一例雛雞腸炎沙門氏菌的分離培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)

□趙姍姍 王雨蒙 李潔 夏穎 薛曉陽(yáng)（華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北省蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院）

某養(yǎng)殖戶送檢1 日齡雛雞10只，臨床癥狀：糊肛，大肚子。 通過(guò)剖檢，臨床癥狀觀察，采取肝臟、卵黃、盲腸等組織病料，使用BPW 緩沖蛋白胨水對(duì)病料進(jìn)行增菌培養(yǎng)； 顯色培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)； 進(jìn)行了沙門氏菌生化試劑盒：三糖鐵、靛基質(zhì)、尿素酶、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶等生化試驗(yàn)；血清分型；結(jié)合臨床癥狀、病理變化、實(shí)驗(yàn)室診斷為腸炎沙門氏菌，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)， 該分離株對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星敏感，對(duì)青霉素、頭孢噻吩無(wú)效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

河北某養(yǎng)殖戶送檢1 日齡雛雞10 只，病料取肝臟、卵黃、盲腸，進(jìn)行分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

緩沖蛋白胨水（BPW）：（蛋白胨10 克、 氯化鈉5 克、 磷酸氫二鈉9克、磷酸二氫鉀1.5 克）；

四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(chǔ)（TTB）：（蛋白胨9 克、 牛肉粉4.5克、氯化鈉2.7 克、碳酸鈣40.5 克、牛膽鹽5 克、硫代硫酸鈉（含5 個(gè)結(jié)晶水）50 克）；

沙門氏菌顯色培養(yǎng)基：(氨基酸對(duì)照、賴氨酸、氰化鉀對(duì)照、氰化鉀、靛基質(zhì)、尿素酶、甘露醇、山梨醇、ONP 克)；

三糖鐵瓊脂（TSI）：(白胨20 克、葡萄糖1 克、肉粉5 克、酚紅0.025克、硫酸亞鐵銨0.2 克、瓊脂12 克、氯化鈉5 克、庶糖10 克、硫代硫酸鈉0.2 克、乳糖10 克)；

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar）：（蛋白胨10 克、 牛肉浸膏3 克、 氯化鈉5克、瓊脂15 克）；

沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒：（三糖鐵、靛基質(zhì)、尿素酶、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、 甘露醇、 山梨醇、ONPG）；

沙門氏菌屬診斷血清，O 多價(jià)A-F 群 血 清、O 因 子 血 清(O4、O9、O12)、H 因子血清（H：克、H：m、H：i、H：2）；

0.5%半固體瓊脂：200 毫升（NaCl 2 克, 胰蛋白胨2 克, 酵母浸粉1 克， 瓊脂粉1 克, 蒸餾水200毫升）；

Mueller-Hinton 瓊脂 （Mueller-Hinton Agar）：牛肉粉6 克、可溶性淀粉1.5 克、酸水解酪蛋白17.5 克、瓊脂17 克)。

1.1.3 快速染色液

龍膽紫液、碘溶液、脫色液、沙黃溶液。

1.1.4 藥敏試紙

阿米卡星、慶大霉素、青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢曲松。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品剖檢

剖檢樣品，觀察臨床癥狀，根據(jù)其病理變化做出初步診斷。

1.2.2 分離培養(yǎng)

在超凈臺(tái)中無(wú)菌操作， 采取卵黃、肝臟、盲腸，進(jìn)行bpw 緩沖蛋白胨培養(yǎng)基預(yù)增菌，37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)， 使細(xì)菌恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。

24 小時(shí)后對(duì)預(yù)增菌樣品， 進(jìn)行選擇性增菌培養(yǎng)， 在阻止其他大多數(shù)細(xì)菌增殖的同時(shí)， 使預(yù)增菌樣品中沙門氏菌繼續(xù)增殖。 在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作， 使用10 毫升無(wú)菌離心管，按1∶9 添加，抽取0.5 毫升樣品加入到4.5 毫升TTB 中， 恒溫箱42℃培養(yǎng)18～24 小時(shí)。

1.2.3 鑒別培養(yǎng)

將選擇性增菌TTB 菌液接種到沙門氏菌顯色培養(yǎng)基 （科瑪嘉），沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上， 沙門氏菌菌落顏色為淡紫色。 用接種環(huán)蘸取TTB 菌液劃線接種于顯色培養(yǎng)基。于37℃±1℃培養(yǎng)18～24 小時(shí)， 觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。 恒溫箱培養(yǎng)18～24 小時(shí)。

1.2.4 純化菌落

若顯色培養(yǎng)基特征性變化符合沙門氏菌， 則對(duì)疑似沙門氏菌進(jìn)行劃線法純化，得到單個(gè)菌落，于37℃±1℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 小時(shí)。

1.2.5 生化反應(yīng)鑒定

將純化的菌落， 接種于三糖鐵瓊脂， 先在斜面劃線， 再于底層穿刺。 同時(shí)接種于生化試劑盒，恒溫箱內(nèi)36℃±1℃培養(yǎng)18～24 小時(shí)后觀察結(jié)果。

