HPLC法測定烏發(fā)生發(fā)液中二苯乙烯苷含量

黃 丹，劉恒言，凌成利，向 韻，梁詩意，向愛香，雷 昌*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)/湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長沙 410208；2.湘西自治州民族中醫(yī)院，湖南 吉首 416000)

脂溢性脫發(fā)(seobrrheic alopecia，SA)簡稱脂脫，又名男性型禿發(fā)、雄激素源性禿發(fā)，中醫(yī)稱之為“發(fā)蛀脫發(fā)”“蛀發(fā)癬”，臨床多表現(xiàn)為頭發(fā)油膩、多屑，有明顯瘙癢感，額顳區(qū)及頂部的漸進(jìn)性脫發(fā)，繼而形成高額[1-2]。此病是皮膚科的常見病、多發(fā)病，也是難治性疾病之一。由于本病影響美觀，常給患者帶來很大的精神壓力和心理負(fù)擔(dān)[3]。

不同于醫(yī)院的專業(yè)治療，更多的SA患者傾向于生活中日常防護(hù)，洗發(fā)水作為和頭發(fā)接觸最多的日常用品，在解決毛發(fā)問題上有著一定便利性[4-5]。近年來，中藥在洗發(fā)水中廣泛應(yīng)用，技術(shù)發(fā)展很快，起到了治療SA的效果，受到廣大消費(fèi)者的熱愛，該類型的中藥洗發(fā)水也成為各機(jī)構(gòu)研究的熱點(diǎn)之一[6-7]。烏發(fā)生發(fā)液來源于老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，由制何首烏、側(cè)柏葉、白鮮皮、路路通、墨旱蓮等12味中藥組成，方中用制何首烏、女貞子、墨旱蓮滋陰補(bǔ)腎生發(fā)，側(cè)柏葉生發(fā)烏發(fā)，當(dāng)歸、桃仁、紅花活血化瘀，生地黃、熟地黃滋陰補(bǔ)血，白鮮皮清化濕熱，路路通、刺蒺藜祛風(fēng)除濕。全方共奏補(bǔ)腎生發(fā)、滋陰補(bǔ)血、活血化瘀、清熱利濕、祛風(fēng)除濕之功。該洗發(fā)液已于臨床運(yùn)用10余年，能有效治療SA患者的脂溢性皮炎及瘙癢感，緩解SA患者的脫發(fā)癥狀，該產(chǎn)品已證明安全無不良反應(yīng)。本研究以烏發(fā)生發(fā)液中君藥何首烏的主要有效成分二苯乙烯苷為檢測指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定其含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Aigent-1260高效液相色譜儀(安捷倫儀器設(shè)備有限公司)，電子天平(AL204，梅特勒-托利多上海有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph Hei-VAP，上海本昂科技儀器有限公司)，水循環(huán)真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州紫拓儀器有限公司)，恒溫循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱(WGL-230B，天津市泰斯特儀器有限公司)，KM-250DE超聲波清洗器(昆山美超聲儀器有限公司)，純水儀(ELGA，UK)。

1.2 材料

二苯乙烯苷對照品(批號：J1708Z45941，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈、甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱采用依利特Supersil ODS-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(25∶75)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為320 nm，進(jìn)樣量10 μL，理論板數(shù)按二苯乙烯苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取二苯乙烯苷對照品4.1mg，置25mL量瓶中，加稀乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1mL中含二苯乙烯苷0.164mg的對照品溶液。

2.3 烏發(fā)生發(fā)液的制備

按照處方取何首烏、當(dāng)歸、側(cè)柏葉、黑芝麻、黑豆等18味中藥材，置于電熱爐中，提取2次。第1次加10倍量水，浸泡30 min后，通電加熱，自沸騰開始計(jì)時，提取2 h。第2次加10倍量水，通電加熱，自沸騰開始計(jì)時，提取2 h，合并兩次提取液(過200目篩)，冷卻，50 ℃真空減壓濃縮至200 mL，測定pH和密度，放入冰柜(-40 ℃)冷凍過夜，然后冷凍干燥，即得烏發(fā)生發(fā)液干燥粉末。

