響應面法優(yōu)化遼東楤木總皂苷提取工藝及其抗氧化作用

徐士釗 齊菲 席雅琳

摘要：考察乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間等單因素對遼東楤木總皂苷提取量的影響，采用響應面Box-Behnken Design優(yōu)化遼東楤木總皂苷的提取工藝，并對遼東楤木總皂苷進行提取量測定及抗氧化作用的研究。響應面法最終優(yōu)化結(jié)果表明，乙醇體積分數(shù)為85%，液料比為20 mL ∶ 1 g，超聲時間為60 min，在此條件下測得遼東楤木中總皂苷類提取量為94.93 mg/g，與預測值良好吻合。抗氧化活性結(jié)果表明，遼東楤木總皂苷類對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH）自由基和2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），簡稱ABTS]自由基均有較好的清除能力，當總皂苷的質(zhì)量濃度為 57.83 mg/mL 時，對DPPH自由基的清除率最大，為92.17%;而對ABTS自由基的清除能力在總皂苷質(zhì)量濃度為19.28～96.39 mg/mL 范圍內(nèi)逐漸增強，當其質(zhì)量濃度為96.39 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率為100%。

關(guān)鍵詞：遼東楤木;響應面法;總皂苷;提取工藝;DPPH自由基;ABTS自由基;清除率;抗氧化作用

中圖分類號： R284.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0204-05

遼東楤木[Aralia elata（Miq.）Seem.]別稱龍牙楤木、刺龍牙、刺嫩芽、刺老鴉、東北野香椿等，是一種食藥兼用型的五加科（Araliaceae）楤木屬（Aralia）植物，為多年生落葉灌木或小喬木[1]。在亞洲地區(qū)分布廣泛，我國主要分布在遼寧、吉林、黑龍江等地的山區(qū)，尤其在長白山地區(qū)以及小興安嶺一帶分布最為廣泛;在日本、朝鮮和俄羅斯的西伯利亞地區(qū)分布也相對較多[1-2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥記載其主要藥用部位為樹皮和根皮，具有補氣安神、強精滋腎、祛風活血、除濕止痛的功效，可用于風濕性關(guān)節(jié)炎、腎氣不足等癥的輔助治療[3-4]?，F(xiàn)代研究表明，遼東楤木中主要含有皂苷類、氨基酸類、油脂類、黃酮類以及一些微量元素等化學成分，其中現(xiàn)代文獻對總皂苷類成分的研究最為廣泛，目前已經(jīng)分離出了皂苷的多種苷元[5-8]。此外，對于遼東楤木藥理作用的研究也較豐富，遼東楤木可以刺激腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)而具有一定的抗炎作用，尤其對緩激肽介質(zhì)的合成與釋放有明顯的抑制作用，臨床上還用于治療腎虛陽痿、氣虛無力等癥[4，9-10]。通過對遼東楤木總皂苷提取工藝的優(yōu)化以及抗氧化作用的研究，為遼東楤木保健產(chǎn)品的開發(fā)研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

遼東楤木嫩芽樣品采于遼寧省丹東市，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為五加科（Araliaceae）楤木屬（Aralia Linn.）遼東楤木[Aralia elata （Miq.） Seem]的芽，低溫烘干，粉碎并過60目篩備用。

主要儀器有UV-1500型紫外-可見分光光度計，購自翱藝儀器（上海）有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自常州賽普實驗儀器廠;AR2140電子分析天平，購自奧豪斯儀器（上海）有限公司;KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，購自昆山超聲儀器有限公司;101型電熱鼓風干燥箱，購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;HP-01無油真空泵，購自邦西儀器科技（上海）有限公司。

主要試劑有齊敦果酸對照品（批號為110709-200304）、DPPH試劑（批號為6KCYN-LT）、ABTS試劑（批號為619H032）、L（+）-抗壞血酸，均購于中國藥品生物制品檢定所，對照品純度達到98%以上;高氯酸、香草醛、冰乙酸、二氯甲烷、乙醇均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精確稱取齊敦果酸對照品適量，加入甲醇制成含有1.002 mg/mL齊敦果酸對照品溶液[11]。

