一種絹紡原料除油微生物菌株的獲得及除油性能研究

陳祥平 程明丹 方佳 李喬蘭 肖露

摘要： 從繭絲腐化液中篩選獲得了一株脫油效率較高的菌株，經(jīng)16S rDNA分子鑒定，命名為Enterobacter sp. TY4。對(duì)脫油菌株脫油條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最適碳源為蔗糖、最適氮源為蛋白胨，最適C/N為0.25︰1，培養(yǎng)基最適pH 7.0，最適浴比和接種量分別為2︰125和1%。將脫油菌株TY4與一株脫膠菌株Aeromonas sp. TJ5進(jìn)行共培養(yǎng)，對(duì)比了脫膠菌和除油菌同時(shí)接種與次序接種對(duì)重油繭絲脫膠除油效率的影響。結(jié)果表明，采用共培養(yǎng)方式和次序接種明顯提高了脫膠脫油效率，殘油率和脫膠率分別達(dá)0.48%和24.1%。

關(guān)鍵詞： 重油繭絲;脫油;微生物群落;產(chǎn)氣腸桿菌;脫膠脫油菌共培

中圖分類號(hào)： TS195.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)： 10017003（2020）01001406

引用頁(yè)碼： 011103DOI： 10.3969/j.issn.10017003.2020.01.003

Study on the acquisition and deoiling performance of an oilremoving microbial

strain for raw materials of silk spinning

CHEN Xiangping1， CHENG Ming1， ZHENG Dan1， FANG Jia2， LI Qiaolan2， XIAO Lu2

Abstract： A bacterial strain with high deoiling efficiency was obtained from bave corrosive liquid， and was named Enterobacter sp. TY4 based on 16S rDNA molecular identification. The oilremoving conditions of TY4 were optimized， and the optimal carbon source， nitrogen source， C/N， pH， liquor ratio and inoculum size were sucrose， peptone， 0.25︰1， 7.0， 2︰125， and 1%， respectively. The oilremoving Enterobacter sp. TY4 and degumming Aeromonas sp. TJ5 were cocultured， and the effect of coinoculation and sequential inoculation of TY4 and TJ5 on oilremoving and degumming efficiencies was investigated. The results show that coculture and sequential inoculation greatly enhance the oilremoving and degumming efficiencies， with the rates of 0.48% and 24.1%， respectively.

Key words： heavy oil bave; deoiling; microbial community; enterobacter aerogenes; coculture of oilremoving and degumming bacteria

絹紡原料來(lái)自于絲綢工程剔除或產(chǎn)生的各類下繭、滯頭、廢絲、繅絲腳渣等。這些下腳原料含有程度不同且差異較大的絲膠、油脂、污染物和雜質(zhì)，必須通過(guò)精煉整理去除油脂、大部分絲膠、蠟質(zhì)等。除油問(wèn)題（尤其是重油繭絲）一直都是絹綿制備的主要難題之一，目前常用的除油方法主要是化學(xué)法和生物法兩種[13]。化學(xué)法主要包括利用有機(jī)溶劑除油、酸法除油及皂堿法除油等，但除油效果不理想，且污染環(huán)境。生物法（主要指腐化法）是一種傳統(tǒng)的絹紡原料除油方法，屬自然發(fā)酵法。它利用腐化液中多種微生物并存的混菌發(fā)酵體系，依靠微生物代謝分泌的酶達(dá)到除油的目的。該方法除油效果顯著，但由于是混菌發(fā)酵，微生物培育條件及脫油過(guò)程控制困難，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，而且生產(chǎn)周期長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)環(huán)境氣味惡劣[47]。因此，篩選具有高效除油功能的微生物，將其應(yīng)用于絹紡原料脫油處理，對(duì)于進(jìn)一步改善精煉工藝、提高脫油效率、穩(wěn)定產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。近年來(lái)，已有研究者分離篩選到高效脫油菌株，并利用脫油菌株或者產(chǎn)生的酶進(jìn)行脫油，取得了良好的效果[89]。本文從繭絲腐化液中篩選獲得了一株具有較高脫油效率的菌株，對(duì)其脫油條件進(jìn)行了優(yōu)化，并將其與脫膠菌株Aeromonas sp. TJ5共培養(yǎng)[10]，探討其脫膠除油效果。

