用于腫瘤治療的線粒體靶向配體和納米載體遞釋系統(tǒng)研究進展

劉云虎 孫 濤

(復旦大學 藥學院，上海 201203)

0 引言

線粒體作為活細胞中的“能量工廠”，通過三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化和電子傳遞等過程產(chǎn)生ATP. 同時，線粒體也介導細胞中許多重要的信號通路.在能量缺乏、氧化應激或其他條件下，線粒體通過釋放細胞色素C介導細胞凋亡信號通路.細胞色素C通過膜電位的降低、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道的開放等方式被釋放到細胞質(zhì)，隨后與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前體蛋白形成凋亡小體并激活半胱天冬酶-9.被激活的半胱天冬酶-9能繼而激活半胱天冬酶-3等其他半胱天冬酶，引發(fā)細胞凋亡[1].由于對細胞產(chǎn)能和凋亡有重要調(diào)控作用，線粒體成為腫瘤治療的重要靶點[2].

相對于正常細胞，癌細胞的線粒體結(jié)構(gòu)和功能存在一些變化，例如線粒體跨膜電位相對正常細胞有所增加、線粒體三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)生成能力受損和活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成異常增加等.因此，對于一些作用于直接與線粒體相互作用或通過影響線粒體功能以改變細胞代謝的藥物，這些差異的存在可能為其提供了優(yōu)先靶向腫瘤細胞的生物學基礎(chǔ)[2].例如線粒體跨膜電位的增加使一些線粒體靶向化合物能夠優(yōu)先累積在癌細胞線粒體；由于ATP與ROS的異常生成，癌細胞線粒體更容易發(fā)生功能障礙和線粒體DNA突變，這使得部分作用于線粒體的抗癌藥物對可能對癌細胞具有更大的殺傷性等等.所以藥物的線粒體靶向遞送可能對增強其對腫瘤細胞的選擇性具有一定價值.此外，已知許多抗癌藥物(阿霉素、順鉑、紫杉醇、白藜蘆醇和卟啉衍生物等)可在線粒體被激活[3].因此，增強抗癌藥物在線粒體的靶向積累將有助于提高治療效果，并有可能克服耐藥性問題.綜上所述，將抗癌藥物的線粒體靶向遞送策略具有較高的研究價值.

目前實現(xiàn)藥物的線粒體靶向遞送主要有兩種方法：用線粒體靶向配體與藥物直接綴合，或是通過具有線粒體靶向功能的納米載體進行藥物遞送.分別對用于抗癌藥物綴合的線粒體靶向配體和用于線粒體靶向遞藥的納米載體的研究現(xiàn)狀進行了綜述.

1 用于腫瘤治療的線粒體靶向配體

將線粒體靶向配體與藥物直接綴合是實現(xiàn)藥物的線粒體靶向遞送的一種思路.其中常用的線粒體靶向配體包括三苯基膦(Triphenyl phosphonium, TPP)、地喹氯銨(Dequalinium, DQA)、F16、胍鹽、羅丹明19、羅丹明123、線粒體穿透肽(Mitochondrial penetrating peptide, MPPs)等等.它們中的大多數(shù)都是離域親脂性陽離子(Delocalization lipophilic cation, DLCs)，這些配體的脂溶性使其能夠穿過細胞膜和線粒體膜，同時其所帶的正電荷使其在線粒體膜電位作用下進入線粒體基質(zhì)，使其具有線粒體靶向效應.又因癌細胞和轉(zhuǎn)化細胞的線粒體比正常細胞具有更高的跨膜電位，離域親脂性陽離子可優(yōu)先在癌細胞線粒體中積累[3].

線粒體靶向配體與藥物直接綴合的優(yōu)點是能使藥物更加精準地靶向遞送至線粒體.但線粒體靶向配體-藥物綴合物一般具有水溶性不佳的問題，且一些線粒體靶向配體具有細胞毒性.線粒體靶向配體直接與藥物綴合還有可能會影響藥物的化學活性[3].

