小鼠非開(kāi)胸式主動(dòng)脈弓狹窄心衰模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

方明筍，金櫨帥，張利棕，馬全鑫，金 璐，郎佳麗，傅惠英，壽旗揚(yáng)*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/附屬第二醫(yī)院，杭州 310053； 3.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，杭州 310027)

心力衰竭是臨床常見(jiàn)的疾病之一，有著較高的發(fā)病率和死亡率，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示心力衰竭在我國(guó)的發(fā)病率在逐年上升，嚴(yán)重危害大眾健康[1-2]。臨床對(duì)于心力衰竭治療的研究也不勝枚舉，但至今還沒(méi)有特別理想的治療方案。就臨床研究而言，最基礎(chǔ)的就是要建立具有代表性的成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[3]。小鼠是模擬人類疾病模型最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4]，臨床上用于建立小鼠心衰模型的方法多樣，主要是通過(guò)化學(xué)藥物誘導(dǎo)和物理手術(shù)兩種方式，化學(xué)藥物誘導(dǎo)成功率不高，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。物理手術(shù)包括壓力超負(fù)荷心衰模型、容量超負(fù)荷心衰模型和心肌梗死后心衰模型[5-7]。主動(dòng)脈弓狹窄術(shù)(transverse aortic constriction，TAC)是壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)左心室肥大及心力衰竭最常用的手術(shù)方法[8]。當(dāng)前TAC術(shù)使用的動(dòng)物品系不一，且手術(shù)方法需開(kāi)胸，小鼠手術(shù)創(chuàng)傷很大，死亡率很高，導(dǎo)致模型建立難度大且不穩(wěn)定，術(shù)后心力衰竭病程進(jìn)度不一[9-11]。因此本文采用改良的小鼠非開(kāi)胸式TAC術(shù)，使用C57BL/6J小鼠建立心力衰竭模型，并對(duì)小鼠心力衰竭的病理進(jìn)程進(jìn)行分析觀察。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠30只，6～8周齡，體重(22±2) g，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司[SCXK(滬)2018-0003]；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[SYXK(浙)2018-0006]，溫度：(22±2)℃，濕度：50%～70%，12 h明暗交替，自由飲食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)(ZSLL-2017-106)，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法規(guī)及動(dòng)物福利的相關(guān)要求，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(杭州達(dá)文生物)，異氟烷(深圳瑞沃德)，Vevo 1100超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics)，Nano Zoomer 2.0 RS 數(shù)字切片掃描設(shè)備(日本濱松)，鵝頸冷光源燈(深圳瑞沃德)，小鼠顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械)，恒溫手術(shù)保溫臺(tái)(美國(guó)Gaymar)，自制L型26G墊針。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立及鑒定

30只小鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行手術(shù)，采用0.3%戊巴比妥鈉(75 mg/kg)腹腔注射麻醉，掐捏鼠尾，確保沒(méi)有反射以后胸部和頸部剃毛。使用醫(yī)用膠布將動(dòng)物四肢和門(mén)齒固定于恒溫手術(shù)臺(tái)，溫度設(shè)定37℃，碘伏消毒手術(shù)區(qū)域。用眼科剪在小鼠頸部和胸部中線位置縱向切開(kāi)皮膚0.5～1 cm。使用眼科鑷輕輕分離結(jié)締組織和氣管中線兩側(cè)肌肉。用眼科剪從鎖骨處開(kāi)始切至第二肋骨(約5 mm)。使用顯微鑷將胸腺兩葉彼此分離，此時(shí)可清晰看到主動(dòng)脈弓和兩條頸動(dòng)脈。用顯微鑷從左頸總動(dòng)脈和右無(wú)名動(dòng)脈之間，主動(dòng)脈弓下方輕輕穿過(guò)，夾住6-0尼龍縫合線小心拉出(結(jié)扎位置見(jiàn)圖 1)。將自制L型26G墊針?lè)乐林鲃?dòng)脈弓旁，將主動(dòng)脈弓與L型墊針結(jié)扎固定，打三個(gè)結(jié)確保結(jié)扎穩(wěn)固，小心抽去墊針。主動(dòng)脈弓狹窄成功后可觀察到右頸總動(dòng)脈搏動(dòng)顯著增強(qiáng)。簡(jiǎn)單間斷縫合肌肉和皮膚，碘伏消毒傷口后置于保溫臺(tái)上恢復(fù)，蘇醒后放回籠具。假手術(shù)組方法一致，不結(jié)扎。術(shù)后3 d肌肉注射青霉素鈉，每只5000 U。術(shù)后一周應(yīng)用Vevo 1100超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)及MS400超聲探頭(探頭頻率：30 MHz)對(duì)主動(dòng)脈弓部進(jìn)行血流彩色超聲，檢測(cè)狹窄處血流速度。假手術(shù)組主動(dòng)脈弓血流速度峰值在600～900 mm/s，TAC組主動(dòng)脈弓狹窄處的血流速度峰值急劇升高，以假手術(shù)組血流速度峰值的兩倍(大于1600 mm/s)作為T(mén)AC術(shù)成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 心臟超聲檢查

