正交試驗優(yōu)選百芩止咳顆粒提取工藝

馮建安，李 希*，張 海，楊 雷，侯豐爵，李雙雙

(1.四川省中醫(yī)藥科學院 中醫(yī)研究所，四川 成都 610031；2.成都中醫(yī)藥大學 藥學院，四川 成都 610075)

咳嗽為呼吸系統(tǒng)疾病的常見癥狀。隨著自然環(huán)境及氣候變化，咳嗽的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。百芩止咳合劑為四川省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)研究所(四川省第二中醫(yī)醫(yī)院)臨床使用30余年的經(jīng)驗方，療效顯著，此方由黃芩、陳皮、百部等藥味組成，具有清熱解毒、化痰止咳的功效，用于風熱咳嗽、痰多，對肺熱咳嗽、急慢性支氣管炎屬熱型療效顯著。方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒[1，2]，善清肺火及上焦之實熱，用于治療肺熱咳嗽，現(xiàn)代藥理學研究表明，黃芩還有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎等作用[3-6]，為治療咳嗽的常用中成藥之一[7]。陳皮主要包含橙皮苷為主的黃酮類及揮發(fā)油等燥濕化痰成分，用于濕痰咳嗽[8]。陳皮既能燥濕化痰，又能溫化寒痰、理氣健脾、辛散苦泄而能宣肺止咳，為治痰之要藥[9]，現(xiàn)代藥理學研究還發(fā)現(xiàn)，橙皮苷具有降低膽固醇、促進胃腸蠕動、抗炎等功能[10，11]，與黃芩共為君藥，發(fā)揮清熱解毒、化痰止咳之功效。現(xiàn)根據(jù)處方藥味的主要藥效成分的理化性質(zhì)以君藥黃芩和陳皮中的黃芩苷和橙皮苷轉(zhuǎn)移率及干膏收率為評價指標，通過正交試驗優(yōu)選水提取工藝，為本制劑的開發(fā)研究提供工藝條件參數(shù)?，F(xiàn)將研究過程報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器；黃芩苷對照品(批號：110715-201318)；橙皮苷對照品(批號：10721-201617)；乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷含量測定

2.1.1 溶液配制 對照品溶液制備：取在60 ℃條件下減壓干燥4 h的黃芩苷對照品8.45 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.338 mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液制備：精密量取“正交試驗”項下的濃縮液1 mL，加甲醇至50 mL，超聲處理20 min，冷卻，加甲醇定容至50 mL，濾過，取濾液，即得。

陰性樣品溶液制備：取缺黃芩的藥材，按正交試驗提取，按“供試品溶液的制備”項下方法同法制成陰性樣品溶液。

2.1.2 色譜條件及專屬性考察色譜柱Agilent Eclipse XDB- C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器；流動相為甲醇-0.4%磷酸(40∶60)；流速：1 mL/min；柱溫25 ℃，進樣量10 μL；紫外檢測波長：280 nm。分別取對照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液按照上述色譜條件進行試驗，記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，陰性樣品在黃芩苷峰處無干擾，表明所用方法專屬性良好。見圖1。

注：Ⅰ黃芩苷對照品；Ⅱ樣品；Ⅲ陰性樣品

2.1.3 黃芩苷線性關系考查分別精密吸取黃芩苷對照品溶液2、4、6、8 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別得到濃度為67.6 μg/mL、135.2 μg/mL、202.8 μg/mL、270.4 μg/mL、338 μg/mL 的對照品溶液。采用高效液相色譜法進行試驗，分別精密吸取各濃度黃芩苷對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按照“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積，測定結(jié)果見表1。以峰面積積分值(Y)為縱坐標，黃芩苷對照品的濃度(X)(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，見圖2，并計算回歸方程：Y=32.819X+42.556(r=0.999 7)；結(jié)果表明：在67.6～338.0 μg/mL范圍內(nèi)，黃芩苷峰面積積分值與進樣量的線性關系良好。

