基于全程質(zhì)量控制理念的杜仲顆粒特征圖譜研究

馬永青，王璐，劉穎，劉永利

摘要：為明確杜仲顆粒生產(chǎn)過程中水溶性成分的轉(zhuǎn)移情況，提供更為全面的質(zhì)量控制方法，采用HPLC法對(duì)杜仲飲片、杜仲葉飲片、標(biāo)準(zhǔn)煎液與杜仲顆粒的特征圖譜進(jìn)行了相關(guān)性評(píng)價(jià)。使用Phenomenex（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，考察提取方式、提取溶劑及時(shí)間的影響。結(jié)果表明，選用超聲提取方式，以甲醇作為提取溶劑，反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)獲得的效果較好;在此優(yōu)化條件下建立特征圖譜分析方法，能夠使得杜仲顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與藥材保持一致，樣品質(zhì)量穩(wěn)定，制備工藝規(guī)范，幾個(gè)特征峰可全部在飲片中得到追溯，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間小于0.5%。所建立的特征圖譜專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可有效鑒別和評(píng)價(jià)杜仲顆粒的質(zhì)量，為制定系列品種的全面質(zhì)量控制方法提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);高效液相色譜法;杜仲飲片;杜仲葉飲片;杜仲顆粒;特征圖譜

中圖分類號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi： 10.7535/hbgykj.2020yx01010

Characteristic chromatogram of Duzhong granules on

whole process quality control concept

MA Yongqing1， WANG Lu1， LIU Ying2， LIU Yongli1

（1. Hebei Institute for Drug Control， Shijiazhuang， Hebei 050011， China;2. Hebei Province for Food and Drug Evaluation Certification Center， Shijiazhuang， Hebei 050011， China）

Abstract：In order to clarify the transfer of watersoluble components in the production process of Duzhong granules and provide a more comprehensive quality control method， HPLC method is used to evaluate the correlation between the characteristic maps of Eucommiae Cortex，Eucommiae Folium，standard decoction and Duzhong granules. The analysis is performed on Phenomenex C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， with acetonitrile0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase for gradient elution. The detection wavelength is set at 227 nm， the column temperature is maintained at 30 ℃ and flow rate is 1.0 mL/min. The effects of extraction method， extraction solvent and reaction time are investigated. The results show that the ultrasonic extraction method is selected， methanol is used as the extraction solvent， and the reaction time is 20 minutes. The analysis method of Duzhong granules characteristic map is established under the optimized conditions. The effective substance basis of Duzhong granules is consistent with that of medicinal materials， the sample quality is stable， the preparation process is standard， several characteristic peaks could be traced all in the decoction pieces， and the relative retention time of each common peak is small at 0.5%. The established characteristic map has strong specificity and good repeatability， which can effectively identify and evaluate the quality of Duzhong granules， and provide a certain reference for the quality detection methods of a series of varieties.

Keywords：chemistry of Chinese material medica;HPLC; Eucommiae Cortex; Eucommiae Folium; Duzhong granules; characteristic chromatogram

杜仲與杜仲葉分別為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮、干燥葉，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎之功效，用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈?zāi)垦！⑻?dòng)不安等癥的治療[1]。目前針對(duì)不同產(chǎn)地杜仲及杜仲葉中主要有效成分含量的報(bào)道較多[23]。杜仲飲片及杜仲葉飲片HPLC指紋圖譜的初步建立，可有效控制藥材的內(nèi)部質(zhì)量[45]。另外，研究發(fā)現(xiàn)鹽制過程對(duì)杜仲中環(huán)烯醚萜類及木脂素類成分的影響明顯[6]。中成藥質(zhì)量影響因素較多，如原藥材質(zhì)量、投料飲片質(zhì)量、提取制備工藝等。已有文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)量控制多集中在對(duì)成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究上[712]，對(duì)杜仲顆粒質(zhì)量全程控制的研究鮮有報(bào)道。

中藥特征圖譜技術(shù)能夠表征中藥整體質(zhì)量信息，反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分，在有效成分尚未完全闡明的情況下，有效表征中藥質(zhì)量，適用于控制中藥生產(chǎn)過程各環(huán)節(jié)中間體及成品質(zhì)量[1317]。本研究采用HPLC法建立杜仲顆粒的特征圖譜，考察杜仲顆粒生產(chǎn)過程重要環(huán)節(jié)中藥材和杜仲顆粒水溶性成分的轉(zhuǎn)移情況。