1.1 三苯基膦(Triphenylphosphonium, TPP)

三苯基膦是應用最廣泛的線粒體靶向親脂性陽離子配體，它由一個帶正電荷的磷離子和三個苯環(huán)連接而成，后者使其具有較大的脂溶性.三苯基膦曾經(jīng)用于線粒體膜電位的測量，其行為和與線粒體的相互作用已經(jīng)非常明確[4].膜電位每升高60 mV，TPP在膜負電位側(cè)的相對濃度就增加10倍.細胞質(zhì)膜的膜電位通常在-60至-30 mV之間，這使細胞內(nèi)外TPP濃差達10倍；線粒體膜電位則一般低至-180 mV，這又使線粒體內(nèi)TPP累積高達1000倍.TPP作為線粒體靶向配體，相對于其他小分子線粒體遞送方法具有如下優(yōu)勢：TPP在生物系統(tǒng)中較穩(wěn)定，兼具親水性和親脂性，合成與純化相對簡單，對細胞組分的化學反應性低，且在可見光和近紅外光譜區(qū)域中無光吸收或熒光發(fā)射[5].下面對一些使用TPP作為為線粒體靶向配體與抗癌藥物綴合的實例進行了介紹.

Fan及其團隊設(shè)計并合成了線粒體靶向前體PDT-PAO-TPP[6]. PDT-PAO是一種有機砷(圖2)，其對白血病、淋巴瘤和實體瘤有一定抗癌功效[7].將之與TPP綴合，在細胞毒篩選中，相對PDT-PAO，PDT-PAO-TPP顯示出對NB4細胞更好的抑制能力.PDT-PAO對NB4細胞的半抑制濃度(IC50)為1.25±0.02(24 h)和0.82±0.15(48 h)，而PDT-PAO-TPP對NB4細胞的IC50為0.65±0.05(24 h)和0.51±0.01(48 h)，低于PDT-PAO.研究證實大部分PDT-PAO-TPP在線粒體中積累，并可誘導線粒體去極化.此外，PDT-PAO-TPP對丙酮酸脫氫酶復合物(PDHC)和呼吸鏈復合物具有雙重抑制作用，能介導細胞色素C的釋放和激活胱天蛋白酶依賴性ROS介導的細胞凋亡.另外，Zhu Z Z及其團隊用-CH2Ph3P+修飾Pyriplatin設(shè)計了三種單功能線粒體靶向的PtII復合物OPT，MPT和PPT.(圖3)[8]單官能PtII復合物Pyriplatin此前

被報道具有抗腫瘤活性[9].進一步研究證明這三種復合物均可穿透線粒體并在線粒體基質(zhì)中積累.其中OPT對小鼠A549肺癌細胞具有最高的細胞毒性，在相同條件下，OPT對A549細胞處理48 h的IC50為8.7 ± 1.6,遠遠低于Pyriplatin(125.5 ± 5.8)，且低于順鉑(12.6 ± 1.1).

對肺癌異種移植瘤小鼠，OPT注射19 d后，腫瘤體積增長低于注射生理鹽水或順鉑的對照組.研究其在小鼠中的組織分布發(fā)現(xiàn)，相比正常肺組織，OPT在腫瘤組織中的積累量提高近1.5倍，而順鉑則不具有該腫瘤組織靶向性.

1.2 地喹氯銨(Dequalinium，DQA)

地喹氯銨由兩個陽離子喹啉基團經(jīng)10個碳的烷基鏈連接而成，是一種離域的親脂性陽離子分子，具有線粒體靶向定位效應.該化合物在體外能夠抑制多種癌細胞系的增殖，在體內(nèi)亦具有抗腫瘤活性[10,11].研究表明其能誘導ROS的產(chǎn)生、抑制ATP的合成，導致線粒體膜電位的下降，造成細胞色素C的釋放，激活半胱天冬酶-9/半胱天冬酶-3依賴性的內(nèi)源性細胞凋亡途徑[12].部分研究使用了地喹氯銨與抗腫瘤藥物多柔比星(Doxorubicin, DOX)的綴合物DQA-Dox以實現(xiàn)多柔比星的線粒體靶向遞送，其在MCF-7/ADR細胞中主要積累在線粒體，且對MCF-7/ADR展現(xiàn)出高細胞毒性[13].

