高效液相色譜法測定靜電層層自組裝載藥多層膜中葛根素的載藥量

楊佳盈 盛振華 胡曉芬

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院

靜電層層自組裝多層膜是以聚陽離子、聚陰離子為組裝基元，利用靜電相互作用，由組裝基元在基材表面交替沉積構(gòu)筑而成[1]。以天然多糖為組裝基元的靜電層層自組裝過程，可賦予多層膜獨特的生物活性[2-4]。大量研究表明，以具有促進血管內(nèi)皮細胞生長作用的殼聚糖作為聚陽離子，以抗凝作用確切、臨床應(yīng)用廣泛的抗凝劑肝素作為聚陰離子，通過靜電層層自組裝技術(shù)構(gòu)筑的殼聚糖/肝素多層膜涂層在生物相容性、生物降解性、促血管早期內(nèi)皮修復(fù)及抗血栓等方面具有顯著優(yōu)勢，可應(yīng)用于構(gòu)筑冠狀動脈粥樣硬化性心臟病介入支架的表面涂層[5-8]。

利用預(yù)包載藥物分子的組裝基元制備靜電層層自組裝多層膜，是構(gòu)筑具有藥物洗脫、局部釋藥作用的醫(yī)用植入體涂層的重要策略之一[9-11]。葛根素是從中藥葛根中分離的異黃酮類衍生物，可抑制平滑肌細胞增殖，保護心血管系統(tǒng)[12-13]。將葛根素載入表面呈電負性的聚合物混合膠束，利用殼聚糖與膠束的靜電作用形成電正性的葛根素-殼聚糖/膠束預(yù)組裝體，通過靜電層層自組裝技術(shù)，在基材表面交替組裝肝素與葛根素-殼聚糖/膠束預(yù)組裝體，可獲得基于殼聚糖與肝素的載藥多層膜。本研究利用十二烷基硫酸鈉溶液崩解載藥多層膜，建立高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定多層膜中葛根素載藥量的方法。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試藥 LC-20AT高效液相色譜儀購于日本島津公司；反滲透凈水儀購于艾歐史密斯（中國）熱水器有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器購于昆山市超聲儀器有限公司；FD-1000冷凍干燥機為日本EYELA公司產(chǎn)品；XS分析天平購于梅特勒-托利多公司。葛根素對照品購自南通飛宇生物科技有限公司（純度＞99%，批號：FY12390810）；殼聚糖購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司（中粘度200～400mPa·s，批號：F1917173）；Pluronic?F127（F127）購自 Sigma-Aldrich試劑有限公司（批號：BCBC6633）；肝素鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司 （優(yōu)級純，批號：20131017）； 末端磺酸化的 Pluronic?P123（P123-SO3）由實驗室自制[14]；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 靜電層層自組裝多層膜的制備 利用薄膜水化法將葛根素載入電負性的聚合物混合膠束[14]，具體步驟如下：將濃度為75mg·mL-1的葛根素甲醇溶液1mL 逐滴加入含有 10mg·mL-1P123-SO3/F127（1/4，w/w）的 10mL 醋酸緩沖溶液（pH=4，0.1mol·L-1）中，磁力攪拌過夜，旋蒸除去多余的甲醇，0.45μm醋酸纖維素微孔濾膜過濾，制得載藥混合膠束溶液。

將濃度為2mg·mL-1的殼聚糖醋酸緩沖溶液（pH=4，0.1mol·L-1）10mL 滴加至載藥混合膠束溶液中，充分攪拌，制得電正性的葛根素-殼聚糖/膠束預(yù)組裝體溶液。在相同條件下，使殼聚糖與P123-SO3/F127混合膠束作用，制得殼聚糖/膠束預(yù)組裝體溶液。

石英片（1cm×2cm）在濃硫酸/H2O2溶液（7/3，v/v）中煮沸30min，三蒸水沖洗數(shù)次，氮氣吹干，在1mg·mL-1的聚乙烯亞胺醋酸緩沖溶液（pH=4，0.1mol·L-1）中浸泡 30min，取出后在醋酸緩沖溶液（pH=4，0.1mol·L-1）中清洗數(shù)次，氮氣吹干，制得表面呈正電性的基材。將基材浸入1mg·mL-1的肝素醋酸緩沖溶液（pH=4，0.1mol·L-1），浸泡 10min，取出清洗、吹干后浸入葛根素-殼聚糖/膠束預(yù)組裝體溶液，浸泡10min，取出清洗、吹干；肝素與載藥預(yù)組裝體在基材表面交替沉積數(shù)次，分別制得組裝層數(shù)為10、15和20雙層的載藥多層膜。在相同條件下，使殼聚糖/膠束預(yù)組裝體與肝素在基材表面交替沉積，制得空白多層膜。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-0.2%甲酸(18/82，v/v)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：250nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