1.2.2 標準曲線的制備 精確吸取齊敦果酸對照品溶液40、60、80、100、120 μL，置于5 mL的容量瓶中，揮干溶劑，加入0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加熱20 min，放冷后用冰乙酸稀釋至刻度[12]。采用紫外分光光度法于548 nm下進行吸光度（y）測定，以測得的吸光度（y）為縱坐標、對照品的質(zhì)量（x）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為y=8.384 5x-0.010 22，r=0.999 9，線性范圍為0.04～0.12 mg。測定結(jié)果見表1。

1.2.3 單因素對總皂苷提取量的影響試驗 通過單一變量分別考察乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間等因素對遼東楤木總皂苷提取量的影響，以獲得單因素影響提取工藝的最佳范圍[13]。

1.2.3.1 乙醇體積分數(shù)對總皂苷提取量的影響 稱取遼東楤木粉末5份，每份1.0 g，精確稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精確加入70%、75%、80%、85%、90%乙醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率 100 W）60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用相應體積分數(shù)的乙醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過，分別取續(xù)濾液20 μL，置于5 mL量瓶中，揮干溶劑，加入5 mL 0.4%香草 醛- 冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于 60 ℃ 水浴中加熱20 min，放冷后用冰乙酸稀釋至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下進行吸光度測定，并測定不同乙醇濃度下的總皂苷提取量。

1.2.3.2 超聲提取時間對總皂苷含量的影響 稱取遼東楤木粉末5份，每份1.0 g，精確稱定，分別置具塞錐形瓶中，精確加入85%的乙醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，分別選取35、50、65、80、95 min等5個時間點進行超聲處理（功率100 W），放冷，再稱定質(zhì)量，用85%乙醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過，分別取續(xù)濾液20 μL，置于5 mL量瓶中，揮干溶劑，加入 0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加熱20 min，放冷后用冰乙酸稀釋至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下進行吸光值測定，并測定不同超聲時間的總皂苷提取量。

1.2.3.3 液料比對總皂苷提取量的影響 稱取遼東楤木粉末5份，每份1.0 g，精確稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精確加入85%乙醇各15、20、25、30、35 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率100 W）60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用85%乙醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過，分別取續(xù)濾液20 μL，置于5 mL量瓶中，揮干溶劑，加入0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加熱20 min，放冷后用冰乙酸稀釋至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下進行吸光度測定，并測定不同液料比的總皂苷提取量。

1.2.4 響應面法優(yōu)化提取總皂苷類工藝的試驗設計 根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，選取超聲時間、液料比、乙醇體積分數(shù)等3個因素為影響總皂苷提取量的主要因素，進行3因素3水平的響應面設計，設計的因素及水平見表2。

1.2.5 遼東楤木總皂苷的抗氧化試驗

1.2.5.1 遼東楤木總皂苷對1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH自由基）清除能力的測定

1.2.5.1.1 DPPH工作液的制備 精確稱取DPPH固體適量，置于250 mL量瓶中，用無水乙醇進行定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的DPPH工作液。

1.2.5.1.2 遼東楤木總皂苷清除DPPH自由基的測定方法 分別精確吸取DPPH工作液4 mL和不同質(zhì)量濃度的總皂苷溶液2 mL置于試管中，混合均勻后在室溫下避光處理60 min，然后在波長為 517 nm 的條件下進行吸光度D1的測定;再分別精確吸取 4 mL 無水乙醇和不同質(zhì)量濃度的2 mL總皂苷溶液，按照上述方法同等處理后進行吸光度D2的測定;分別精確吸取4 mL DPPH工作液和2 mL無水乙醇作為空白對照，按照上述方法同等處理后進行吸光度D0的測定，以L（+）-抗壞血酸作為陽性對照。DPPH自由基清除率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%[14-16]。