1.3 (E)-4-(1H-吲哚-3-基乙烯基)-N-甲基吡啶碘化物(F16)

F16作為一種離域親脂性陽離子配體，具有線粒體靶向定位效應.它最初通過細胞水平的高通量篩選被發(fā)現(xiàn)，這種小分子能夠選擇性抑制乳腺上皮細胞，神經(jīng)過度表達細胞以及多種小鼠乳腺腫瘤和人乳腺癌細胞系的增殖[14]. F16本身具有細胞毒性，其在線粒體的累積會引起線粒體膜的去極化，破壞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，導致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道的開放，隨后造成細胞色素C的釋放，促使細胞凋亡[14].將其作為線粒體靶向配體的實例包括He H及其團隊所報道的研究[15].該研究將F16和廣泛使用的硼二吡咯亞甲基熒光染料(Boron-dipyrromethene, BODIPY)通過苯乙炔基接頭進行結(jié)合，制成了具有光學監(jiān)測能力和選擇性抗癌活性的雙功能線粒體靶向抗癌劑FPB(圖6).細胞毒篩選顯示，F(xiàn)PB對SGC-7901細胞的IC50比其不含BODIPY的前體F16-Ph-Ace低5倍，這說明硼二吡咯甲烷(游離形態(tài)時無明顯毒性)可能在FPB對細胞毒性起特殊作用.

1.4 胍/雙胍(Guanidine/Biguanidine)

胍和雙胍都是離域親脂性陽離子配體，其具有離域正電荷，因此比帶有定域電荷的基團表現(xiàn)出更強的親脂性.有研究指出基于兩親性陽離子喹啉的光敏劑與胍和雙胍單位綴合能夠提高其線粒體靶向定位效果與光毒性[16].該研究亦指出胍基團的存在可使胍-卟啉結(jié)合物發(fā)生溶酶體逃逸，其機制可能為質(zhì)子海綿效應引起的溶酶體膜破裂[16].

1.5 羅丹明(Rhodamine)

羅丹明123作為一種熒光染料曾被用于測量線粒體膜電位[17].因為具有親脂性和陽離子特性，它能在線粒體膜電位的驅(qū)動下穿過線粒體內(nèi)膜，并在線粒體基質(zhì)中積累.羅丹明123在動物腫瘤模型中表現(xiàn)出選擇性抗癌活性，這種選擇性的細胞毒性還可通過聯(lián)用2-脫氧葡萄糖或甲基乙二醛雙脒基腙進一步增強[18-20].但在相關(guān)臨床實驗中，羅丹明123的最大耐受劑量較低，而被認為無法滿足治療的需求[21].

與羅丹明123類似的羅丹明19被認為是一個潛在的線粒體靶向定位基團.用羅丹明19取代TPP-藥物綴合物上的TPP，新的綴合物表現(xiàn)良好的線粒體靶向定位性，證明羅丹明19具有良好的線粒體定位能力[22].

1.6 線粒體穿透肽(Mitochondria-penetrating peptide，MPPs)

線粒體穿透肽是一般具有重復的親脂殘基和陽離子殘基的、具有線粒體通透性的短肽，例如(L-環(huán)己基丙氨酸-D-精氨酸)3，即(Fx,r)3，其由重復的親脂殘基環(huán)己基丙氨酸和陽離子殘基精氨酸構(gòu)成.線粒體膜電位驅(qū)動攝取是該線粒體穿透肽的主要線粒體導向機制.線粒體穿透肽作為線粒體靶向輔基具有合成簡單、衍生物容易制備及生物相容性好等優(yōu)點[23].在針對其與多柔比星(Doxorubicin,Dox)綴合形成的肽-Dox綴合物(mtDox)的研究中，發(fā)現(xiàn)相對游離Dox，mtDox在A2780ADR耐藥細胞中顯示出更強的活性[24].該研究指出其機制可能與mtDox的線粒體靶向性，以及P-gp轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合位點的阻斷有關(guān).但在藥物敏感細胞中，mtDox的細胞毒性低于游離Dox.

1.7 線粒體靶向序列(Mitochondria-targeting sequence,MTSs)

由于絕大多數(shù)線粒體蛋白的前體蛋白合成于胞漿核糖體，因此這些前體蛋白需要有能被線粒體表面受體識別的特定線粒體靶向信號序列，以完成線粒體靶向.這些序列一般具有20-40個氨基酸的長度.此前，MTSs已被成功應用于一系列生物大分子的線粒體靶向遞送，包括DNA和蛋白質(zhì)等[25,26]. Wang等將編碼線粒體基質(zhì)酶鳥氨酸氨甲?；?OTC)前導肽的線粒體靶向序列(LFNLRILLNN AAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNK)與來源于腺病毒的受體調(diào)節(jié)細胞內(nèi)吞作用信號(CKKKKKKSEDEYPYVPN)連接，再以其修飾3-氨基丙基三乙氧基硅烷改性磁性納米粒子，以期通過納米粒子的線粒體靶向來改善腫瘤納米熱療的治療效果[27].實驗結(jié)果表明，相對僅修飾受體調(diào)節(jié)細胞內(nèi)吞作用信號的磁性納米粒子(經(jīng)納米熱療后HepG2細胞存活率72.35 ± 5.04%)，修飾了受體調(diào)節(jié)細胞內(nèi)吞作用信號和線粒體靶向序列的磁性納米粒子細胞毒性明顯提升(HepG2細胞存活率53.23 ± 4.48%).