1材料與方法

1.1材料

重油繭絲及腐化液（四川省南充銀海絲綢有限公司）。

1.2試劑和儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司），2×PCR Master Mix、瓊脂糖（北京天根生化科技有限公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BioRad S1000 PCR儀、GEL Doc+凝膠成像儀、OLYMPUS BH2光學(xué)顯微鏡（美國(guó)BioRad公司），NU6382E超低溫冰箱（美國(guó)天美公司），DHP9082電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），CS501恒溫培養(yǎng)搖床（上海富瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3微生物及培養(yǎng)基

1）脫膠菌Aeromonas sp. TJ-5：從繭絲腐化液中篩選獲得，經(jīng)16S rDNA鑒定，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心[10]。

2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L;蛋白胨10g/L;NaCl 5g/L;pH 7.0;121℃滅菌20min。

3）選擇培養(yǎng)基：硝酸銨1g/L;磷酸二氫鉀0.5g/L;磷酸氫二鈉1.5g/L;氯化鈉1g/L;七水硫酸鎂02g/L;三丁酸甘油酯5mL;121℃滅菌20min。

4）種子培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

5）脫油基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

6）脫油脫膠共同培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L;蔗糖25g/L;NaCl 5g/L;SDS 0.5g/L;pH 7.0;蔗糖于112℃滅菌15min;其余121℃滅菌20min，然后無(wú)菌操作下混合。

Study on the acquisition and deoiling performance of an oilremoving microbial strain for raw materials of silk spinning一種絹紡原料除油微生物菌株的獲得及除油性能研究1.4方法

1.4.1脫油微生物的篩選

取100mL繭絲腐化液，離心（1000r/min，4℃）10min，收集上清液。上清液離心（10000r/min，4℃）10min后收集沉淀，沉淀用磷酸緩沖液（PBS，pH 8.0）離心（10000r/min，4℃）洗滌沉淀3次，將沉淀重懸于相同的PBS緩沖液中。取重懸液10mL加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)12h。

初篩：取1mL富集培養(yǎng)液，經(jīng)梯度稀釋，均勻涂布于以三丁酸甘油酯為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基固體平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。根據(jù)菌落周圍的透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比（D/d），挑選比值較大的菌株進(jìn)行下一步篩選[10]。

復(fù)篩：挑取初篩獲得的菌株，接種至種子培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，作為活化的種子培養(yǎng)液。以1%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接種至脫油基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入2g未脫油繭絲樣品，置于30℃搖床中培養(yǎng)48h。脫油完成后，測(cè)定殘油率。

1.4.2菌株16S-rDNA鑒定

離心收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌體，采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取菌株總DNA。采用細(xì)菌通用引物27f（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3）和1492r（5TACGGCTAC CTTGTTACGACTT3）對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件如下：變性94℃，1min，退火52℃，1min，延伸72℃，2min，循環(huán)30次[11]。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序得到的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)做相似性分析。

1.4.3菌株脫油條件的優(yōu)化

分別考察了培養(yǎng)基碳源、氮源、C/N比、培養(yǎng)基pH值、接種量及裝液量對(duì)脫油效果的影響。以1%的接種量接種菌株TY10至脫油基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并加入2g繭絲樣品，置于30℃搖床150r/min培養(yǎng)48h，測(cè)定繭絲殘油率，分別考察不同的培養(yǎng)基及脫油條件對(duì)菌株脫油效果的影響。

1.4.4脫油菌與脫膠菌共培養(yǎng)對(duì)繭絲脫膠除油效果的影響

分別取在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h的脫膠菌TJ-5和脫油菌TY-4種子液，以1%的接種量接種至優(yōu)化后的脫油培養(yǎng)基中，加入2g含油率為14%的重油繭絲樣品中，并置于30℃搖床內(nèi)培養(yǎng)48h。分別測(cè)定繭絲處理后的殘油率及脫膠率。

1.4.5殘油率的測(cè)定

將脫膠脫油處理后的繭絲取出，用水洗凈，晾干后用濾紙包裹，放在索式抽提器中。加入75～100mL乙醚到150mL圓底燒瓶中，在恒溫水浴中保持圓底燒瓶43℃溫度，將冷凝管從索式抽提器的上端插入，通入冷凝水?；亓骱螅〕鰳悠?，等待乙醚完全揮發(fā)，放入烘箱，在105℃烘3h，取出放入干燥器中，冷卻至室溫稱重，即得脫油后樣品的干重。提取的油和圓底燒瓶放入烘箱中3h后取出。在干燥器內(nèi)冷卻至室溫后稱重，減去球形瓶重即為油脂的質(zhì)量[12]。