1.2.5.2 遼東楤木總皂苷對ABTS自由基清除能力的測定

1.2.5.2.1 ABTS工作液的制備 稱量386 mg的ABTS用蒸餾水溶解后，定容至100 mL;再稱取 376.8 mg 的過硫酸鉀用蒸餾水溶解后，定容至 25 mL;取100 mL ABTS溶液和4.6 mL過硫酸鉀溶液混合，使ABTS溶液的濃度為7 mmol/L，過硫酸鉀溶液的濃度為2.45 mmol/L，以上2種溶液混合后于室溫下避光處理16 h，使用前用無水乙醇進行進行稀釋，使其在波長為734 nm處的吸光度值在0.7左右[17]。若在ABTS工作液中加入遼東楤木的總皂苷溶液后，吸光度下降，說明該溶液對ABTS自由基存在清除作用，否則反之。

1.2.5.2.2 遼東楤木醇提物清除ABTS自由基的測定方法 精確吸取4 mL ABTS工作液和0.6 mL不同質(zhì)量濃度的總皂苷溶液，并將其置于試管中混合均勻，在室溫下避光處理60 min，然后在波長為 734 nm 的條件下進行吸光度D1的測定;分別精確吸取4 mL無水乙醇和0.6 mL不同質(zhì)量濃度的總皂苷溶液，按照上述方法同等處理后進行吸光度D2的測定;分別精確吸取4 mL ABTS工作液和0.6 mL無水乙醇作為空白對照，按照上述方法同等處理后進行吸光度D0的測定，以L（+）-抗壞血酸作為陽性對照。ABTS自由基清除率=[D0（D1-D2）]/D0×100%[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 不同體積分數(shù)乙醇對總皂苷提取量的影響 在超聲提取時間為60 min、液料比為30 mL ∶ 1 g的條件下，不同乙醇濃度對遼東楤木總皂苷提取量的影響見圖1。遼東楤木總皂苷提取量隨著乙醇體積分數(shù)的增加先升高再降低，當乙醇體積分數(shù)升至85%時，遼東楤木總皂苷提取量達到最大;當乙醇體積分數(shù)大于85%時，總皂苷提取量急劇降低。根據(jù)提取化學成分相似相容的原理，結(jié)合遼東楤木總皂苷含有的化學成分類型，將乙醇體積分數(shù)控制在75%～85%。

2.1.2 超聲提取時間對總皂苷提取量的影響 在乙醇體積分數(shù)為85%、液料比為30 mL ∶ 1 g的條件下，不同超聲提取對遼東楤木總皂苷提取的影響見圖2。超聲提取時間在35～65 min范圍內(nèi)，遼東楤木總皂苷提取量呈升高趨勢，在65 min時達到最大值，再增加提取時間，總皂苷提取量降低。隨著提取時間的延長，總皂苷不斷被提取出來，65 min后總皂苷提取量降低，一方面可能是總皂苷發(fā)生水解、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，另一方面提取出來的其他成分影響總皂苷的提取量，因此提取時間應控制在50～80 min。

2.1.3 液料比對遼東楤木總皂苷提取量的影響 在乙醇體積分數(shù)為85%、超聲提取時間為65 min的條件下，不同液料比對遼東楤木總皂苷提取量的影響見圖3。液料比從15 mL ∶ 1 g增大到20 mL ∶ 1 g時，由于濃度差異擴大導致遼東楤木總皂苷向溶液迅速滲透，使其提取量顯著增加;在（25～35） mL ∶ 1 g液料比的范圍內(nèi)，對遼東楤木總皂苷的提取量影響不大，液料比應控制在（15～25） mL ∶ 1 g。