2 用于腫瘤治療的線粒體靶向納米載體

雖然將線粒體靶向配體與抗癌藥物直接綴合的策略起到了良好的線粒體定位效果，但這些綴合物在水溶性和生物相容性方面的缺陷使其距離臨床應用還有一定距離.相比之下，使用納米載體裝載抗癌藥物的策略具有生物相容性好，調(diào)節(jié)藥物藥代動力學特征，提高藥物化學穩(wěn)定性等優(yōu)點，一些納米載體還可以控制其運載藥物在特定的靶點進行釋放[28].納米載體可以通過與靶向配體相連接實現(xiàn)線粒體靶向，少數(shù)納米載體因為自身的特性而本身具有線粒體靶向能力.用于腫瘤治療的納米載體包括納米顆粒、脂質(zhì)體、膠束、樹狀大分子、碳納米顆粒和金屬納米顆粒等.下面將分類進行討論.

2.1 聚合物納米顆粒與膠束

聚合物納米顆粒由兩親聚合物組裝而成，一般可在體內(nèi)生物降解.其具有生物相容性高，體積小，載藥量高，水溶性好，毒性低，且易于進行修飾等優(yōu)點.一些聚合物納米顆粒與膠束已經(jīng)應用于線粒體靶向，包括聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)、聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone, PCL)、殼聚糖、透明質(zhì)酸、樹枝狀高分子和一些由小兩親分子形成的膠束等.下面介紹一些用于線粒體靶向藥物遞送聚合物納米顆粒與膠束的實例.

Cho及其團隊報道了一種將三苯基膦連接在低分子量聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone, PCL)聚合物兩端而制成的兩親多聚物TPP-PCL-TPP(TPCL)[29].該多聚物在水性介質(zhì)中自組裝形成TPCL納米顆粒，該納米顆粒由于本身表面所帶的正電荷可能具有一定的細胞毒性.同時該納米顆粒的平均直徑為100 nm，為合適的藥物載體尺寸.疏水的多柔比星和親水的鹽酸多柔比星皆可被裝載在該種納米顆粒中.研究觀察到了對比游離多柔比星，TPCL納米顆粒具有更佳的線粒體靶向能力，并使多柔比星的細胞毒性升高了3-5倍.

Liu及其團隊將氯尼達明(Lonidamine, LND)與TPP綴合，再將所得共聚物TPP-LND與Dox組裝以形成TPP-LND-Dox納米顆粒，最后用甲氧基聚乙二醇羧酸(mPEG-COOH)修飾其表面，使其表面呈電中性，以提高其穩(wěn)定性[30].該納米顆粒不僅具有較高的載藥量，還有TPP提供的良好的線粒體靶向性，LND和Dox協(xié)同抗癌作用.該納米顆粒與Dox耐藥的MCF-7/ADR細胞孵育48h之后，細胞存活率低至22.3%，而不具線粒體靶向功能的Dox納米顆粒以及TPP-LND納米顆粒相同條件下細胞存活率分別為60.2%和47.6%.在BALB/c裸鼠上構(gòu)建的MCF-7/ADR腫瘤模型中，兩周后相對于PBS緩沖液對照組(腫瘤體積增大9.11 ± 0.56倍)，TPP-LND-Dox納米顆粒組腫瘤體積增加僅增加2.17 ± 0.23倍，低于Dox納米顆粒(6.92 ± 0.36倍)和TPP-LND納米顆粒(5.34 ± 0.41倍).

