廣玉蘭新品種‘碧翠’的抗寒性評(píng)價(jià)及抗寒性指標(biāo)篩選

孫凌霄， 金曉玲，2*， 胡希軍，2， 譚殷殷， 羅峰， 張哲， 陳燕

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

廣玉蘭(Magnoliagrandiflora)又名荷花玉蘭、洋玉蘭，為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia)常綠喬木，樹高7 m～13 m，在原產(chǎn)地最高可達(dá)30 m，胸徑20 cm～39 cm；樹皮深灰色，嫩枝和芽均密被銹色短絨毛，具有很大的向北方地區(qū)引種的潛力[1].

木蘭科植物的抗寒性研究一直以來都是一個(gè)比較熱門的研究方向，大量試驗(yàn)研究都認(rèn)為廣玉蘭是木蘭科中抗寒性較強(qiáng)的植物[2].劉艷萍等[3]通過測(cè)定幾種廣玉蘭品種的相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算出半致死溫度，并進(jìn)行比較.相對(duì)電導(dǎo)率隨著溫度的降低，先緩慢上升，然后急劇升高，最后趨于穩(wěn)定，每個(gè)品種的變化趨勢(shì)均一致.開始降溫時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率緩慢增加，說明在此溫度范圍內(nèi)能夠適應(yīng)，但溫度下降到-5 ℃～-10 ℃時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率開始急劇升高，而且溫度進(jìn)一步降低到-20 ℃～-25 ℃時(shí)，廣玉蘭葉片的相對(duì)電導(dǎo)率趨于穩(wěn)定，說明此時(shí)細(xì)胞已受到嚴(yán)重傷害.幾個(gè)廣玉蘭品種的半致死溫度最高為-18.86 ℃，最低可達(dá)-22.56 ℃.李杰等[4]研究了低溫脅迫對(duì)廣玉蘭生理特性的影響，在人工低溫脅迫條件下，探討廣玉蘭細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性[5]、SOD活性[6]和可溶性糖含量[7]動(dòng)態(tài)變化規(guī)律得出結(jié)論：廣玉蘭細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性隨溫度下降而呈“S”型曲線變化，與溫度成負(fù)相關(guān)，不同溫度處理下SOD活性變化呈雙峰曲線，且與溫度呈正相關(guān)；可溶性糖含量呈先升高后下降的變化趨勢(shì).

對(duì)廣玉蘭的雜交后代和變種的研究較少，本研究以4年生新品種‘碧翠’和4年生‘?？怂姑┧埂?園林綠化中普遍使用的廣玉蘭品種)為試驗(yàn)材料，研究在人工低溫脅迫過程中植株的抗寒性，旨在了解該品種的抗寒性強(qiáng)弱，便于進(jìn)一步推廣，同時(shí)篩選廣玉蘭的抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，為廣玉蘭在園林中引種馴化和推廣提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為種植于中南林業(yè)科技大學(xué)校園內(nèi)的四年生‘埃克斯茅斯’廣玉蘭(Magnoliagrandiflora‘Exmouth’)和四年生‘碧翠’廣玉蘭(Magnoliagrandiflora‘Bicui’)，選擇長(zhǎng)勢(shì)和管理良好的植株進(jìn)行試驗(yàn).

‘埃克斯茅斯’廣玉蘭葉片深綠色，葉形較窄，葉背面有棕色絨毛.‘碧翠’廣玉蘭葉片顏色翠綠，葉形較寬，葉背面無毛.

1.2 試驗(yàn)方法

在2017年2月23日進(jìn)行采樣.從兩植株上隨機(jī)采集位于中上部的當(dāng)年生側(cè)枝上的第3枚～5枚完整無破損大小相近的成熟葉片，每株采8片(2片備用)，采摘后立即放入密封塑料袋帶回實(shí)驗(yàn)室.將葉片用蒸餾水洗凈再用去離子水清洗，用濾紙擦干凈后分別取兩棵植株的6片葉片，放入6個(gè)潔凈的密封袋中，共12片葉片.把裝袋的葉片放置低溫恒溫槽中，試驗(yàn)設(shè)6個(gè)溫度梯度，分別為：5 ℃(常溫)、0 ℃、-5 ℃、-10 ℃、-15 ℃、-20 ℃，每個(gè)梯度均處理2 h，之后將材料取出放入冰箱解凍，次日測(cè)定各材料的生理生化指標(biāo)，將每組平均分成3份，重復(fù)3次，測(cè)得結(jié)果求平均值.

