預(yù)培湯對鄰苯二甲酸二（2－乙基）己酯染毒大鼠胚胎發(fā)育及氧化應(yīng)激的影響

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院 杭州 310007

鄰苯二甲酸二 （2－乙基） 己酯 （di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）作為一種典型增塑劑被廣泛應(yīng)用于食品包裝材料、容器、兒童玩具、醫(yī)療用品、化妝品及人造革等[1-3]。近年的研究表明，DEHP及其代謝產(chǎn)物具有明顯的生殖和發(fā)育毒性，可在妊娠早期干擾著床過程、造成胚胎丟失，并在妊娠中晚期影響胎盤及胎兒發(fā)育[4-7]，但是目前尚沒有公認(rèn)有效的防治方法。第五批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師傅萍教授總結(jié)了四十余年的臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)培其損的治則提出了經(jīng)驗(yàn)方預(yù)培湯，該方由黃芪、黨參、熟地、山藥、茯苓、白術(shù)、當(dāng)歸、白芍、川芎、甘草組成，有培本益元、抗毒安胎的功效。臨床上傅萍教授常以預(yù)培其損法治療各種滑胎患者，療效顯著[8]。本研究以DEHP暴露妊娠大鼠模型為研究對象，觀察預(yù)培湯干預(yù)對大鼠胚胎發(fā)育及胎盤組織學(xué)改變的影響，并基于胎盤組織總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSHPx）、 過氧化氫酶 （catalase，CAT）、 活性氧（reactive oxygen species，ROS）、 丙 二 醛 （malondialdehyde，MDA）等指標(biāo)，探討預(yù)培湯可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級70d齡健康未生育雌性SD大鼠36只，體質(zhì)量230～260g；性成熟雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量300～350g，均購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0006]，均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]，飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對濕度40%～60%，自由飲食和進(jìn)水。

1.2 染毒物質(zhì)及藥物 DEHP（分析純，濃度≥99.5%）購于美國Sigma公司（批號：20180105）；玉米油（試劑級）購于杭州昊鑫生物科技有限公司（批號：20180108）。預(yù)培湯處方：黃芪15g，黨參15g，熟地12g，淮山藥12g，白術(shù) 9g，茯苓 12g，當(dāng)歸 9g，白芍 9g，川芎 9g，甘草 5g。所有藥物均由杭州市中醫(yī)院中藥房提供，制備成含生藥4.4g·mL-1的溶液。 在開始正式實(shí)驗(yàn)前，選擇1.1g·mL-1、2.2g·mL-1、4.4g·mL-1分別作為低、中、高劑量組進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示，低、中劑量組與模型組比較，各指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故將4.4g·mL-1作為預(yù)培湯煎液的最終濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。中藥灌胃等效劑量換算參考文獻(xiàn)[9]中的人與動物體表面積折算比率表。

1.3 主要試劑和儀器 T-AOC檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒及MDA檢測試劑盒均購于南京建成生物研 究 所 （批 號 ：20190220、20190126、20190124、20190413、20190421、20190108）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染液購于北京Solarbio公司（批號：G1120）。RM2016切片機(jī)和EG1150包埋機(jī)購于德國萊卡公司；BX51T-PHD-J11顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；GL-400SD超聲波細(xì)胞破碎儀購于南京先歐儀器制造有限公司；5810R型臺式高速冷凍離心機(jī)購于德國Eppendorf公司；Filtermax F5多功能酶標(biāo)儀購于奧地利Molecular Devices公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 將36只雌性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、預(yù)培湯組，每組12只，與雄性SD大鼠同籠（雌雄比例1:1），次日8:00檢查有無陰道栓，如發(fā)現(xiàn)陰道栓則提示妊娠，將當(dāng)天記錄為妊娠0d，以此推算妊娠日期。從妊娠0d開始，對照組每日上午予玉米油10mL·kg-1灌胃，下午予0.9%氯化鈉溶液10mL·kg-1灌胃；模型組每日上午予 DEHP 500mg·kg-1灌胃，下午予0.9%氯化鈉溶液10mL·kg-1灌胃；預(yù)培湯組每日上午予DEHP 500mg·kg-1灌胃，下午予預(yù)培湯煎液10mL·kg-1灌胃，各組均持續(xù)灌胃至妊娠18d。給藥期間每日稱量大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量，至妊娠第19天處死孕鼠，剖腹取出胎鼠，稱量胎鼠質(zhì)量，記錄各組孕鼠妊娠胎數(shù)以及其中的活胎數(shù)、死胎數(shù)、明顯外觀畸形胎數(shù)；并記錄各組胎盤外觀、色澤、體質(zhì)量。取約0.2g胎盤組織，以PBS沖洗干凈，4%甲醛固定24h后石蠟包埋，連續(xù)切片行病理學(xué)檢測；另取約0.2g胎盤組織，以液氮快速冷卻后，-80℃超低溫冰箱保存，用于氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測。