2.4 供試品溶液的制備

取烏發(fā)生發(fā)液干燥粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇25 mL，再稱重，超聲30 min，取出放冷，補(bǔ)重，搖勻，過0.45 μm微孔薄膜，注入棕色樣品瓶中，即得。

2.5 陰性對照溶液的制備

按照配方，取除何首烏外的17種藥材(當(dāng)歸、女貞子、黑芝麻等)，按照“2.3項(xiàng)下烏發(fā)生發(fā)液”方法，制成缺何首烏藥材的烏發(fā)生發(fā)液，再按照“2.4項(xiàng)下供試品溶液制備”方法，制成缺何首烏的陰性對照溶液。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將二苯乙烯苷對照品溶液用稀乙醇分別稀釋2、4、8、16、32、64倍，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，設(shè)置進(jìn)樣量為10 μL，并以各自標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)(X)，波長320nm下的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終得二苯乙烯苷的線性回歸方程為：Y=968.04X+15.793(r2=0.999 2)，線性范圍為：3.29～16.4 μg。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取制備好的供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h定時進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，測定并計(jì)算得二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.68%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.6.3 精密度試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)樣供試品溶液6次，每次10 μL，測定并計(jì)算得二苯乙烯苷峰面積RSD為0.90%。表明儀器精密度符合要求。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)取制備好的供試品溶液6份，依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測得峰面積并計(jì)算得二苯乙烯苷含量RSD為0.59%，表明該法重復(fù)性良好。

2.6.5回收率試驗(yàn)精密量取6份已知含量的樣品，分別加入一定量二苯乙烯苷對照品，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。計(jì)算得二苯乙烯苷的平均加樣回收率為99.45%，RSD為1.56%，表明該法準(zhǔn)確度良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 含量測定

取制備好的供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，測定二苯乙烯苷峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得烏發(fā)生發(fā)液中二苯乙烯苷含量1.73 μg/mL。結(jié)果見圖1。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本試驗(yàn)比較了不同流動相系統(tǒng)的可行性，如乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸溶液等，結(jié)果表明采用乙腈-水溶液為流動相時，基線較平穩(wěn)，目標(biāo)峰無拖尾和前延，靈敏度高，分離度較好，故該實(shí)驗(yàn)中流動相采用乙腈-水溶液；再對此流動相不同比例(20∶80、25∶75、30∶70)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所用比例乙腈-水(25∶75)分離度最好，并且最大限度地節(jié)省了分析時間。

3.2 供試品制備方法選擇

本試驗(yàn)比較了不同提取溶媒(70%甲醇、稀乙醇)，不同提取方法(超聲、水浴回流)和提取時間(15 min、30 min、45 min)，從二苯乙烯苷含量、節(jié)約成本、便捷性等角度進(jìn)行考察，確定了采用稀乙醇作為提取溶媒，超聲提取30 min進(jìn)行供試品溶液的制備。

圖1二苯乙烯苷對照品(A)、烏發(fā)生發(fā)液樣品(B)和陰性樣品(C)的HPLC圖譜

目前西醫(yī)臨床針對SA主要以外科手術(shù)、藥物治療為主，盡管療效肯定，但大多數(shù)西藥只能減少毛發(fā)脫落，且副作用較明顯，某些藥物雖能促進(jìn)毛發(fā)再生，但停藥后的繼續(xù)脫發(fā)使得其療效難以維持；縫縮術(shù)和植發(fā)術(shù)等外科手術(shù)方法，雖可改善禿發(fā)的不良視覺，達(dá)到一定的美容效果，但術(shù)后往往頭發(fā)外觀不自然，對于本身供區(qū)頭發(fā)稀少的患者，手術(shù)難以實(shí)施；另外，禿發(fā)面積較大的患者需多次植發(fā)，手術(shù)費(fèi)用高[8]。中醫(yī)治療SA方法多樣，注重標(biāo)本兼治，從整體上調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌功能，在改善癥狀、延緩病程方面已取得較好的臨床療效，但其復(fù)雜的成分體系使得其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究困難。因此，本研究通過高效液相法測定烏發(fā)生發(fā)液中二苯乙烯苷的含量，不僅為本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，同時對于該產(chǎn)品治療SA的物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有重要意義。