黑龍江地區(qū)芍藥紅斑病病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選1)

陳悅 翟亞娟 劉麗玲 馮玉娟 孫于淼白慶榮

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118) (遼源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院) (長春海關(guān)技術(shù)中心) (黑河市愛輝區(qū)氣象局) (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))

芍藥(PaeonialactifloraPall.)屬毛茛目、毛茛科芍藥屬多年生草本植物，花朵艷麗，被人們譽為“花仙”和“花相”，且被列為“十大名花”之一，又被稱為“五月花神”，其根部又是常用的藥材。芍藥的觀賞價值與藥用價值一直以來都備受關(guān)注[1]。近幾年來，在東北各地區(qū)發(fā)展藥用植物種植產(chǎn)業(yè)力度不斷增大，尤其是藥用芍藥的種植面積也在不斷擴大，但在其引種栽培、廣泛種植及中藥材的貯存運輸過程中，往往遭受到各種病害的危害，嚴(yán)重影響藥材品質(zhì)。2017年，黑龍江芍藥主產(chǎn)區(qū)大范圍發(fā)生芍藥紅斑病害，發(fā)病地區(qū)達98%，已成為威脅芍藥栽培的主要病害。目前迫切需要對芍藥紅斑病的病原進行鑒定，并進行室內(nèi)藥劑篩選，為該病害診斷和防治提供依據(jù)和資料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芍藥紅斑病標(biāo)本采自黑龍江省哈爾濱、大慶、齊齊哈爾和黑河市。

1.2 方法

芍藥紅斑病癥狀描述：觀察各地區(qū)芍藥紅斑病的典型癥狀，記錄發(fā)病特點，并拍照保存。

病原菌的分離：將采集的病葉用清水沖洗干凈，剪取病健交界處的病害組織若干塊，大小為0.3 cm×0.3 cm，先放到體積分?jǐn)?shù)70%酒精中消毒1 min，再放到體積分?jǐn)?shù)0.1%氯化汞中消毒0.5 min，之后再用無菌水反復(fù)沖洗3次，待組織塊吹干，放置于PDA平板培養(yǎng)基上，每皿放4塊，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃培養(yǎng)[2]。

致病性測定：將病原菌在PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)10～14 d，待病原菌產(chǎn)生分生孢子后，將其用無菌水洗下，配置成濃度為106個·mL-1的孢子懸液。用滅菌的噴霧器將配置好的孢子懸液噴灑到已消毒的健康植株葉片上，對照植株上噴無菌水，每個處理重復(fù)3次，套上透明塑料袋保濕培養(yǎng)3 d后，逐日觀察發(fā)病情況[3]。發(fā)病后對植株病組織再進行分離，比較與其最初分離到的病原菌是否一致。

病原菌鑒定：將純化的菌株移至PDA平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察病原菌的生長狀況和菌落形態(tài)，并用顯微鏡來觀察孢子形態(tài)，測量孢子大小，拍照并記錄。用CTAB法[4-5]提取菌株DNA。以ITS4/ITS5(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′/5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)為引物進行PCR擴增[6]，擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序所得的rDNA-ITS序列遞交GenBank，并與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的ITS區(qū)相關(guān)序列進行同源性比較。

室內(nèi)藥劑篩選：供試菌株M-1，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理實驗室分離鑒定并保存。試驗選用化學(xué)農(nóng)藥共計11種，分別為體積分?jǐn)?shù)25%吡唑醚菌酯EC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%醚菌酯WG(巴斯夫(中國)有限公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞胺唑WP(北興化學(xué)工業(yè)株式會社)；250 g·mL-1苯醚甲環(huán)唑EC、250 g·L-1嘧菌酯SC(先正達作物保護有限公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%多菌靈WP(江蘇藍豐生物化工股份有限公司)；體積分?jǐn)?shù)40%氟硅唑EC(廣東中訊農(nóng)科股份有限公司)；體積分?jǐn)?shù)45%咪鮮胺ME(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%代森錳鋅WP(利民化工股份有限公司)；430 g·L-1戊唑醇SC(拜耳作物科學(xué)有限公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%腈菌唑WP(運城綠康實業(yè)有限公司)。

試驗采用孢子萌發(fā)法分別比較病原菌孢子對不同質(zhì)量濃度的不同種類藥劑的敏感性。將9 mL定量WA培養(yǎng)基置于三角瓶中，滅菌。將不同藥劑配制成1×104mg·L-1的原液依次梯度稀釋成1×103、1×102、1×10、1.0、1×10-1mg·L-1。用移液槍分別吸取各濃度藥劑1.0 mL，分別打入三角瓶中，混勻后倒入平板。各個藥劑處理重復(fù)3次。以等量的無菌水代替藥劑作為空白對照。取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的病原菌，用無菌水配置成孢子懸液(106個·mL-1)，吸取0.1 mL于平板上，用玻璃三角涂布器涂抹均勻。置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，18 h后進行觀察。以芽管長度超過孢子最大直徑長度的一半作為該孢子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)[7]。當(dāng)對照平板上孢子萌發(fā)率達到90%以上時，將所有平板放置4 ℃冷藏，終止平板內(nèi)孢子的萌發(fā)，之后對該藥劑不同質(zhì)量濃度下的孢子萌發(fā)率進行統(tǒng)計，計算孢子萌發(fā)抑制率[8-9]。

孢子萌發(fā)抑制率=((對照孢子萌發(fā)數(shù)-處理孢子萌發(fā)數(shù))/對照孢子萌發(fā)數(shù))×100%[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥紅斑病的癥狀