1.2.3 溶液配制

1.2.3.1 葛根素對照品儲備液 精密稱取葛根素對照品，甲醇溶解、定容，制得濃度為0.1mg·mL-1的葛根素對照品儲備液。

1.2.3.2 供試品溶液 將載藥多層膜浸沒于十二烷基硫酸鈉飽和溶液（0.25mol·L-1），超聲 30min，37℃水浴振蕩過夜后，收集崩解液，冷凍干燥。精密稱取凍干產(chǎn)品，甲醇溶解、定容，制得濃度為25mg·mL-1的溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.2.3.3 空白溶液 將空白多層膜按照1.2.3.2中的方法操作，制得空白溶液。

1.2.4 專屬性試驗 將葛根素對照品儲備液稀釋備用。分別取0.05mg·mL-1葛根素對照品溶液、供試品溶液和空白溶液，按照1.2.2中所述色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。

1.2.5 線性試驗 精密量取葛根素對照品儲備液1mL，甲醇稀釋、定容，分別得到濃度為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μg·mL-1的系列對照品溶液，以 0.45μm微孔濾膜過濾，按照1.2.2項所述色譜條件進樣檢測，以進樣濃度（μg·mL-1）為橫坐標（x）、葛根素峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸，得出標準曲線方程。

1.2.6 精密度試驗 精密量取濃度為 2.0、6.0、12.0μg·mL-1的葛根素對照品溶液，分別連續(xù)進樣6次，記錄葛根素峰面積，依據(jù)標準曲線方程計算葛根素檢出量。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取15雙層載藥多層膜的供試品溶液，分別于 0、1、2、4、6、8、12、24h 進樣檢測，記錄葛根素峰面積，計算多層膜中葛根素的載入量。

1.2.8 重復(fù)性試驗 精密稱取10雙層載藥多層膜的凍干產(chǎn)品，按1.2.3.2所述方法分別制備5份供試品溶液，進樣檢測，記錄葛根素峰面積，計算多層膜中葛根素的載入量。

1.2.9 空白回收率試驗 精密稱取一定量的葛根素對照品，加入十二烷基硫酸鈉飽和溶液（0.25mol·L-1），將空白多層膜浸沒于該溶液中，按1.2.3.2中所述方法操作，超聲、水浴振蕩過夜，獲得崩解液，冷凍干燥后精密稱取凍干產(chǎn)品，制備供試品溶液，進樣檢測葛根素含量，計算回收率。

1.2.10 多層膜載藥量測定 制備3批組裝層數(shù)分別為10、15和20雙層的載藥多層膜，按照1.2.3.2中所述方法，每批樣品制備3份供試品溶液，進樣檢測，計算多層膜中葛根素的載入量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗 葛根素的保留時間約為24min，空白溶液在葛根素保留時間處無干擾峰。見圖1。表明多層膜組裝基元不干擾葛根素的定量檢測，顯示本方法專屬性較好。

2.2 線性試驗 線性回歸分析得到回歸方程為：y=6.043×104x-2.229×104，r=0.9994。 結(jié)果表明，葛根素濃度在2.0～12.0μg·mL-1范圍時，其濃度與出峰面積具有良好的線性關(guān)系。

圖1 HPLC專屬性考察色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of specificity investigation

2.3 精密度試驗 結(jié)果顯示，低、中、高濃度進樣時，葛根素峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.25%、0.73%和0.42%。 見表1。表明本方法的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗 葛根素通過自組裝作用載入多層膜后，于崩解液中釋放，經(jīng)凍干、復(fù)溶后配制成供試品溶液。專屬性試驗的結(jié)果驗證了葛根素在供試品溶液配制過程中的穩(wěn)定性，供試品溶液中藥物的保留時間與對照品溶液一致。將供試品溶液24h內(nèi)多次進樣，測得多層膜中葛根素的平均載入量為2.52μg·cm-2，RSD為0.24%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表1 精密度試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of precision test(n=6)