1.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測

1.5.1 胎盤組織病理學(xué)檢測 每個(gè)樣本取相同部位胎盤組織，4%甲醛固定24h后石蠟包埋、切片，采用HE染色，置于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 大鼠胎盤組織經(jīng)冰冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗后，濾紙拭干，稱重后剪碎，以玻璃勻漿器研磨，制成10%勻漿液，離心后取上清液，分別檢測組織勻漿中 T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、ROS和MDA的水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本相應(yīng)指標(biāo)的測定值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組計(jì)量資料比較前，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不滿足則采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 按照雌雄比例1:1連續(xù)合籠8d后各組大鼠受孕情況如下：對照組11只、模型組10只、預(yù)培湯組11只。灌胃過程中，各組大鼠一般情況良好，毛發(fā)整齊，光亮潤澤，反應(yīng)靈敏，飲食進(jìn)水未見明顯異常，無動物死亡。

2.2 各組孕鼠孕期體質(zhì)量增加量及妊娠結(jié)局 各組大鼠孕早期（0～10d）體質(zhì)量增加量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；模型組大鼠孕中后期（10～18d）體質(zhì)量增加量明顯低于對照組 （P＜0.05），預(yù)培湯組大鼠孕中后期（10～18d）體質(zhì)量增加量高于模型組(P＜0.05）。 各組孕鼠妊娠胎數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；各組均未發(fā)現(xiàn)明顯外觀畸形胎鼠，對照組、預(yù)培湯組總死胎數(shù)較模型組明顯減少。見表1。

2.3 各組胎鼠及胎盤一般情況比較 除死胎形成的吸收胎盤之外，各組孕鼠胎盤無明顯外觀差異。見圖1。模型組胎鼠體質(zhì)量低于對照組（P＜0.05），預(yù)培湯組胎鼠體質(zhì)量高于模型組（P＜0.05）；各組大鼠胎盤體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。 見表 2。

2.4 各組大鼠胎盤組織病理結(jié)果比較 模型組大鼠胎盤結(jié)構(gòu)較亂，其海綿滋養(yǎng)層明顯疏松雜亂，出現(xiàn)較多空泡。預(yù)培湯組大鼠胎盤結(jié)構(gòu)完整，層次明顯清晰，由內(nèi) （子體面）到外 （母體面），迷路帶（labyrinth zone）、海綿滋養(yǎng)層（sponge trophoblast）、巨細(xì)胞滋養(yǎng)層（giant cell trophoblast）均清晰可見，各層中細(xì)胞分布均優(yōu)于模型組。見圖2。

2.5 各組大鼠胎盤氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 模型組TAOC、GSH-Px、SOD、CAT 水平顯著低于對照組 （P＜0.01），ROS、MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；預(yù)培湯組T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT 水平高于模型組 （P＜0.05，P＜0.01），ROS、MDA 水平則明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表1 各組大鼠孕期體質(zhì)量增加量及妊娠結(jié)局比較（±s）Tab.1 Comparison of the weight gain during pregnancy and pregnancy outcome in each group(±s)