Liu H N等將Dox-TPP和透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, HA)以可裂解的腙鍵(Hydrazone bond)綴合，制成了HA-hydra-Dox-TPP多聚物.[31]該多聚物自組裝形成納米顆粒，親水端HA為殼，疏水端TPP為核；其中pH敏感的腙鍵在腫瘤組織微酸性環(huán)境下會裂解，從而實現(xiàn)腫瘤內(nèi)藥物釋放.透明質(zhì)酸在該納米顆粒上作為靶向腫瘤細胞的靶頭.腙鍵在細胞內(nèi)溶酶體中被完全水解，從而釋放出線粒體靶向分子Dox-TPP.該納米顆粒具有良好的生物相容性和腫瘤靶向能力，并顯示出對MCF7/ADR細胞更高的細胞毒性(86 μM濃度時細胞存活率約為游離Dox對照組的一半).而體內(nèi)研究表明，裸鼠上的MCF-7/ADR腫瘤給藥18 d后體積增長2.15倍，低于給游離Dox的對照組(腫瘤體積增長3.62倍)，且游離Dox對照組裸鼠出現(xiàn)嚴重心、肝損傷，而給納米顆粒組裸鼠的則未出現(xiàn).這說明通過該納米顆粒靶向遞釋Dox比游離Dox對耐藥腫瘤具有更高的安全性和抗腫瘤功效.

Tan及其團隊將(4-羧基丁基)三苯基溴化鏻( (4-Carboxybutyl) triphenylphosphonium bromide, CTPP)與糖脂樣綴合物(Glucolipid-like conjugates, CSOSA)經(jīng)NH2-PEG2000-NH2綴合，將所得綴合物裝載疏水弱酸性藥物雷公藤紅素 (Celastrol, Cela)制成平均尺寸為63.5 ± 18.0 nm的CTPP-CSOSA/Cela膠束[32].疏水弱酸性的雷公藤紅素在線粒體內(nèi)弱堿性環(huán)境中溶解度加大，導致雷公藤紅素與膠束疏水核心之間的相互作用減弱，以此實現(xiàn)線粒體內(nèi)堿性pH響應的藥物釋放，減少細胞質(zhì)和溶酶體中的藥物滲漏.相對游離雷公藤紅素，該膠束具有相對更好的腫瘤靶向性，更高的抗腫瘤效力和相對較低的全身毒性.

Han K及其團隊將光敏劑原卟啉IX(Protoporphyrin IX, PpIX)與聚乙二醇-促凋亡肽(KLAKLAK)2相綴合，獲得平均尺寸91 nm的自組裝的納米膠束[33].在短時間光照射下，光敏劑的光化學內(nèi)化(Photochemical Internalization, PCI)效應使該納米膠束能獲得更理想的細胞遞送，而促凋亡肽(KLAKLAK)2可啟動腫瘤細胞凋亡過程并提供線粒體靶向能力.該納米膠束可作為線粒體靶向的光動力劑，在長時間光照下原卟啉IX與促凋亡肽協(xié)同作用誘導ROS的產(chǎn)生，介導細胞色素C的釋放和細胞凋亡.因此采用短時加長時照射的雙階段光照策略進行光動力治療，荷瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量下降比例約為游離PpIX的3倍，(KLAKLAK)2的2倍.

2.2 DQAsomes和DQA-脂質(zhì)體

DQA具有兩親性，其在水性介質(zhì)中聚集而成的直徑70至700 nm的囊泡狀聚集體被稱作DQAsomes.DQAsomes被廣泛運用作載體向線粒體遞送DNA和細胞毒性藥物.DQA作為線粒體靶向配體，因其破壞線粒體膜電位、誘導ROS產(chǎn)生和抑制ATP合成的活性而具有對癌細胞有一定選擇性的細胞毒性[34].但由于DQAsomes的內(nèi)體逃逸能力和轉(zhuǎn)染效率較低，其在轉(zhuǎn)染和線粒體靶向遞釋藥物方面的潛力受到限制[35].但隨著研究的進一步發(fā)展，更多性能優(yōu)秀的基于DQA-脂質(zhì)體的線粒體靶向載體被發(fā)現(xiàn).

Bae及其團隊利用1,2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP)、1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phoshphoethanolamine, DOPE)和DQA按10:10:80的比例制備了一種DQA80s脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體具有作為線粒體靶向載體和線粒體靶向抗癌藥物的雙重潛力[35]. DQA80s具有出比DQAsomes更大的細胞毒性；與DQAsomes相比，DQA80s的細胞攝取顯著增加，并且具有更好的溶酶體逃逸能力.與載體DQAsome相比，DQA80s在HeLa細胞和真皮成纖維細胞中顯示了更高的轉(zhuǎn)染效率.