應(yīng)用Vevo 1100超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)及MS400超聲探頭(探頭頻率：30 MHz)，分別于術(shù)后4、8、12周進(jìn)行超聲檢查小鼠心臟獲得M型超聲心動(dòng)圖像，分析圖像獲得左室舒張末期前壁厚度(IVS；d)，左室舒收縮末期前壁厚度(IVS；s)，左室舒張末期內(nèi)徑，左室收縮末期內(nèi)徑，左室舒張末期后壁厚度(LVPW；d)，左室舒收縮末期后壁厚度(LVPW；s)，左心室收縮末期容積，左心室舒張末期容積，左心室校正重量，射血分?jǐn)?shù)，短軸率，心輸出量，每搏輸出量(stroke volume，SV)等數(shù)據(jù)，分析連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期，取其平均值。

1.3.3 左心室質(zhì)量指數(shù)

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，小鼠稱重后CO2安樂(lè)死，打開(kāi)胸腔，取心臟，排盡心臟中血液，濾紙吸干去除左右心耳和主動(dòng)脈弓，去除右心室游離壁，剩余部分稱重作為左心室重量(LW)。將LW/體重(BW)作為左心室質(zhì)量指數(shù)。

1.3.4 病理組織學(xué)檢查

將心臟從正中部位橫向?qū)η谐蓛刹糠?，心尖部分放入中性甲醛固定，做常?guī)石蠟包埋、HE染色和Masson染色，應(yīng)用Nano Zoomer 2.0 RS數(shù)字切片掃描設(shè)備掃描病理切片，觀察心臟病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TAC術(shù)小鼠的存活情況及并發(fā)癥

手術(shù)過(guò)程中死亡的主要原因是胸膜破損(死亡2只)；結(jié)扎時(shí)用力過(guò)度導(dǎo)致主動(dòng)脈弓破裂(死亡1只)；抽去墊針時(shí)主動(dòng)脈弓破裂(死亡1只)；縫合時(shí)損傷肋間動(dòng)脈導(dǎo)致大出血(死亡1只)。術(shù)后一周內(nèi)部分動(dòng)物出現(xiàn)頭頸部水腫(死亡1只)，其余動(dòng)物自行緩解。術(shù)后1周總存活率為75%(18/24)。假手術(shù)組6只全部存活。

2.2 模型鑒定

術(shù)后1周應(yīng)用超聲多普勒檢測(cè)主動(dòng)脈弓狹窄處血流速度，TAC組血流速度峰值均大于1600 mm/s(圖2)。

2.3 左心室質(zhì)量指數(shù)

TAC術(shù)后不同時(shí)期BW、LW和LW/BW值的比較結(jié)果如圖3所示。由圖可見(jiàn)BW、LW及LW/BW值隨時(shí)間逐漸升高，與假手術(shù)組比，TAC術(shù)后4周均有非常顯著性差異(P<0.001)，且TAC術(shù)后4周、8周、12周LW/BW均有非常顯著性差異(P<0.01)。