殘油率的計(jì)算公式：殘油率/%=燒瓶變化質(zhì)量/（燒瓶變化質(zhì)量+繭絲脫油后干重）×100。

1.4.6脫膠率的測(cè)定

取出脫膠脫油處理后的繭絲，沖洗、烘干;按照1.4.5的步驟將繭絲中剩余的油脂提取干凈，取出繭絲，烘干，恒重。在燒杯中加入6g/L的碳酸氫鈉溶液，同時(shí)加入恒重后的繭絲，在100℃條件下脫膠30min，期間不斷攪拌，反應(yīng)結(jié)束后取出，先用溫水，再用冷水沖洗繭絲。重復(fù)上述步驟一次，將繭絲烘干后恒重，計(jì)算殘膠率。根據(jù)脫膠處理前后損失的質(zhì)量計(jì)算脫膠效率[13]。

2結(jié)果與分析

2.1脫油功能菌的篩選鑒定

以繭絲腐化液為研究對(duì)象，利用三丁酸甘油酯為唯一碳源，篩選脫油功能微生物。通過(guò)測(cè)定透明圈大小，選取透明圈直徑與菌落直徑之比較大的菌株，共計(jì)200余株，從中篩選20株進(jìn)行進(jìn)一步脫油實(shí)驗(yàn)（表1），其中菌株TY-4脫油效果最好，繭絲殘油率達(dá)到0.71%，因此選擇TY4進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

菌株TY-4經(jīng)活化后，提取基因組DNA，擴(kuò)增獲得其16S-rDNA核酸序列，將該序列與NCBI中的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），菌株TY4與Enterobacter aerogenes EA1509E屬于同一分支，確定該菌株為產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter），命名為Enterobacter sp. TY-4。

2.2菌株TY-4脫油條件的優(yōu)化

2.2.1培養(yǎng)基對(duì)脫油效果的影響

實(shí)驗(yàn)考察了培養(yǎng)基碳源、氮源和C/N對(duì)脫油效果的影響，如圖2所示。圖2（a）共選擇了果糖、可溶性淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖5種碳源，TY4菌株對(duì)繭絲的脫油率與碳源的種類有很大關(guān)系。當(dāng)葡萄糖為碳源時(shí)，脫油效果最差，說(shuō)明速效碳源雖然比較容易利用，但是卻不利于油脂的脫除。蔗糖作為碳源時(shí)，其殘油率最低，為0.58%。同時(shí)，蔗糖價(jià)格便宜，來(lái)源廣泛。因此，選擇蔗糖作為碳源進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2（b）分別使用蛋白胨、酵母膏、氯化銨、硝酸鈉、尿素作為基本培養(yǎng)基的氮源，繭絲的殘油率有較大差異，硝酸鈉、氯化銨和尿素作為氮源時(shí)殘油率較高，而蛋白胨和酵母膏作為氮源時(shí)殘油率較低，說(shuō)明菌株利用有機(jī)氮源脫油效果較好，這與郭磊[9]的研究結(jié)果一致。因此，選擇蛋白胨作為氮源進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

從圖2（c）可以看出，繭絲的殘油率隨著碳氮比的增加先降低后增加，碳氮比在0.25︰1時(shí)殘油率最低（0.49%）。因此，選擇0.25︰1作為最適碳氮比。

2.2.2pH值對(duì)TY4脫油的影響

微生物的生長(zhǎng)繁殖需要在合適的pH值條件下進(jìn)行，本文考察了pH值對(duì)菌株脫油效率的影響，如圖3所示。從圖3（a）可以看出，隨著培養(yǎng)基pH值的增加，殘油率逐漸減小，在pH 9.0時(shí)殘油率最低，達(dá)到0.27%。從圖3（b）可以看出，在pH 7.0時(shí)菌體濃度最高，增加或者降低pH值細(xì)胞生物量顯著下降。因此，在堿性條件下，殘油率降低主要是由于繭絲里的蛹油會(huì)在堿性條件下發(fā)生水解，屬于化學(xué)除油過(guò)程。陳慧[14]研究了一株紅球菌屬細(xì)菌X8的脫油工藝，在pH7.0時(shí)除油效果最優(yōu)，殘油率達(dá)到了126%。綜合考慮，本文選擇pH7.0為最適pH值。