Yu 等人將抗癌藥物托泊替康鹽酸鹽裝載到由聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS1000)和DQA制成的脂質(zhì)體中[36].作為P-gp抑制劑，TPGS1000可抑制耐藥癌細胞中P-gp轉(zhuǎn)運蛋白的表達.裝載托泊替康的脂質(zhì)體在MCF7和MCF7/ADR細胞中的細胞毒性相對游離托泊替康分別高出2倍和4倍.通過共聚焦激光掃描顯微圖像發(fā)現(xiàn)該脂質(zhì)體能將熒光探針香豆素-6靶向遞送到線粒體，該組在線粒體中的熒光信號強度比對照組(游離香豆素-6和用非靶向脂質(zhì)體遞送香豆素-6)分別提高至21.2倍和12.9倍.通過Cy7進行熒光標記的脂質(zhì)體在MCF7/ADR荷瘤小鼠的腫瘤區(qū)域有最強的熒光信號，說明該脂質(zhì)體具有良好的腫瘤靶向性；體外細胞毒篩選結(jié)果顯示，靶向線粒體的托泊替康脂質(zhì)體對MCF-7和MCF-7/ADR細胞都具有最強的殺傷性.應用游離拓撲替康、負載拓撲替康脂質(zhì)體和線粒體靶向負載拓撲替康脂質(zhì)體后，MCF-7細胞的誘導凋亡百分比分別為19.7%、15.8%和33.5%;MCF-7/ADR細胞分別為10.4%、13.6%和24.0%.體內(nèi)抗腫瘤研究中，相對游離拓撲替康、負載拓撲替康脂質(zhì)體，線粒體靶向負載拓撲替康脂質(zhì)體表現(xiàn)出最好的抑制腫瘤生長的效果.與之類似的，Zhou等將抗癌藥物紫杉醇裝載在TPGS1000和DQA制成的脂質(zhì)體中，與游離紫杉醇和常規(guī)紫杉醇脂質(zhì)體相比，該靶向紫杉醇脂質(zhì)體在體外和抗藥性A549/cDDP異種移植腫瘤模型均表現(xiàn)出最強的抗癌功效[37].

Wang及其團隊利用地喹氯銨-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DQA-PEG2000-DSPE)制成的線粒體靶向脂質(zhì)體裝載白藜蘆醇，以期改善白藜蘆醇水溶性低、穩(wěn)定性差等缺點[38].裝載了白藜蘆醇的線粒體靶向白藜蘆醇脂質(zhì)體粒度約為70 nm，具有較高的包封效率(>95%).該脂質(zhì)體能靶向性積累于線粒體，A549細胞中線粒體內(nèi)積累量約提高至約2.65倍，A549/cDDP細胞中線粒體內(nèi)提高至約4.7倍；相對于游離白藜蘆醇，該線粒體靶向白藜蘆醇脂質(zhì)體誘導A549細胞凋亡率提高至2.84倍(72.63 ± 0.59% / 25.59 ± 6.28%)，誘導A549/cDDP細胞凋亡率提高至1.46倍(38.14 ± 0.74% / 26.17 ± 0.29%).

2.3 無機納米粒子載體

許多研究報道了用于藥物遞送，成像和治療目的的無機納米粒子載體，這些無機納米粒子載體相對有機納米粒子載體而言具有生物相容性好、穩(wěn)定性好、毒性低、親水性佳等優(yōu)勢[39].近期開發(fā)的用于抗癌治療的線粒體靶向無機納米載體包括氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)、碳量子點(Carbon quantum dot, CQDs)、脂質(zhì)膜包被的二氧化硅-碳雜合納米顆粒(Lipid membrane-coated silica-carbon, LSC)等等.下面將對一些實例進行分類討論.

2.3.1 氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)具有穩(wěn)定性高、比表面積較大、尺寸適中的良好特性，且能通過π-π堆積和疏水相互作用與藥物進行結(jié)合.經(jīng)過生物相容涂層修飾的氧化石墨烯具有良好的生物相容性[40].Zhang及其團隊制備了甘草次酸(Glycyrrhetinic acid, GA)官能化的氧化石墨烯(GA-GO)納米載體[41].甘草次酸本身在幾種癌癥中具有抗腫瘤活性，且同時具有腫瘤和線粒體雙重靶向功能，因此該作者選擇GA作為腫瘤靶向配體和線粒體靶向配體.負載Dox的GA-GO在HepG2細胞中具有比游離Dox高兩倍的細胞毒性.生物分布研究發(fā)現(xiàn)其在荷瘤小鼠的肝臟中亦有較多累積，但血液化學篩選試驗發(fā)現(xiàn)在開始治療后21 d，負載Dox的該納米微粒沒有引起明顯的肝臟或全身毒性.