1主要儀器與試藥

1.1儀器

Waters e2695色譜儀（美國(guó)Waters公司）;MilliQ超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）;TOLEDO XS105電子分析天平（瑞士Mettler公司）。

1.2試藥

松脂醇二葡萄糖苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)為111537200501）;綠原酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110753201415，含量以962%計(jì)）;杜仲顆粒，規(guī)格為每袋裝5 g;乙腈（色譜純，Merck KGaA公司提供）;其他試劑均為分析純;10批杜仲顆粒樣品由生產(chǎn)廠家提供。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Phenomenex（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B;采用梯度洗脫方式：0～5 min，5%A;5～30 min，5%→15%A;30～45 min，15%→20%A;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：227 nm。

2.2溶液制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液

取綠原酸對(duì)照品、松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含綠原酸150 μg、松脂醇二葡萄糖苷20 μg的混合溶液，即得。

2.2.2杜仲顆粒供試品溶液

取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）20 min。放冷，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3杜仲飲片、杜仲葉飲片與標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液

取杜仲飲片、杜仲葉飲片及處方藥味（杜仲對(duì)照藥材0.5 g、杜仲葉對(duì)照藥材2.5 g混勻），加水煎煮1 h，離心，取上清液加2.8倍乙醇使其沉淀。再次離心，將上清液調(diào)整至約30 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

3方法學(xué)考察

3.1杜仲顆粒特征圖譜的建立及分析

取10批杜仲顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，確定色譜圖中出峰時(shí)間基本一致、峰面積較大的5個(gè)峰為共有特征色譜峰。通過與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)2號(hào)峰為綠原酸，4號(hào)峰為松脂醇二葡萄糖苷。其中2號(hào)峰峰形較好，前后無雜質(zhì)峰干擾，分離完全，出峰時(shí)間居中，選其作為參考峰，見圖1。

此外，通過比較杜仲顆粒與原藥材HPLCDAD的色譜圖，明確了1號(hào)—3號(hào)共有峰來源于杜仲與杜仲葉，4號(hào)共有峰來源于杜仲，5號(hào)共有峰來源于杜仲葉。將杜仲飲片、杜仲葉飲片、標(biāo)準(zhǔn)煎液、杜仲顆粒圖譜進(jìn)行比較可知，與杜仲、杜仲葉藥材指標(biāo)成分相關(guān)的主要色譜峰在標(biāo)準(zhǔn)煎液及杜仲顆粒色譜圖中均能得到體現(xiàn);同時(shí)，杜仲顆粒中主要色譜峰也能在藥材提取物圖譜中得到追溯。10批杜仲顆粒HPLC特征色譜，以及杜仲飲片、杜仲葉飲片及標(biāo)準(zhǔn)煎液的HPLC色譜圖見圖2—圖3。

3.2重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，研細(xì)，各取1，2，3 g共3份，按“2.2.2”項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，本方法保留時(shí)間的重復(fù)性良好，結(jié)果見表1和表2。

3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)制備的供試品溶液，分別放置0，8，16，24 h后，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，以綠原酸為參照峰，計(jì)算特征圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間小于05%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4討論

4.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

杜仲顆粒成分復(fù)雜，主要有效成分紫外吸收差異較大。為保證各共有峰具有適宜的靈敏度和精密度，采用二極管陳列PDA檢測(cè)器在200～400 nm下進(jìn)行各波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明，在227 nm處基線穩(wěn)定，各共有峰在同一波長(zhǎng)下均有較好的吸收，干擾較小，且低含量組分松脂醇二葡萄糖苷的檢測(cè)靈敏度好，峰型好。

4.2提取方法的選擇

通過實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、70%甲醇、水、乙醇4種提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，采用甲醇作為提取溶劑時(shí)所得色譜峰的分離效果較好，響應(yīng)值較高。以甲醇作為提取溶劑，對(duì)回流和超聲提取方式進(jìn)行考察的結(jié)果表明，兩者的提取效果并無明顯差異。此外，通過實(shí)驗(yàn)比較了提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。綜合考慮，確定采用操作簡(jiǎn)單的超聲提取方法，以甲醇作為提取溶劑，超聲時(shí)間為20 min。

4.3流動(dòng)相選擇

實(shí)驗(yàn)中比較了甲醇水、乙腈磷酸水等多個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果顯示，采用乙腈0.1%磷酸溶液時(shí)峰型對(duì)稱，可獲得較高的理論塔板數(shù)，分離度也都達(dá)到要求。因此，選擇乙腈0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相。