采用電導(dǎo)儀測(cè)定法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率，儀器為雷磁DJS-1D電導(dǎo)儀；采用酸性茚三酮法進(jìn)行游離脯氨酸含量測(cè)定；采用硫代巴比妥酸比色法進(jìn)行丙二醛含量測(cè)定；采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行可溶性蛋白含量測(cè)定；采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性.

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010及SPSS 18.0軟件處理，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，采用Logistic擬合求得半致死溫度，應(yīng)用模糊隸屬函數(shù)對(duì)‘碧翠’廣玉蘭和‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià).將每個(gè)品種各階段各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加求平均值，隸屬函數(shù)均值越大的品種抗寒性越強(qiáng).

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響

葉片受低溫脅迫，由于細(xì)胞膜受到破壞致使胞內(nèi)物質(zhì)外滲，溫度的降低會(huì)使外滲物質(zhì)增多，相對(duì)電導(dǎo)率(REC)便會(huì)逐漸增大，隨著人工低溫脅迫的加強(qiáng)，兩個(gè)廣玉蘭品種的離體葉片REC不斷增大，與低溫脅迫程度呈負(fù)相關(guān).在不同的溫度段，REC增加的程度不同，從兩個(gè)品種的REC變化曲線可以看出，當(dāng)溫度不斷降低達(dá)到臨界值時(shí)，REC的變化趨勢(shì)由緩慢上升變?yōu)榧眲∩仙?，不同品種的這個(gè)臨界值會(huì)有所不同，由圖1可知，‘碧翠’的臨界值在0 ℃～-5 ℃之間，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的臨界值在-5 ℃～-10 ℃之間，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭細(xì)胞膜通透性發(fā)生大幅度變化的臨界溫度低于‘碧翠’廣玉蘭.

圖1 低溫脅迫對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.1 Effect of low temperature stress on REC

兩個(gè)廣玉蘭品種的的REC擬合的Logistic方程，均達(dá)到極顯著水平.得到‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的半致死溫度為-4.28 ℃，‘碧翠’廣玉蘭的半致死溫度為-3.03 ℃(表1).

表1 相對(duì)電導(dǎo)率的Logistic方程參數(shù)值及半致死

e自然對(duì)數(shù)的底數(shù)約等于2.71828

2.2 低溫脅迫對(duì)MDA含量影響

由圖2可知，低溫脅迫下，兩個(gè)品種MDA含量變化趨勢(shì)相同，均隨溫度下降而增加，與低溫脅迫呈極顯著負(fù)相關(guān).‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的MDA含量高于‘碧翠’廣玉蘭.兩者在-10 ℃～-15 ℃之間增加較多，在-20 ℃時(shí)MDA含量達(dá)到最大值，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭為24.63 umol/g FW，‘碧翠’廣玉蘭為22.83 umol/g FW.

圖2 低溫脅迫對(duì)MDA含量的影響Fig.2 Effect of low temperature stress on MDA content

2.3 低溫脅迫對(duì)游離脯氨酸含量影響

通常植物體內(nèi)游離脯氨酸(Pro)含量不高，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，Pro含量會(huì)迅速增加，該指標(biāo)可以反映植物受低溫傷害程度及對(duì)低溫的承受能力.從圖3可以看出，兩個(gè)廣玉蘭品種的Pro含量隨著溫度的降低呈先升后降的趨勢(shì)，但積累的量與積累速率有差異.不同溫度下兩個(gè)廣玉蘭品種的Pro含量存在明顯差異，‘埃克斯茅斯’廣玉蘭明顯高于‘碧翠’廣玉蘭.兩種廣玉蘭的Pro含量均在-5 ℃時(shí)達(dá)到最大值，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭為152.90 ug/g FW，‘碧翠’廣玉蘭為150.29 ug/g FW.

圖3 低溫脅迫對(duì)游離脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of low temperature stress on free proline content

2.4 低溫脅迫對(duì)可溶性蛋白含量影響

可溶性蛋白(SP)具有較強(qiáng)的親水性，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力，從而提高植物的抗寒性.由圖4可知，隨著溫度的降低，兩個(gè)廣玉蘭品種的SP含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，SP含量整體與低溫脅迫溫度呈極顯著正相關(guān)，均在-5 ℃達(dá)到最大值，且在溫度低于-5 ℃時(shí)兩個(gè)品種的SP含量差異顯著，‘碧翠’廣玉蘭的下降幅度和速率大于‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭.因此，在低溫環(huán)境下‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的SP含量高于‘碧翠’廣玉蘭，其保水能力及抗寒性更強(qiáng).