發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)紫紅色小斑點(圖1A)，后擴展成不規(guī)則大斑，病斑不受葉脈限制，可連片生長，葉正面為暗紫紅色，葉背面為褐色，后期病斑中間成焦枯狀，多數(shù)可見輪紋，嚴(yán)重時整個葉片焦枯死亡。雨后空氣潮濕，葉背面會產(chǎn)生墨綠色霉層，即為病原菌的分生孢子梗和分生孢子。病原菌也可侵染莖稈(圖1B)，初期產(chǎn)生紅色不規(guī)則小斑點，后期擴展可連片，病斑處輕微凹陷。

圖1 芍藥紅斑病的發(fā)病癥狀

2.2 標(biāo)本來源及病原菌的分離

對2017年采自黑龍江地區(qū)的芍藥紅斑病標(biāo)本進行分離培養(yǎng)，得到6個地區(qū)117個真菌菌落，其中雜菌菌落為16個，疑似病原菌菌落為101個，詳見表1。

表1 芍藥紅斑病病原菌分離結(jié)果

2.3 芍藥紅斑病的致病性

對代表菌株M-1、TF-1、CS-1、QY-1、LD-1、SW-1的致病性觀察結(jié)果(圖2)表明：接種10 d后，植物發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相同，對照組健康無發(fā)病癥狀。對發(fā)病部位進行病菌的再分離，得到的病原菌與田間發(fā)病葉片上分離得到的病原菌一致。根據(jù)柯赫氏法則可證明該病原菌為芍藥紅斑病的致病菌。

2.4 芍藥紅斑病病原菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特性

將純化菌株置于PDA平板培養(yǎng)基中央，在25 ℃條件下培養(yǎng)。3 d后，菌絲開始生長，逐漸形成墨綠色毛氈狀菌落，菌落顏色隨生長而不斷加深，菌落生長速度緩慢，10 d菌落直徑僅達20.0 mm(圖3A、B)。顯微鏡下觀察，分生孢子梗無色至淺褐色，具1～6個分隔，(3.4～5.9)μm×(89.2～165.8)μm，平均為4.3 μm×131.4 μm；分生孢子鏈生，大小差異較大，圓柱形、卵圓形或檸檬形，淺褐色，表面光滑，(3.2～6.2)μm×(5.3～13.4)μm，平均為4.6 μm×8.8 μm(圖3C-E)。

A、B.菌落在PDA上的培養(yǎng)特征(A.正面；B.背面)；C、D.分生孢子鏈；E.分生孢子。

2.4.2 rDNA-ITS序列

利用真菌特異性引物ITS4/ITS5對代表菌株進行PCR擴增。擴增出1條約600 bp的片段。經(jīng)生物公司測序結(jié)果為628 bp的核苷酸序列，GenBank提交后的登錄號為MH119050。將測序結(jié)果與GenBank中已有的相關(guān)序列進行同源性比對，結(jié)果表明，與登錄號EU009455的菌株Graphiopsischlorocephala同源性達100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特性[11]，鑒定芍藥紅斑病的病原菌為Dichocladosporiumchlorocephalum(有性態(tài)：Graphiopsischlorocephala)。

2.5 室內(nèi)藥劑篩選

由表2可知，所選的11種殺菌劑對病原菌的孢子萌發(fā)均有抑制作用。病原菌對體積分?jǐn)?shù)25%吡唑醚菌酯EC的敏感性最好，其EC50<0.1 mg·L-1；對質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%代森錳鋅WP的敏感性較好，0.1 mg·L-110 mg·L-1。

表2 芍藥紅斑病病原菌孢子萌發(fā)對11種殺菌劑的敏感性

3 結(jié)論與討論

本試驗對黑龍江地區(qū)芍藥紅斑病的癥狀進行了描述，對紅斑病病菌進行了分離、純化及致病性測定，再分離得到的結(jié)果進一步證實所獲得的分離物為該病害的致病菌。結(jié)合病原形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)學(xué)性狀以及rDNA-ITS序列分析測定結(jié)果，確定其致病菌為Dichocladosporiumchlorocephalum。

1983年藍瑩等對南京各公園芍藥紅斑病進行了調(diào)查，通過病原菌分離純化和接種試驗確定該病由CladosporiumpaeoniaePass.引起[12]。在2014年李麗等對山東菏澤與泰安兩地的芍藥紅斑病進行了病原鑒定試驗，最終確定山東的芍藥紅斑是由Alternariaalternata和A.tenuissima復(fù)合侵染所引起的[13]。這表明在不同地區(qū)、不同的氣候條件下某些病害的致病菌可能存在一定的差異。

Dichocladosporiumchlorocephalum菌絲生長速度緩慢，10 d菌落直徑僅有20.0 mm。采用菌絲生長速率法進行藥劑敏感性研究，費時費力且不科學(xué)，因此本試驗采用孢子萌發(fā)法對病原菌進行了藥劑敏感性測定。結(jié)果表明，該病原菌對體積分?jǐn)?shù)25%吡唑醚菌酯EC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%代森錳鋅WP、質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%醚菌酯WG、250 g·L-1嘧菌酯SC敏感性較高，EC50<10 mg·L-1。這為該病害的防治提供了一些備選殺菌劑，并為藥劑的輪換使用和延緩抗藥性奠定基礎(chǔ)。因未進行田間試驗，田間防效還有待進一步考證。