5結(jié)語

1）杜仲、杜仲葉提取物、杜仲顆粒的主要化學(xué)成分組成基本一致＼[1819＼]，說明藥材經(jīng)過現(xiàn)代化工藝提取、濃縮等工藝制成顆粒后的主成分與藥材提取物高度相關(guān)，提示杜仲顆粒保留了原料藥中的主要特征成分，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與藥材保持一致。

2）采用標(biāo)準(zhǔn)煎液來標(biāo)準(zhǔn)化杜仲顆粒的質(zhì)量，有助于實(shí)現(xiàn)臨床用藥的一致性和安全性。

3）本研究探索杜仲顆粒與其組方藥味杜仲、杜仲葉的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)關(guān)系，體現(xiàn)了中藥多成分作用整體性的質(zhì)量控制方法。特征圖譜專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可有效鑒別和評(píng)價(jià)杜仲顆粒的質(zhì)量，全面體現(xiàn)杜仲顆粒的組成成分，共有峰歸屬的初步確立也為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，可為建立杜仲顆粒的綜合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考。

4）后期研究將進(jìn)一步指認(rèn)及明確杜仲顆粒中多種成分的含量及其藥理作用。

參考文獻(xiàn)/References：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：165166.

[2]孫佳，陸苑，向文英，等.UPLC同時(shí)測(cè)定杜仲中6種有效成分的含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（6）：874879.

SUN Jia，LU Yuan，XIANG Wenying，et al.Simultaneous determination of six components in Eucommia ulmoides by UPLC[J]. Natural Product Research and Development，2016，28（6）：874879.

[3]劉榮華，唐芳瑞，陳蘭英，等.不同產(chǎn)地杜仲葉中5種主要有效成分的含量比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（18）：3134.

LIU Ronghua，TANG Fangrui，CHEN Lanying，et al.Comparison of contents of five effective components in Eucommiae folium from different areas[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2015，21（18）：3134.

[4]狄留慶，劉圣金，趙曉莉，等.杜仲藥材HPLC指紋圖譜及其共有模式的建立[J].中草藥，2007，38（4）：596599.

DI Liuqing，LIU Shengjin，ZHAO Xiaoli，et al.Establishment of fingerprint of Cortex Eucommiae and its mutual mode by HPLC[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2007，38（4）：596599.

[5]鐘世紅，古銳，李羿，等.杜仲葉HPLC指紋圖譜及成分積累規(guī)律的研究[J].華西藥學(xué)雜志，2010，25（4）：464466.

ZHONG Shihong，GU Rui，LI Yi，et al.HPLC fingerprint and accumulation rule of principal component in folium Eucommiae[J].Weast China Journal of Pharmaceutical Sciences，2010，25（4）：464466.

[6]劉可鑫，周翎，劉攀峰，等.鹽制對(duì)杜仲化學(xué)成分含量變化的影響[J].中成藥，2011，33（2）：280284.

LIU Kexin，ZHOU Ling，LIU Panfeng，et al.Effect of processing with saltwater on the chemical constituents of Eucommiae Cortex[J].Chinese Traditional Patent Medicine，2011，33（2）：280284.

[7]張穎，張起輝，王光函，等.棗仁安神顆粒指紋圖譜的相關(guān)性研究[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27（10）：825828.

ZHANG Ying，ZHANG Qihui，WANG Guanghan，et al.Correlativity between fingerprint peaks of Zaorenanshen granules and its relevant herbs[J].Journal of Shenyang Pharmaceutical University，2010，27（10）：825828.

[8]李麗麗，田海偉，李晉，等.HPLCELSD測(cè)定安神寶顆粒中3種成分[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，39（1）：4955.

LI Lili，TIAN Haiwei，LI Jin，et al.Determination of 3 ingredients in Anshenbao granules by HPLCELSD[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2018，39（1）：4955.

[9]孫志，周霖，李卓倫，等.基于超高效液相色譜四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)的腦心通膠囊化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2018，53（19）：16871695.

SUN Zhi，ZHOU Lin，LI Zhuolun，et al.The chemical constituents study of Naoxintong capsules based on UHPLCQOrbitrap HRMS[J].Chinese Pharmaceutical Journal，2018，53（19）：16871695.

[10]何晨婕，彭豐，劉彤，等.基于UPLCLTQ Orbitrap HRMS分析天芪降糖膠囊的化學(xué)成分[J].中草藥，2018，49（9）：20192025.

