and CTGF in ovarian tissue of rabbits

圖8 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF表達平均光密度值比較Figure 8 Comparison of mean optical density values of CYR61 and CTGF expression in ovarian tissue of rabbits

3 討論

隨著社會的發(fā)展，各種間充質(zhì)干細胞越來越多的被應(yīng)用于醫(yī)學，也是現(xiàn)代再生醫(yī)學研究的一大熱點。其中UCMSCs取材簡單，來源豐富，無倫理學爭議，被認為是同種異體移植的最佳來源[6-10]，UCMSCs是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，它能分化成許多種組織細胞，在醫(yī)學中具有廣闊的應(yīng)用前景。現(xiàn)代研究表明，UCMSCs能夠在許多疾病的治療中起到一定作用，如在治療糖尿病方面[11]，UCMSCs能阻斷相關(guān)的炎癥因子和炎癥激活，有效緩解胰島素抵抗；在治療肝方面[12]，UCMSCs能夠通過調(diào)節(jié)miR-20來調(diào)控Caspase-3等活性因子減輕細胞凋亡和基因異常表達，從而改善肝臟缺血再灌注損傷；在治療骨骼方面[13]，UCMSCs聯(lián)合骨膠原蛋白能夠促進骨再生，修復腰椎板缺損。多項研究闡明，人體間充質(zhì)干細胞能對CTX誘導的卵巢損傷起到一定的修復作用。Mchamed等[14]的動物試驗研究就顯示，人體的骨髓間充質(zhì)干細胞能夠刺激POF小鼠卵巢內(nèi)卵泡的生成和改善相關(guān)激素水平。另有一項臨床研究顯示[15]，在自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植后，2例POF患者第三個月恢復了月經(jīng)，1例POF患者成功受孕并產(chǎn)下健康胎兒，充分表明應(yīng)用自體的骨髓間充質(zhì)干細胞對治療POF有很好的療效。

本實驗研究中應(yīng)用注射CTX建造POF模型，始終具有高FSH和低E2水平，生理學上能代表人類POF。有研究闡明[16]，雖然動物卵巢結(jié)構(gòu)和激素周期和人體存在差異，但CTX誘導的動物POF模型是目前該領(lǐng)域研究中最被接受的臨床前模型。本研究顯示經(jīng)UCMSCs治療后，POF家兔體內(nèi)的E2水平上升，F(xiàn)SH水平下降，并且在治療后恢復了周期性的波動，證實其治療有效。最近的證據(jù)表明[17]，間充質(zhì)干細胞的作用不是直接恢復受損的細胞，而是通過阻礙和抑制異常的免疫反應(yīng)來幫助組織再生，并傳遞生長因子來實現(xiàn)修復的。CYR61和CTGF均為CCN家族的一員，為細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白[18]。生理情況下，CYR61保持低表達維持機體生理需要，但炎癥刺激等多種因素均可導致CYR61表達增加；高表達的CYR61能分泌到胞外基質(zhì)，通過與細胞表面受體結(jié)合，起到促進細胞增殖分化、血管形成以及組織損傷修復等多種作用[19]。相關(guān)研究顯示[20]，高表達CYR61的人子宮內(nèi)膜血管周圍細胞移植能促進子宮部分全層切除術(shù)后大鼠子宮血管生成以及內(nèi)膜和肌層再生，提高大鼠的妊娠率。CTGF具有促細胞增殖、遷移及分化等作用，與CYR61共同參與細胞內(nèi)外信號傳導。本實驗研究中，治療后CYR61和CTGF蛋白和mRNA的表達呈正相關(guān)，表達的主要部位為顆粒細胞和卵泡細胞膜，表明其具有協(xié)同作用，共同參與UCMSCs對POF的治療調(diào)節(jié)機制。研究顯示，CYR61和CTGF除自身能促進新生血管生成外，還能一起上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達間接促進血管生成[21]。另有研究闡明，E2等雌激素能上調(diào)CTGF表達，并且此過程受FSH的負調(diào)控[22]。UCMSCs也能夠分泌VEGF，抑制次級卵泡和囊狀卵泡凋亡，促進血管生成；也能分泌多種生長因子，逆轉(zhuǎn)CTX阻斷的E2對FSH的負反饋作用，阻止生長卵泡過度耗竭，最終改善卵泡的發(fā)育[23-24]。

綜上所述，UCMSCs對POF具有一定的治療作用，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)E2和FSH水平以及上調(diào)CYR61和CTGF在局部組織內(nèi)的表達，進而影響VEGF等表達，促進新生血管的形成，從而促進卵泡再生和組織修復來實現(xiàn)的。