Wei及其團隊制備了αvβ3單克隆抗體-氧化石墨烯-焦脫鎂葉綠酸-a復合物，該復合物能有效靶向αvβ3陽性腫瘤細胞，通過光敏劑焦脫鎂葉綠酸-a產(chǎn)生光毒性，并通過線粒體膜電位和極化GO之間的電子反應靶向線粒體[42].該復合物具有基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)的光毒性開/關(guān)切換功能.在血液與細胞質(zhì)等水性環(huán)境中光毒性關(guān)閉，在靶向線粒體、位于脂質(zhì)膜系統(tǒng)中時光毒性開啟，以減少副作用，增大藥物負荷.細胞毒性檢測顯示，GO-光敏劑復合物具有最小的暗毒性；在αvβ3陰性的MCF-7細胞中，相對游離焦脫鎂葉綠酸-a，該復合物的光毒性減小，這可能是因為分子尺寸的增大降低了納米藥物的內(nèi)吞作用；但在αvβ3陽性的U87-MG細胞中，該復合物在光照條件下對細胞的抑制作用達到游離焦脫鎂葉綠酸-a的7倍左右，這可以歸因于藥物裝載和轉(zhuǎn)運效率的提高和αvβ3單克隆抗體與GO提供的αvβ3陽性腫瘤細胞/線粒體靶向作用.

2.3.2 碳量子點(Carbon quantum dot, CQDs) 因為具有強大而穩(wěn)定的熒光和極低的細胞毒性，碳量子點已在生物成像，生物標記和生物傳感等領(lǐng)域被用作熒光探針[43]. Ye及其團隊用CQD和TPGS-TPP制備納米膠束，將其用于線粒體靶向遞送Dox[44].與游離Dox相比，裝載Dox的CQD納米膠束在耐藥性MCF7細胞中具有低五倍的IC50值.

2.3.3 脂質(zhì)膜包被的二氧化硅-碳雜合納米顆粒(Lipid membrane-coated silica-carbon, LSC)Wang及其團隊合成了直徑約45 nm的脂膜包被的二氧化硅-碳雜合納米顆粒(Lipid membrane-coated silica-carbon, LSC)[45].線粒體外表面存在將丙酮酸主動轉(zhuǎn)運到線粒體中的單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白(Monocarboxylate transporters, MCTs)，而葡萄糖水熱法合成的膠體碳球納米顆粒(colloidal carbon sphere, CCS)表面有與丙酮酸結(jié)構(gòu)相似的丙酮醛基團，因此CCS能特異性靶向線粒體.以原硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)進行處理以縮小納米顆粒的尺寸，再用3-氨丙基三甲氧基硅烷 ((3-Aminopropyl) trimethoxysilane, APTMS)處理其表面以吸收二棕櫚酰磷脂酰膽堿(phospholipid dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)形成脂質(zhì)包被，以提升其生物相容性.最終得到了穩(wěn)定的LSC納米顆粒.裝載Dox的該納米顆粒線粒體靶向能力良好，且對多藥耐藥細胞具有理想的光毒性.在游離Dox和未裝載Dox的LSC納米顆粒幾乎不能對NCI/RES-ADR多藥耐藥癌細胞造成抑制的情況下，在近紅外光照射下裝載Dox的LSC納米顆粒使NCI/RES-ADR多藥耐藥癌細胞幾乎全部死亡.其機制為LSC納米顆粒靶向積累在線粒體中，并在NIR照射下產(chǎn)生ROS，氧化NADH、抑制ATP的產(chǎn)生.經(jīng)LSC 和近紅外光照治療后NCI/RES-ADR多藥耐藥癌細胞的P-gp轉(zhuǎn)運蛋白表達降低，失去其耐多藥能力至少5 d.

2.4 用納米顆粒負載線粒體靶向藥物

前文已經(jīng)提到，線粒體靶向配體-藥物綴合物通常具有水溶性差和具細胞毒性等缺點，因此它們難以被應用于臨床研究.一種解決方案是利用納米載體遞釋系統(tǒng)將其遞送到腫瘤部位，隨后將其釋放，藥物利用其綴合的線粒體靶向配體到達線粒體.下面簡要介紹一些基于這種思路的研究實例.