HE Chenjie，PENG Feng，LIU Tong，et al.Identifications of components of Tianqi Jiaonang capsules by UPLCLTQ Orbitrap HRMS[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2018，49（9）：20192025.

[11]林向前.杜仲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2018，27（4）：2023.

LIN Xiangqian.Study on quality standard of Duzhong tablets[J].China Pharmaceuticals，2018，27（4）：2023.

[12]周霖，周珮珮，王肖輝，等.UPLCQOrbitrap HRMS結(jié)合主成分分析的丹燈通腦軟膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].中草藥，2018，49（18）：43114318.

ZHOU Lin，ZHOU Peipei，WANG Xiaohui，et al.Quality assessment of dandeng tongnao soft capsule based on UPLCQOrbitrap HRMS combined with principal component analysis[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2018，49（18）：43114318.

[13]方雯雯，成守玲，陳培勝，等.白芷藥材飲片提取物及配方顆粒的HPLC特征圖譜相關(guān)性研究[J].中草藥，2016，47（18）：32113214.

FANG Wenwen，CHENG Shouling，CHEN Peisheng，et al.Correlation study on HPLC characteristic spectrum of raw herbdecoction piecesextractdispensing granules of Angelicae Dahuricae Radix[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2016，47（18）：32113214.

[14]申衛(wèi)紅，張子龍，葉家宏，等.側(cè)柏葉及其水煎液HPLC特征圖譜的相關(guān)性研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2013，24（5）：487490.

SHEN Weihong，ZHANG Zilong，YE Jiahong，et al.Analysis of HPLC characteristic spectrum for Cacumen Platycladi and itsdecoction[J].Traditional Chinese Drug Reserach and Clinical Pharmacology，2013，24（5）：487490.

[15]伍小燕，楊梅，梁冰麗，等.基于相關(guān)性的廣金錢草配方顆粒特征圖譜研究[J].藥物分析雜志，2014，34（6）：10571061.

WU Xiaoyan，YANG Mei，LIANG Bingli，et al.Correlationbased study on the development of characteristic pattern of Herba Desmodii Styracifolii granules[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2014，34（6）：10571061.

[16]周楚娟，任晉，張俊儀，等.美花石斛HPLC特征圖譜研究及其水煎液相關(guān)性分析[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28（5）：671675.

ZHOU Chujuan，REN Jin，ZHANG Junyi，et al.Analysis of HPLC characteristic spectrum of Dendrobium Loddigesii and the correlation between and the correlation between samples prepared from decoction pieces and decoction[J].Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology，2017，28（5）：671675.

[17]魏梅，杜蘭哲，李慧，等.醋延胡索飲片、水煎液、配方顆粒高效液相色譜特征圖譜相關(guān)性研究[J].中藥材，2015，38（5）：10661069.

WEI Mei，DU Lanzhe，LI Hui，et al.Correlation of HPLC characteristic spectra of vinegar corydalis rhizoma decoction pieces，water decoction and formula granules[J].Journal of Chinese Medical Materials，2015，38（5）：10661069.

[18]嚴(yán)穎，趙慧，鄒立思，等.杜仲化學(xué)成分的LCTriple TOF MS/MS分析[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2017，38（1）：146156.

YAN Ying，ZHAO Hui，ZOU Lisi，et al.Chemical constituents of Eucommiae Cortex by LCTriple TOF MS/MS[J].Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2017，38（1）：146156.

[19]劉慧，張盛，劉仲華.HPLC法同時(shí)測(cè)定杜仲皮中京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷[J].中草藥，2012，43（8）：15471549.? LIU Hui，ZHANG Sheng，LIU Zhonghua.Simultaneous determination of geniposidic acid，chlorogenic acid，geniposide，and pinoresinol diglucoside in Eucommia ulmoides by HPLC[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2012，43（8）：15471549.

收稿日期：2019521;修回日期：20191021;責(zé)任編輯：張士瑩

基金項(xiàng)目：河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（16272511）

第一作者簡(jiǎn)介：馬永青（1978—），女，河北石家莊人，副主任藥師，博士，主要從事藥物分析及質(zhì)量控制方面的研究。

通訊作者：劉永利主任藥師。Email：liuyongli2008@126.com

馬永青，王璐，劉穎，等.基于全程質(zhì)量控制理念的杜仲顆粒特征圖譜研究[J].河北工業(yè)科技，2020，37（1）：5458.

MA Yongqing， WANG Lu， LIU Ying， et al.Characteristic chromatogram of Duzhong granules on whole process quality control concept[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2020，37（1）：5458.