1.2.6 血清型鑒定

依次進(jìn)行自凝性檢查、O 抗原鑒定和H 抗原鑒定。

先進(jìn)行O 抗原A-F 多價(jià)血清鑒定，A-F 多價(jià)血清凝集，進(jìn)行O：9、O：12 因子血清鑒定。

O：9、O：12 因 子 血 清 均 出 現(xiàn) 凝集。 進(jìn)行下一步細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)H 抗原鑒定，

1.2.7 細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)

做H 抗原鑒定之前， 須先將菌株接種在0.55%～0.65%半固體瓊脂平板的中央，于36℃±1℃，靜置培養(yǎng)12 小時(shí)，待菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，在蔓延生長(zhǎng)的邊緣部分取菌檢查。 則進(jìn)行H：g 因子血清和H：m 因子血清鑒定，如H：g 和H：m 因 子 血 清 均 產(chǎn) 生 凝集，判定為腸炎沙門氏菌。

1.2.8 藥敏試驗(yàn)

對(duì)分離到的腸炎沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物， 方法參照李強(qiáng)關(guān)于沙門氏菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)的方法， 將分離出的細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基， 于37℃±1℃培養(yǎng)18～24 小時(shí)，肉湯培養(yǎng)物變渾濁，取菌液1 毫升覆蓋在MH 培養(yǎng)皿表面，使用涂布棒涂布均勻，將藥敏片貼于培養(yǎng)基上， 于37℃±1℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 小時(shí)，觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈大小。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)： 測(cè)量藥敏片抑菌直徑大小，觀察抑菌圈清晰度，直徑小于10 毫米判斷該藥物低度敏感，10～15 毫米為中度敏感，15～25毫米為高度敏感，25 毫米以上為極度敏感。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 病理變化

剖檢：無(wú)明顯病理變化。 臨床癥狀：可見雛雞糊肛、下痢、大肚子。

2.2 菌株形態(tài)

通過(guò)鏡檢， 發(fā)現(xiàn)兩端鈍圓，短小，革蘭氏陰性桿菌，無(wú)莢膜、無(wú)芽孢。

2.3 菌株培養(yǎng)特性

顯色培養(yǎng)基，菌落為針尖狀，淡紫色；三塘鐵培養(yǎng)基斜面為黃色，底層為黑色；

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，灰白色，呈圓形，稍隆起，光滑邊緣整齊。

表1 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 生化特性

生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.5 血清分型

依次進(jìn)行自凝性檢查、O 抗原鑒定和H 抗原鑒定。

菌株未出現(xiàn)自凝，O 抗原A-F多價(jià)血清凝集，進(jìn)行O：9、O：12 因子血清鑒定；均出現(xiàn)凝集。

2.6 細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)

觀察菌株在半固體瓊脂上蔓延生長(zhǎng)， 挑取蔓延部分進(jìn)行H 抗原進(jìn)行H：g 因子血清和H：m 因子血清鑒定，鑒定結(jié)果均產(chǎn)生凝集，判定為腸炎沙門氏菌。

2.7 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

3 討論

合理應(yīng)用抗菌藥， 控制畜禽疾病的一項(xiàng)重要內(nèi)容就是通過(guò)藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)臨床用藥， 以充分發(fā)揮抗菌藥療效，并盡可能減少其不良影響，不同地區(qū)，不同血清型的菌株對(duì)抗生素藥物的敏感性不同，建議使用藥物預(yù)防時(shí)，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

腸炎沙門氏菌， 屬于無(wú)宿主特異性而有侵害性的病原菌之一，宿主包括人和各種動(dòng)物。 該菌不僅能引起家禽發(fā)病死亡造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失， 而且被污染的家禽產(chǎn)品作為腸炎沙門氏菌的攜帶者， 還嚴(yán)重危害人類健康。

對(duì)于病原菌易產(chǎn)生耐藥性，通過(guò)耐藥數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，選出敏感藥物后再進(jìn)行有效治療，除了使用抗菌藥物以外，還可以考慮有效的生物安全措施， 最根本的方法檢疫淘汰帶菌雞，建立無(wú)菌雞群，消滅傳染源。

4 結(jié)論

4.1 根據(jù)臨床癥狀、 病例剖檢、病料的實(shí)驗(yàn)室診斷， 確診該雛雞攜帶腸炎沙門氏菌。 實(shí)際生產(chǎn)中多關(guān)注大肚子、糊肛此類雛雞，此類雛雞易增加患病風(fēng)險(xiǎn)。 建議及時(shí)淘汰，不進(jìn)行飼養(yǎng)。

4.2 鑒定過(guò)程中，如果實(shí)驗(yàn)室沒有PCR 的方法，可通過(guò)生化試劑的方法確定沙門氏菌， 使用血清O 抗原、H 抗原來(lái)確定沙門氏菌血清型。臨床上雞白痢、禽傷寒、腸炎同屬于D 群血清群，雞白痢、禽傷寒、無(wú)鞭毛，腸炎沙門氏菌有鞭毛，可通過(guò)細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)，H 抗原來(lái)判斷區(qū)分。

4.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果：環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星等藥物敏感，青霉素、頭孢噻吩不敏感。