2.5 重復(fù)性試驗 平行制備5份供試品溶液，分別進樣檢測，測得多層膜中葛根素的平均載入量為2.02μg·cm-2，RSD 為 1.59%。

2.6 空白回收率試驗 空白溶液制備過程中加入低、中、高劑量（1.00、2.00、4.00mg）的葛根素，考察包括崩解、凍干、溶液配制、進樣檢測在內(nèi)的一系列實驗步驟可能引起的藥物損失。結(jié)果表明，藥物損失在允許范圍內(nèi)。見表2。

2.7 多層膜的載藥量測定 分別制備10、15和20雙層載藥多層膜的供試品溶液，依次進樣檢測，當(dāng)多層膜組裝層數(shù)由10雙層增加至20雙層時，單位面積多層膜中葛根素含量顯著增加，葛根素含量分別為（1.92±0.54）μg·cm-2、（2.58±0.52）μg·cm-2和 （4.23±0.77）μg·cm-2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 空白回收率試驗結(jié)果（n=5）Tab.2 Results of recovery test based on blank samples(n=5)

3 討論

近年來，越來越多的研究將中藥活性組分作為客體分子載入基于高分子材料構(gòu)筑的藥物控釋載體中，以達到延長藥物半衰期、提高藥物生物利用度、降低不良反應(yīng)、實現(xiàn)靶向治療等目的[15-16]。與光譜法、滴定法等其他定量檢測技術(shù)比較，HPLC技術(shù)可同時實現(xiàn)混合物的分離與定量檢測，在表征高分子藥物載體系統(tǒng)的載藥量方面具有顯著的優(yōu)勢。

葛根素在心腦血管疾病治療方面具有良好的療效，本課題組曾報道HPLC技術(shù)檢測殼聚糖微球制劑中葛根素含量的方法，色譜條件的確定與載體系統(tǒng)高分子材料結(jié)構(gòu)特點密切相關(guān)[17]。在酸性溶液中，殼聚糖結(jié)構(gòu)單元上的氨基質(zhì)子化，可消除其與葛根素間的氫鍵作用，確保HPLC檢測時葛根素峰的有效分離。本研究以甲醇-0.2%甲酸（18/82）為流動相，供試品溶液中的殼聚糖、肝素等聚電解質(zhì)組分未與葛根素形成分子間作用，對藥物的定量檢測不產(chǎn)生干擾。

本研究構(gòu)筑了基于Pluronic聚合物及天然多糖殼聚糖、肝素的靜電組裝多層膜作為葛根素的載體涂層，而崩解多層膜以獲得含有游離藥物的溶液是進行HPLC檢測的首要步驟。研究證實，將靜電組裝多層膜浸沒于十二烷基硫酸鈉飽和溶液中充分孵育，利用離子作用崩解多層膜，具有高效、溫和的特點，且不影響藥物分子的穩(wěn)定性[18]。本研究專屬性試驗結(jié)果表明，供試品溶液的主峰保留時間與葛根素對照品一致，驗證了葛根素的穩(wěn)定性。崩解液的凍干粉末在流動相甲醇-0.2%甲酸溶液中形成均質(zhì)溶液，葛根素在溶液中處于游離狀態(tài)。葛根素的保留時間與流動相中甲醇含量相關(guān)，降低甲醇含量可延長葛根素的保留時間，使其與多層膜組裝基元材料、崩解劑等雜質(zhì)有效分離。

本課題組前期研究表明，基于預(yù)組裝體的靜電層層自組裝過程往往呈現(xiàn)非線性增長的特點[9,14]。本研究對多層膜載藥量的定量檢測結(jié)果顯示，葛根素-殼聚糖/膠束預(yù)組裝體在多層膜中的含量隨著組裝層數(shù)的增加而增加，載藥量隨之增加，也呈非線性增長的趨勢。

綜上所述，利用HPLC法定量檢測靜電層層自組裝載藥多層膜中葛根素的載藥量，樣品前處理方法簡便、溫和，制樣及檢測過程中葛根素載藥量穩(wěn)定，檢測精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性等良好，能夠滿足分析要求。該研究為深入探討載藥多層膜的性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，也為靜電層層自組裝多層膜的載藥量研究提供了參考。