2.2 響應面法優(yōu)化遼東楤木總皂苷提取工藝試驗結(jié)果

2.2.1 響應面設計方案與結(jié)果 在單因素試驗考

察的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心設計原理，確定響應面分析的因素和水平，選擇超聲時間（x1）、液料比（x2）、乙醇體積分數(shù)（x3）等3個因素為影響總皂苷提取量的主要因素，遼東楤木總皂苷提取量為響應值進行考察。運用Design-Expert 8.0.5軟件進行響應面設計和分析，對遼東楤木總皂苷提取工藝進行優(yōu)化，試驗結(jié)果見表3。

運用Design-Expert 8.0.5軟件，得出遼東楤木總皂苷提取量與超聲時間（x1）、液料比（x2）、乙醇體積分數(shù)（x3）之間的回歸方程：y=5 662.82+15.49x1-14.79x2-148.44x3-0.099x1x2+0.027x1x3-0.23x2x3-0.12x21+0.80x22+0.95x23（r2=0.997 9，r2a=0.995 2）?；貧w分析及方差分析結(jié)果見表4。

回歸方程的P<0.01，說明本試驗采用的回歸模型具有統(tǒng)計學意義;失擬項的P值為0.974 8>0.05，說明回歸模型無失擬因素的存在，擬合程度相對較好，可反映出總皂苷的提取量與液料比、超聲時間、乙醇濃度之間的關(guān)系，說明響應面法優(yōu)化遼東楤木總皂苷提取工藝的可行性。通過對試驗結(jié)果的擬合分析，得出最佳的提取工藝：液料比為 20 mL ∶ 1 g，超聲時間為58.97 min，乙醇體積分數(shù)為84.95%，總皂苷提取量的預測值為 95.34 mg/g。根據(jù)影響因素的實際情況，可將提取工藝調(diào)整為液料比20 mL ∶ 1 g，超聲時間60 min，乙醇體積分數(shù)85%。在此條件下對遼東楤木藥材進行提取工藝的驗證，測得平均總皂苷提取量為 94.93 mg/g，實測值與預測值的偏差為0.43%，體現(xiàn)回歸方程具有較好的可行性。

2.2.2 遼東楤木總皂苷提取工藝的驗證 稱取 1.0 g 遼東楤木粉末，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，精確加入20 mL 85%乙醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率100 W）60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用85%乙醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液20 μL，按照標準曲線的制備方法進行測定。根據(jù)上述方法測得遼東楤木總皂苷的提取量為94.93 mg/g，且方法學考察的各項指標均符合要求，測定結(jié)果見表5。

2.3 遼東楤木總皂苷的抗氧化活性

2.3.1 遼東楤木總皂苷對DPPH自由基的清除能力 遼東楤木總皂苷對DPPH自由基有一定的清除作用，表現(xiàn)出較強的抗氧化能力，但與對照藥物抗壞血酸相比，遼東楤木總皂苷的抗氧化能力要弱于抗壞血酸?？傇碥杖芤旱馁|(zhì)量濃度在0.1～0.4 mg/mL范圍內(nèi)時，總皂苷質(zhì)量濃度的變化對DPPH自由基清除率的影響較大，當總皂苷質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為 87.30%;而總皂苷質(zhì)量濃度在大于0.4 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率變化平緩，清除能力達到最高極限，測定結(jié)果見圖4。

2.3.2 遼東楤木總皂苷對ABTS自由基的清除能力 遼東楤木總皂苷清除ABTS自由基的能力隨總皂苷溶液質(zhì)量濃度的增加而增強;不同質(zhì)量濃度抗壞血酸清除ABTS自由基的能力恒定，但遼東楤木總皂苷溶液清除ABTS自由基的能力弱于抗壞血酸。總皂苷溶液的質(zhì)量濃度在0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，對ABTS自由基的清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān);當質(zhì)量濃度大于 0.6 mg/g 時，對ABTS自由基的清除率升高趨勢變緩;總皂苷質(zhì)量濃度為1.0 mg/g時，清除率達到最大值，為96.07%（圖5）。