圖1 主動(dòng)脈弓狹窄部位示意圖Figure 1 Schematic diagram of aortic arch stenosis

注：A：假手術(shù)組小鼠主動(dòng)脈弓部血流彩色超聲;B：假手術(shù)組小鼠主動(dòng)脈弓部脈沖多普勒血流頻譜;C: TAC術(shù)后小鼠主動(dòng)脈弓部血流彩色超聲;D：TAC術(shù)后小鼠主動(dòng)脈弓部脈沖多普勒血流頻譜。圖2 TAC術(shù)后模型鑒定Note. A, Color ultrasound of aortic arch blood flow in mice in the sham-operatedgroup. B, Pulse Doppler flow spectrum of aortic arch in the sham-operatedgroup. C, Color ultrasound of aortic arch blood flow in mice after TAC. D, Pulse Doppler flow spectrum of aortic arch in mice after TAC.Figure 2 Model identification after TAC

注：與假手術(shù)組(Sham)比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與TAC術(shù)后4周比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與TAC術(shù)后8周比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 術(shù)后不同時(shí)期體重(BW)、左心室重量(LW)、左心室質(zhì)量指數(shù)的比較Note. Compared with the sham-operated group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the 4 week after TAC group,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001. Compared with the 8 week after TAC group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Figure 3 Comparison of body weight (BW), left ventricular weight (LW),left ventricular mass index at different time points after operation

2.4 TAC術(shù)后不同時(shí)期心臟超聲檢查

分別在TAC術(shù)后4周、8周、12周對(duì)小鼠做心臟超聲檢查，如圖4，可見(jiàn)心室明顯增厚。由心超分析得到各指標(biāo)檢查結(jié)果如圖5所示，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組對(duì)比，術(shù)后4周小鼠左室舒張末期前壁厚度，左室收縮末期前壁厚度，左心室校正重量，心率，心輸出量等均有非常顯著性差異(P<0.01)。術(shù)后8周小鼠較假手術(shù)組，左室收縮末期內(nèi)徑，左室舒收縮末期后壁厚度，射血分?jǐn)?shù)，短軸率，左心室收縮末期容積等也出現(xiàn)非常顯著性差異(P<0.01)。至術(shù)后12周，對(duì)比假手術(shù)組，左室舒張末期內(nèi)徑，左室收縮末期內(nèi)徑，左心室舒張末期容積等進(jìn)一步變化，具非常顯著性差異(P<0.01)。

2.5 TAC術(shù)后不同時(shí)期心肌病理組織學(xué)檢查

TAC術(shù)后4周、8周、12周對(duì)小鼠心肌做病理組織學(xué)檢查，較假手術(shù)組，心肌組織不同程度發(fā)生變化。心肌HE染色結(jié)果如圖6所示，術(shù)后不同時(shí)期心臟體積不同程度增大。如圖6可見(jiàn)假手術(shù)組心肌纖維排列緊密整齊，細(xì)胞核形態(tài)正常，未見(jiàn)異常；TAC術(shù)后4周、8周、12周可見(jiàn)不同程度的心肌纖維不規(guī)則排列，斷裂溶解，肌纖維間間隙增大，且術(shù)后12周明顯可見(jiàn)病變組織。

心肌Masson染色結(jié)果如圖6所示，膠原纖維顯藍(lán)色，肌纖維顯紅色，細(xì)胞核顯黑藍(lán)色[12]。假手術(shù)組染色均勻，組織間無(wú)明顯膠原增生；TAC術(shù)后4周血管周圍明顯膠原增生；術(shù)后8周除血管周圍，心肌組織間也出現(xiàn)膠原增生；術(shù)后12周，血管周圍以及組織間可見(jiàn)大量膠原增生，心肌組織明顯纖維化，可見(jiàn)心臟已超負(fù)荷至發(fā)生病變。

3 討論

注：A：假手術(shù)組，B：TAC術(shù)后4周，C：TAC術(shù)后8周，D：TAC術(shù)后12周。圖4 假手術(shù)組與術(shù)后不同時(shí)期心臟超聲圖Note. A,Sham-operated group.B,4 weeks after TAC.C,8 weeks after TAC.D,12 weeks after TAC.Figure 4 Cardiac ultrasound of sham group and different periods after operation