表1 黃芩苷線性關系考察

注：r=0.999 7。

圖2黃芩苷標準曲線

2.1.4 精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收率試驗精密吸取對照品溶液(0.338 mg/mL)，量取“正交試驗”項下的供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，重復進樣6次，測定，計算RSD分別為1.54%、0.40%，表明儀器精密度良好。

精密吸取對照品溶液(0.338 mg/mL)，量取“正交試驗”項下供試品溶液各10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h，注入液相色譜儀，測定，RSD值分別為0.80%、0.23%，均小于3%，表明對照品溶液、供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密量取提取液6份，每份1 mL，按照“供試品溶液的制備”方法進行處理，并按照上述色譜條件測定，RSD=0.86%(n=6)，表明所用方法重復性良好。

精密量取上述已知提取液9份，每份20 mL，分別按高、中、低濃度精密加入對照品溶液，按照“供試品溶液的制備”方法進行處理，并按照上述色譜條件測定，平均回收率=99.6%，RSD=1.01%(n=9)，表明所用方法準確度良好。

2.1.5 樣品含量測定分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定，以外標法計算黃芩苷的含量。黃芩苷轉(zhuǎn)移率(%)=測得黃芩苷含量(mg/g)/藥材中黃芩苷含量(mg/g)×100%。

2.2 橙皮苷的含量測定

2.2.1 溶液配置對照品溶液的制備：取橙皮苷對照品12.70 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.508 mg/mL的橙皮苷對照品溶液。

供試品溶液制備：精密量取“正交試驗”項下的濃縮液10 mL，濃縮至干，加甲醇至50 mL，超聲處理20 min，冷卻，加甲醇定容至50 mL，濾過，取濾液，即得。

陰性樣品溶液制備：取缺陳皮的處方藥材，按正交試驗提取，按“供試品溶液的制備”項下方法同法制成陰性樣品溶液。

2.2.2 色譜條件及專屬性考察 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇-6%冰醋酸(24∶76)；流速：1 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫30 ℃；紫外檢測波長：283 nm。分別量取陰性樣品溶液、樣品溶液、對照品溶液按照上述色譜條件進行試驗，記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，陰性樣品在橙皮苷峰處無干擾，表明所用方法專屬性良好。見圖3。

2.2.3 橙皮苷線性關系考察 分別精密吸取橙皮苷對照品溶液2、4、6、8 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別得到濃度為67.6 μg/mL、135.2 μg/mL、202.8 μg/mL、270.4 μg/mL、508 μg/mL的對照品溶液。按照高效液相色譜法試驗，分別精密吸取橙皮苷對照品溶液2、4、6、8、10 μL注入高效液相色譜儀，按照“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積，測定結(jié)果見表2。以峰面積積分值(Y)為縱坐標，橙皮苷對照品的含量(X)(μg)為橫坐標，繪制標準曲線(圖4)，并計算回歸方程：y=3733.6x+307.03(r=0.999 7)；結(jié)果表明在0.1016～0.508 mg/mL范圍內(nèi)，橙皮苷峰面積積分值與進樣量的線性關系良好。

表2 橙皮苷線性關系的考察

注：r=0.9997。

2.2.4 精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收率試驗 精密吸取對照品溶液(0.508 mg/mL)，量取“正交試驗”項下的供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，重復進樣6次，測定，計算RSD值分別為0.80%、0.93；RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

精密吸取對照品溶液(0.508 mg/mL)，量取“正交試驗”項下的供試品溶液各10μL，分別于0、2、4、8、12、24 h，注入液相色譜儀，測定，RSD值分別為0.79%、0.59，均小于3%，表明對照品溶液、供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密移取提取液6份，每份10 mL，按照“供試品溶液的制備”方法進行處理，并按照上述色譜條件測定，RSD=0.93%(n=6)，表明所用方法重復性良好。

精密移取上述已知提取液9份，每份20 mL，分別按高、中、低濃度精密加入對照品溶液，按照“供試品溶液的制備”方法進行處理，并按照上述色譜條件測定，平均回收率=100.6%，RSD=1.31%(n=9)，表明所用方法準確度良好。