3 結(jié)論

通過響應面法優(yōu)化遼東楤木總皂苷提取工藝的最終工藝為液料比20 mL ∶ 1 g，超聲時間 60 min，乙醇體積分數(shù)85%。在此條件下， 測得遼東楤木總皂苷提取量為94.93 mg/g，實測值與模型預測值無顯著差異，說明該方法穩(wěn)定可靠，為準確測定遼東楤木中總皂苷提取量奠定了基礎(chǔ)。遼東楤木中總皂苷抗氧化作用的研究表明，總皂苷具有較強的抗氧化能力，綜合比較遼東楤木總皂苷與抗壞血酸分別清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力，總皂苷與抗壞血酸的抗氧化作用有一定的差異，但作為一種天然來源的抗氧化劑，總皂苷具有較好的抗氧化活性。該研究可為遼東楤木保健產(chǎn)品的進一步開發(fā)研究提供科學依據(jù)[19]。

參考文獻：

[1]中國植物志編委會. 中國植物志[M]. 北京：科學出版社，1978：160-167.

[2]李書心. 遼寧植物志[M]. 沈陽：遼寧科學技術(shù)出版社，1988：1268.

[3]宋少江，徐綏緒，曹穎林. 遼東楤木總皂苷降血糖作用研究[J]. 中藥研究與信息，2005，7（5）：7-9.

[4]李 明，魯衛(wèi)星. 龍牙楤木藥理研究進展[J]. 醫(yī)學綜述，2009，15（20）：3157-3160.

[5]張桂娟. 遼東木化學成分及其生物活性研究進展[J]. 黑龍江醫(yī)藥，2014，27（4）：798-801.

[6]齊明明. 食用龍牙楤木化學成分分析與品質(zhì)評價[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學，2017.

[7]張家鑫，田 瑜，鐘曉明，等. 遼東楤木三萜皂苷類化學成分的研究[J]. 中國藥房，2013，24（15）：1380-1382.

[8]張家鑫，田 瑜，孫桂波，等. 龍牙楤木皂苷類成分及藥理活性研究進展[J]. 中草藥，2013，44（6）：770-779.

[9]趙俊男，譚玉婷，姜天童，等. 龍牙楤木藥理作用研究進展[J]. 吉林中醫(yī)藥，2016，36（2）：207-210.

[10]溫富春，徐惠波，丁 濤，等. 龍牙楤木總皂苷抗心肌缺血作用研究[J]. 世界科學技術(shù)，2005（增刊1）：5-8.

[11]李百美，孫宜春，王秋紅，等. 不同產(chǎn)地和不同采收期遼東楤木葉中兩種皂苷的含量測定[J]. 中國實驗方劑學雜志，2017，23（11）：59-62.

[12]黃福山. 遼東楤木愈傷組織及植株皂苷含量的研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2012.

[13]姚麗琴，田 明. 從龍牙楤木藥材乙醇提取物中水解楤木皂苷工藝優(yōu)選[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志，2018，25（1）：59-63.

[14]管福琴，劉 敏，單 宇，等. 灰氈毛忍冬中五環(huán)三萜類化合物的抗氧化活性研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2013，24（6）：1315-1317.

[15]崔月花，章克昌. 靈芝三萜皂苷（GCTL1）的體外抗氧化作用[J]. 食品科學，2010，31（19）：49-53.

[16]孫延芳，梁宗鎖，劉 政，等. 酸棗果三萜皂苷抑菌和抗氧化活性的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（6）：139-142.

[17]楊 潔，高鳳祥，楊 敏，等. 藜麥皮總皂苷微波輔助提取工藝及其抗氧化活性研究[J]. 食品與機械，2017，33（12）：148-153.

[18]劉金璐，雷永平，王曉林，等. 刺玫果總皂苷的純化工藝及體外活性研究[J]. 吉林化工學院學報，2018，35（09）：16-23.

[19]姜 鸑，姜 新. 楤木屬植物研究現(xiàn)狀與展望[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學，2008，12（5）：87-90.