注：與假手術(shù)組(Sham)比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與TAC術(shù)后4周比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與TAC術(shù)后8 周比&P<0.05，&&P<0.01，&&&P<0.001。圖5 TAC術(shù)后不同時(shí)期心臟超聲檢查的比較Note. Compared with the sham-operated group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the 4 weeks after TAC group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001. Compared with the 8 weeks after TAC group,&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001.Figure 5 Comparison of echocardiography in different periods after TAC

圖6 假手術(shù)組和TAC術(shù)后不同時(shí)期心肌組織鏡檢Figure 6 Microscopic examination of myocardial tissue in sham-operated group and different periods after operation

隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展進(jìn)程，各種心血管疾病高發(fā)，心率衰竭發(fā)病率逐年增高[13]。同時(shí)由于年輕人的不當(dāng)作息，心力衰竭也在年輕一代高發(fā)，臨床上對(duì)該疾病也展開(kāi)了許多的研究，但心衰成因機(jī)制多樣[14]，防治工作形勢(shì)依然嚴(yán)峻，至今未有對(duì)各類心衰均治療有效地理想的治療方案。而在心衰治療的研究上，構(gòu)建具有代表性，與人類疾病接近的動(dòng)物模型則是最堅(jiān)實(shí)又關(guān)鍵的一步?，F(xiàn)階段，應(yīng)用于臨床上的小鼠心衰造模方法也有很多，化學(xué)類藥物誘導(dǎo)和物理手術(shù)造模方法較為常用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)采用改良的TAC法造模，是考慮到物理方法相對(duì)于藥物誘導(dǎo)對(duì)小鼠生理功能的影響較小，實(shí)驗(yàn)成本小，且成功率高等優(yōu)點(diǎn)[15]。同時(shí)，采用改良的非開(kāi)胸式的TAC法，可以降低因手術(shù)造成的死亡率。但在整個(gè)操作過(guò)程中，仍需格外小心，在本實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)了因操作誤差導(dǎo)致小鼠的死亡的現(xiàn)象，故在操作時(shí)的專注認(rèn)真也是造模成功的關(guān)鍵之處。需要注意的是，在操作時(shí)，須注意不破壞胸膜，否則會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物氣胸死亡?？p合線結(jié)扎力度須適中，防止勒破主動(dòng)脈弓。抽去墊針時(shí)要注意力度，以免主動(dòng)脈弓破裂?？p合過(guò)程要盡可能小心，避免縫合針誤傷肋間動(dòng)脈導(dǎo)致小鼠出血過(guò)多死亡。

按照改良的TAC法構(gòu)建小鼠心力衰竭模型，從心動(dòng)超聲成像，左心室質(zhì)量指數(shù)，病理組織學(xué)檢查等多個(gè)角度來(lái)綜合評(píng)價(jià)心臟功能及心衰程度，多方位驗(yàn)證該方法是否可行。心超多項(xiàng)與心衰相關(guān)指數(shù)呈顯著性差異，如左心室舒張期、收縮期前壁厚壁均顯著性增厚，左室內(nèi)徑在術(shù)后12周也顯著性增大，左心室質(zhì)量增大，左心室質(zhì)量指數(shù)顯著性增加容積增大，說(shuō)明在主動(dòng)脈弓縮窄后，導(dǎo)致心室(舒張期或和收縮期)負(fù)荷過(guò)重，心室異常肥大；射血分?jǐn)?shù)和短軸率顯著性減小，均顯示心肌收縮功能受損[16]。每搏輸出量在術(shù)后4周增大，至術(shù)后12周開(kāi)始降低，顯示心臟在TAC術(shù)后12周開(kāi)始功能衰退。同時(shí)心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果明顯可見(jiàn)心肌不同程度病變，且采用HE染色和Masson染色兩種方法，互相補(bǔ)充，通過(guò)HE染色，觀察心肌纖維的形態(tài)、排列[17]，Masson染色進(jìn)一步觀察心肌組織的膠原增生等組織異常變化[18]。綜上，各角度共同驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用TAC法建立的小鼠心衰模型成功，可進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，探究治療心衰有效的治療方案，造福于人類社會(huì)。