表1 各組大鼠孕期體質(zhì)量增加量及妊娠結(jié)局比較（±s）Tab.1 Comparison of the weight gain during pregnancy and pregnancy outcome in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,△P＜0.05

組別 n 孕早期體質(zhì)量增加量（g）孕中后期體質(zhì)量增加量（g） 妊娠胎數(shù)（只） 活胎數(shù)（只） 死胎數(shù)（只） 總死胎數(shù)（只）對照組 11 19.8±2.17 56.09±2.16 12.45±0.45 11.7±0.41 0.72±0.27 6模型組 10 21.40±3.47 47.40±2.44* 12.20±0.33 10.90±0.50 1.30±0.37 13預(yù)培湯組 11 22.45±2.54 54.25±1.80△ 11.45±1.05 11.1±1.00 0.36±0.20 4

圖1 活胎胎盤與死胎胎盤外觀比較Fig.1 Comparison of the appearance of live placenta and stillbirth placenta

表2 各組胎鼠及胎盤體質(zhì)量比較（±s）Tab.2 Comparison of fetal rat and placental weight in each group(±s)

表2 各組胎鼠及胎盤體質(zhì)量比較（±s）Tab.2 Comparison of fetal rat and placental weight in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,△P＜0.05

組別 n 胎鼠體質(zhì)量（g） 胎盤體質(zhì)量（g）對照組 11 1.91±0.038 0.40±0.021模型組 10 1.73±0.065* 0.41±0.022預(yù)培湯組 11 1.90±0.049△ 0.42±0.019

圖2 各組大鼠胎盤組織病理結(jié)果比較（HE染色，100×）Fig.2 Comparison of histopathological results of placenta in each group(HE staining,100×)

表3 各組大鼠胎盤氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）Tab.3 Comparison of placental oxidative stress indicators in each group(±s)

表3 各組大鼠胎盤氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）Tab.3 Comparison of placental oxidative stress indicators in each group(±s)

注：與對照組比較， **P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Note:Compared with control group,**P＜0.01;compared with model group, △P＜0.05, △△P＜0.01

組別 T-AOC（mmol·g-1） GSH-Px（U·mg-1） SOD（U·mg-1） CAT（U·mg-1） ROS（RLU·mg-1） MDA（nmol·mg-1）對照組 1.09±0.69 27.52±1.22 66.86±4.83 68.54±3.32 906.10±41.94 3.91±0.19模型組 0.66±0.05** 18.02±0.59** 41.64±3.34** 39.20±2.55** 2 505.45±256.39** 6.88±0.36**預(yù)培湯組 0.82±0.03△ 25.15±0.96△△ 50.51±2.60△ 55.73±2.42△△ 1 818.39±75.08△ 5.37±0.33△

3 討論

隨著社會的不斷發(fā)展，環(huán)境污染已經(jīng)成為一個(gè)全球性的問題。其中一部分可以影響機(jī)體內(nèi)分泌功能，對機(jī)體健康造成損害的環(huán)境化合物被稱為“環(huán)境內(nèi)分泌 干 擾 物 （environmental endocrine disruptors，EEDs）”。DEHP作為其中的典型代表，對人體生殖功能和生長發(fā)育都有較大的危害，目前關(guān)于其雄性生殖毒性已有較多研究[10]。與男性比較，女性更多地使用化妝品、洗滌用品、香水等，更容易暴露于DEHP環(huán)境中；而且妊娠期母體及胚胎對有害因素更加敏感，因此DEHP對于孕婦和胎兒的影響更加明顯。已有研究表明，DEHP長期暴露不僅會干擾女性內(nèi)分泌功能，影響生長發(fā)育；還會導(dǎo)致女性妊娠率降低、流產(chǎn)率增加[11-13]。但目前尚無可靠的文獻(xiàn)研究表明某藥物或治療方案可拮抗DEHP的胚胎發(fā)育毒性，故本研究未設(shè)置相關(guān)陽性對照組。