2.2.3浴比和接種量對(duì)脫油的影響

浴比和接種量對(duì)菌株脫油效率的影響如圖4所示。從圖4（a）可以看出，殘油率隨著浴比的增加逐漸降低，而浴比為2︰125以后，殘油率又有所增加。浴比對(duì)菌株脫油的影響可能與溶氧等有關(guān)，浴比過(guò)小，由于2g繭絲在搖瓶中所占空間較大，培養(yǎng)液可能不能沒過(guò)繭絲，因此殘油率會(huì)比較高。選擇2︰125作為最佳的浴比，此時(shí)的殘油率為0.44%。從圖4（b）可以看出，當(dāng)接種量為1%時(shí)，繭絲樣品的殘油率最小，為043%。因此，選擇最適接種量為1%。

綜上所述，通過(guò)對(duì)菌株TY4脫油條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了最適的脫油條件為：最適碳源為蔗糖、最適氮源為蛋白胨、最適C/N為0.25︰1，培養(yǎng)基最適pH 7.0，最適浴比和接種量分別為2︰125和1%。在最適培養(yǎng)條件下進(jìn)行脫油，重油繭絲殘油率最低可達(dá)0.33%。

2.3脫膠菌和脫油菌共培養(yǎng)對(duì)繭絲脫膠除油的影響

為了進(jìn)一步考察功能微生物在絹紡原料精煉工藝中的應(yīng)用，將篩選獲得的脫油菌TY4與脫膠菌TJ5進(jìn)行共培養(yǎng)，考察兩株菌共同作用對(duì)原料脫膠除油效率的影響。選用重油繭絲為研究對(duì)象，分別考察了菌株單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)對(duì)繭絲脫膠率和殘油率的影響，結(jié)果如圖5所示。未接種菌株，繭絲脫油脫膠效果很差;單獨(dú)接種菌株TY4或TJ5，繭絲或殘油率高，或脫膠率低，前者脫膠率為12.8%，后者殘油率為862%;共培養(yǎng)后，由于兩種菌株的共同作用脫膠率和殘油率都達(dá)較好水平，分別為22.53%和0.64%。因此，通過(guò)將脫油菌和脫膠菌共培養(yǎng)對(duì)含膠較高的重油繭絲進(jìn)行脫膠除油能夠取得較好的效果。

為了更好地提高重油繭絲脫膠除油效率，考察了脫油菌株和脫膠菌株同時(shí)接種共培養(yǎng)48h（TY+TJ48）和順序接種（先接種TY4，發(fā)酵24h后，接種TJ5）再共培養(yǎng)24h（TYTJ24）兩種工藝對(duì)繭絲脫膠和除油效果的影響，其結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，與同時(shí)接種相比，采用順序接種，殘油率從072%降至0.5%，但脫膠率從18.3%降至14.0%，主要原因是脫膠時(shí)間減少。因此，將順序接種后共培養(yǎng)時(shí)間增加至48h，殘油率和脫膠率分別達(dá)到048%和24.1%。

3結(jié)論

1）利用透明圈法從繭絲腐化液中篩選獲得了一株脫油效果較好的菌株TY4，通過(guò)16S rDNA測(cè)序?qū)赀M(jìn)行了鑒定，確定該菌株為產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter），命名為Enterobacter sp. TY4。

2）通過(guò)對(duì)脫油菌株的脫油條件優(yōu)化，獲得了最適的碳源為蔗糖、最適氮源為蛋白胨、最適C/N為0.25︰1，培養(yǎng)基最適pH7.0，最適浴比和接種量分別為2︰125和1%。在最適培養(yǎng)條件下進(jìn)行脫油，重油繭絲殘油率最低可達(dá)0.33%。

3）通過(guò)脫油菌株TY4與脫膠菌株Aeromonas sp. TJ5的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及兩種菌株不同接種方式的對(duì)比，結(jié)果顯示共培養(yǎng)法對(duì)絹紡重油原料的脫膠和除油效果明顯好于菌株單獨(dú)作用，且次序接種更有利提高脫膠脫油效率，其最適共培養(yǎng)時(shí)間為48h，殘油率和脫膠率分別達(dá)0.48%和24.1%。本實(shí)驗(yàn)為重油原料除油、脫膠、環(huán)保、精煉工藝研究奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期： 20190610; 修回日期： 20201127

基金項(xiàng)目： 四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（18ZDYF3037）

作者簡(jiǎn)介： 陳祥平（1955），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事繭絲綢紡織材料及工程技術(shù)研究。