2.2.5 樣品含量測定 分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定，以外標法計算橙皮苷的含量。橙皮苷轉(zhuǎn)移率(%)=測得橙皮苷含量(mg/g)/藥材中橙皮苷含量(mg/g)×100%。

注：Ⅰ對照品；Ⅱ樣品；Ⅲ陰性樣品

圖4橙皮苷標準曲線

2.3 干膏收率

用移液管精密吸取提取濃縮液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥至恒重，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算干膏收率。干膏收率=測得干膏重(g)/正交試驗用藥材的量(g)×100%。

2.4 正交試驗

采用水煎煮提取的方法，影響水提效果的因素主要有藥材粉碎粒度、提取溫度、加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)等。根據(jù)湯劑的制備方法、藥材所含成分的性質(zhì)和制劑生產(chǎn)的實際情況，藥材采用飲片形式以水煎煮提取數(shù)次，即可充分浸出有效成分。因此，對加水量、煎煮時間和次數(shù)3個因素各設3個水平，按照L9(34)正交表安排試驗，因素水平，見表3。

按處方比例稱取藥材75g，按表中正交試驗條件進行提取，過濾，濾液濃縮至200 mL，備用。按照“2.1.5”和“2.2.5”項下方法分別測定黃芩苷、橙皮苷轉(zhuǎn)移率，按照“2.3”項下方法測定出膏率，并將3項綜合加權(quán)評分為指標，權(quán)重系數(shù)分別定為0.4、0.4、0.2，考察各因素對提取工藝的影響。結(jié)果見表4、表5。

表3 試驗因素水平

表4 正交試驗結(jié)果

注：W=X*40+Y*40+Z*20。

表5 方差分析

由表4直觀分析結(jié)果可知，影響提取效果的因素順序為：C>B>A，即煎煮次數(shù)>煎煮時間>加水倍數(shù)，最佳提取工藝條件為A3B3C3；由表5方差分析結(jié)果可知，B3與B2相差不大，將B3調(diào)整為B2，并結(jié)合生產(chǎn)實際，從節(jié)約能耗出發(fā)，將C3與 C2對比驗證，即進行3次A3B3C3、A3B2C2的對比驗證試驗。

2.5 對比驗證試驗

按A3B3C3、A3B2C2工藝條件，分別進行3組平行試驗，結(jié)果見表6。

表6 對比驗證試驗結(jié)果

由表6可知，工藝條件A3B3C3與工藝條件A3B2C2所得結(jié)果黃芩苷轉(zhuǎn)移率、橙皮苷轉(zhuǎn)移率、干膏收率、綜合評分均相差不大，且工藝穩(wěn)定。因此，為節(jié)約能耗，選擇水煎煮工藝為加8倍水，煎煮2次，每次1.0 h。

3 討論

百芩止咳顆粒主要功效為清熱解毒、化痰止咳，用于風熱咳嗽、痰多。本研究工藝采用水提取，保證了與原湯劑物質(zhì)基礎和療效的一致性。查閱組成本方的藥物，其所含的有效成分主要為黃酮類、生物堿類等成分，能印證提取工藝的合理性。采用本實驗優(yōu)選后的提取工藝，其主要有效成分黃芩苷和橙皮苷的轉(zhuǎn)移率均較高，為本方改良為顆粒劑和提升質(zhì)量標準提供了依據(jù)。

本實驗主要選用黃芩苷及橙皮苷的含量為主要評價指標，對提取工藝進行正交設計，優(yōu)化其制備工藝，確定百芩止咳顆粒的最佳提取工藝。但由于中藥復方的復雜性，只對君藥的黃芩和陳皮的有效成分進行了含量測定，而未對其他成分進行含量測定，所以評價指標還不夠全面。如果在工藝提取優(yōu)選過程中，同時對提取液主要藥效進行對比驗證，將使優(yōu)選更加準確。