圖4 低溫脅迫對(duì)可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effect of low temperature stress on soluble protein content

2.5 低溫脅迫對(duì)POD、SOD活性影響

在植物受到低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)的活性氧和自由基會(huì)積累，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，而POD和SOD可以有效清除細(xì)胞內(nèi)的這些有害物質(zhì)，避免植物受到傷害.由圖5可知，隨著溫度降低，兩個(gè)廣玉蘭品種的SOD活性差異較大，變化趨勢(shì)基本相同，但酶活性達(dá)到最大值的溫度不同.隨著溫度降低‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的SOD活性逐漸增大，-15 ℃時(shí)達(dá)到最大值；隨著溫度降低，‘碧翠’廣玉蘭的SOD活性逐漸增大，-5 ℃時(shí)達(dá)到最大值.當(dāng)溫度在一定范圍內(nèi)小幅度降低時(shí)，植物的抗逆性使SOD活性增強(qiáng)，以清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧和自由基，而過低的溫度會(huì)使酶活性降低.

由圖6可知，溫度降低對(duì)兩種廣玉蘭POD活性影響不一致.溫度降低‘埃克斯茅斯’廣玉蘭POD活性先降低，-5 ℃時(shí)達(dá)到最小值，然后增大，-15 ℃達(dá)到最大值；溫度降低‘碧翠’廣玉蘭POD活性先升高，-5 ℃時(shí)達(dá)到最大值，兩個(gè)品種無明顯變化規(guī)律.

2.6 兩個(gè)廣玉蘭品種抗寒性綜合評(píng)價(jià)

植物的抗寒機(jī)制十分復(fù)雜，只用某個(gè)指標(biāo)判斷抗寒性具有片面性，不同的抗寒指標(biāo)在不同植物上的響應(yīng)程度也會(huì)有一定差異，因此應(yīng)對(duì)多個(gè)抗寒指標(biāo)進(jìn)行綜合分析才能全面地反映抗寒性.采用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，將兩個(gè)品種各梯度的隸屬函數(shù)值相加求均值，均值越大，品種的抗寒性就越強(qiáng)[8-10].由表2可知，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭各隸屬函數(shù)均值大于‘碧翠’廣玉蘭，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭抗寒性大于‘碧翠’廣玉蘭.

圖5 低溫脅迫對(duì)SOD活性的影響Fig.5 Effect of low temperature stress on SOD activity

圖6 低溫脅迫對(duì)POD活性的影響Fig.6 Effect of low temperature stress on POD activity

表2 兩個(gè)廣玉蘭品種抗寒性評(píng)價(jià)

3 討論

由于自然環(huán)境中有極端天氣等不可控因素，同一物種栽培于不同地理區(qū)域時(shí)，其低溫半致死溫度也會(huì)有所改變.同時(shí)，不同試驗(yàn)條件下測(cè)出的低溫半致死溫度也有一定差別.所以，低溫半致死溫度應(yīng)是一個(gè)相對(duì)的概念，它只能夠用于衡量幾個(gè)種之間的相對(duì)抗寒性強(qiáng)弱，而不能直接用來指導(dǎo)植物栽培.

陳潔等[11]對(duì)幾種含笑屬植物抗寒生理指標(biāo)篩選進(jìn)行研究，認(rèn)為REC、MDA和SP等三個(gè)指標(biāo)能夠反映出含笑屬植物抗寒性.本研究認(rèn)為廣玉蘭的抗寒生理指標(biāo)是REC和SP，相比之下少了MDA指標(biāo).含笑屬抗寒指標(biāo)篩選研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下MDA含量與抗寒性呈正相關(guān)[11]，但本研究認(rèn)為低溫脅迫下兩個(gè)廣玉蘭品種的MDA含量的增加無明顯差別，因此，MDA不能作為廣玉蘭品種抗寒性的生理指標(biāo).MDA是由于植物細(xì)胞受到傷害后應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物，傷害越大MDA含量越高，MDA含量越高植物抗寒性越弱[8，9].但有些研究結(jié)果卻相反，MDA含量與其抗寒性強(qiáng)弱呈正比，本研究的結(jié)果也是MDA含量高的品種抗寒性更強(qiáng).MDA含量作為植物抗寒性生理指標(biāo)以及對(duì)木蘭科植物的抗寒性作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

兩個(gè)廣玉蘭品種的抗寒能力存在差異，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭半致死溫度低于‘碧翠’廣玉蘭.對(duì)6個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，REC、SP兩個(gè)生理生化指標(biāo)是反應(yīng)抗寒性強(qiáng)弱的較佳指標(biāo).