Battogtokh G及其團隊將抗癌藥物多西紫杉醇(Docetaxel, DTX)與4-羧基丁基三苯基膦綴合以增強其線粒體靶向能力，再將TPP-DTX綴合物加載到葉酸-膽固醇基白蛋白(FA-chol-BSA)納米顆粒中以改善其生物相容性.[46]體外研究表明該納米顆粒具有良好的線粒體靶向性，經(jīng)該納米顆粒孵育60 min的MCF-7細胞的線粒體TPP-DTX的濃度是經(jīng)游離DTX處理的細胞線粒體中DTX濃度的5.3倍.產(chǎn)生ROS介導細胞凋亡，孵育12 h后該納米顆粒對B16F10細胞展現(xiàn)出較游離DTX高3.9倍的細胞毒性.該納米顆粒對MCF-7細胞荷瘤小鼠的腫瘤生長產(chǎn)生抑制效果，給藥21天后，荷瘤小鼠腫瘤體積是游離DTX處理組的大約二分之一.且該納米顆粒的治療指數(shù)為69.5%，顯著高于游離DTX(24%)和游離TPP-DTX(45.5%).這說明該納米顆粒提高了抗癌藥物的安全性.

上述團隊亦將線粒體靶向光敏劑三苯基膦脫鎂葉綠酸a(Triphenylphosphonium-pheophorbide-a, TPP-PhA)加載到葉酸-膽固醇-牛血清白蛋白(Folate-cholesteryl-albumin, FA-chol-BSA)納米顆粒中(表示為TPP-PheoA@FA-chol-BSA 納米顆粒)，以增強TPP-PhA綴合物的水溶性和生物相容性[47].該載藥納米顆粒主要在線粒體中積累，較游離PhA和裝載PhA的FA-chol-BSA納米顆粒(表示為PheoA@FA-chol-BSA納米顆粒)光毒性均增強.體內(nèi)研究表明其腫瘤靶向性良好，對腫瘤生長的抑制作用高于游離PhA和PheoA@FA-chol-BSA納米顆粒.且TPP-PheoA@FA-chol-BSA 納米顆粒具有最高的治療指數(shù)(82.9%)，高于游離脫鎂葉綠酸a(30%)和PhA@FA-chol-BSA納米顆粒(45%).

Song及其團隊開發(fā)了一種pH敏感性膠束[13].將1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dimethylaminopyridine, DSPE)用腙鍵與聚乙二醇相連，該腙鍵在較低pH下斷裂，因此膠束能夠在溶酶體和內(nèi)體中解體，從而使藥物在短時間內(nèi)大量釋放，這將有助于克服P-gp轉(zhuǎn)運蛋白介導的癌細胞多藥耐藥性.在該DSPE-hyd-PEG綴合物上附著茴香酰胺(anisamide, AA)以提高對癌細胞的靶向性，最終制成DSPE-hyd-PEG-AA膠束.Dox和DQA-Dox被裝載在該膠束中.細胞攝取和亞細胞分布研究表明該膠束可將Dox和DQA-Dox分別傳遞至細胞核和線粒體.體外細胞毒性實驗中，相同劑量下該載藥膠束對MDA-MB-231/ADR細胞(對Dox耐藥)顯示出比游離Dox高近10倍的細胞毒性.在Dox抗性腫瘤模型中，裝載有Dox的膠束具有比游離Dox更強的抗腫瘤活性，相同劑量處理22 d，腫瘤體積比游離Dox處理小大約7倍.相比游離Dox，該膠束亦對正常器官具有更小的毒性.

3 結(jié)論

迄今為止，已經(jīng)有很多抗癌藥物線粒體靶向遞送的相關(guān)研究.早期有許多研究基于線粒體靶向配體和抗癌藥物直接綴合的思路，合成了一系列線粒體靶向抗癌藥物綴合物.這些綴合物表現(xiàn)出比游離抗癌藥物更高的抗癌能力，但它們亦存在水溶性差、具有細胞毒性等缺陷.而使用線粒體靶向納米載體具有相對游離藥物更高的抗癌效果、更好的生物相容性、更長的血液循環(huán)時間和在指定靶位裂解釋藥等等優(yōu)點.一種新的思路即用納米載體遞釋系統(tǒng)裝載線粒體靶向抗癌藥物綴合物，這亦一定程度上克服后者的缺陷.無論是綴合物還是納米載體都在解決腫瘤耐藥性方面有一定成果.未來納米載體遞釋系統(tǒng)可能會成為線粒體靶向抗癌藥物遞送研究的重要方向，期待未來更多性能優(yōu)越且具有巨大臨床應用潛力的線粒體靶向納米載體研究涌現(xiàn).