從中醫(yī)病因?qū)W來看，DEHP等環(huán)境污染致病因素是一種“毒”，作為一種致病因子直接損傷胎元，或造成母體臟腑氣血陰陽的失調(diào)，損及沖任，導(dǎo)致流產(chǎn)或胚胎發(fā)育受損。本研究謹(jǐn)遵中醫(yī)“治未病”的思想，以傅萍教授的經(jīng)驗(yàn)方預(yù)培湯為干預(yù)因素，探討預(yù)培湯防治DEHP生殖毒性的作用以及可能機(jī)制。黃芪，味甘，性溫，功效補(bǔ)氣固表、扶正解毒；黨參，味甘，性平，能補(bǔ)中益氣、扶正祛邪，二者俱為扶正祛毒要藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)二者不僅能提高機(jī)體免疫力，還具有顯著的抗氧化作用，能拮抗多種不良因素對機(jī)體的氧化損傷[14-15]。本方以黃芪、黨參益氣抗毒為君藥；熟地、山藥益養(yǎng)先天，白術(shù)、茯苓顧護(hù)后天，當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血和血，三組藥對協(xié)同參、芪“預(yù)培其本”，共為臣藥；川芎行氣活血、補(bǔ)而不滯，為佐藥；甘草解毒且補(bǔ)益中焦，能調(diào)和諸藥，為使藥。全方具有培本固元、抗毒解毒之功，可使機(jī)體達(dá)到“氣血充盈，百病不生”的良好狀態(tài)，抵御DEHP的生殖毒性，起到抗毒保胎之效。本研究結(jié)果提示，模型組大鼠孕期體質(zhì)量增加量較低，胎鼠體質(zhì)量明顯降低，總死胎數(shù)有所增加，證實(shí)了DEHP暴露對大鼠胚胎發(fā)育的損傷作用；而預(yù)培湯干預(yù)后，大鼠孕期體質(zhì)量增加量、胎鼠體質(zhì)量均明顯高于模型組，總死胎數(shù)也相應(yīng)減少，提示預(yù)培湯對DEHP的生殖毒性具有一定的拮抗作用。

胎盤是支持胚胎發(fā)育的關(guān)鍵器官，也是DEHP生殖毒性的重要靶器官。近年對DEHP體內(nèi)代謝的研究發(fā)現(xiàn)，人類孕婦胎盤組織及新生兒臍血中均已檢測到DEHP的代謝產(chǎn)物[16-17]。本研究結(jié)果提示，模型組大鼠胎盤海綿滋養(yǎng)層明顯疏松雜亂，出現(xiàn)較多空泡；而預(yù)培湯組胎盤組織結(jié)構(gòu)層次分明，各層中細(xì)胞分布較為均勻緊密，均優(yōu)于模型組，提示預(yù)培湯可以保護(hù)胎盤組織，拮抗DEHP的胚胎毒性，改善妊娠結(jié)局。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)發(fā)生失衡，產(chǎn)生過量氧自由基，損傷正常組織的反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，DEHP會顯著消耗機(jī)體T-AOC，降低GSH-Px、SOD、CAT活性，導(dǎo)致組織ROS水平顯著升高，產(chǎn)生過量脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA，從而損傷胎盤組織。預(yù)培湯組各氧化應(yīng)激指標(biāo)均明顯優(yōu)于模型組，提示預(yù)培湯可能的作用機(jī)制是拮抗氧化損傷，從而保護(hù)胚胎，改善妊娠結(jié)局。

綜上所述，中藥預(yù)培湯可減少DEHP對大鼠胎盤組織的損傷，改善染毒大鼠妊娠結(jié)局，其機(jī)制可能與糾正DEHP引起的胎盤組織內(nèi)氧化應(yīng)激失衡有關(guān)。本研究為中醫(yī)藥防治DEHP的生殖毒性提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但本研究設(shè)計(jì)較為簡單，未深入研究相關(guān)機(jī)制，對子代的觀察也尚停留在早期階段。今后的研究需要更長的觀察來評估藥物的影響，并進(jìn)一步發(fā)掘具體的作用機(jī)制。