黃條金剛竹開花生物學特性及花粉萌發(fā)力1)

姚文靜 姜明云 王星 史無雙 丁雨龍 林樹燕

(南京林業(yè)大學,南京，210037)

植物開花是高等植物由營養(yǎng)生長轉向生殖生長的重要標志，決定了植物生殖發(fā)育的時期和質量，研究植物開花對于其生殖發(fā)育具有重要意義[1]。植物開花受光照、溫度、激素等外界環(huán)境因素和基因調控等內在遺傳因素的共同調節(jié)[2]。開花特性及花粉萌發(fā)是開花生物學中非常重要的研究內容，為結實性相關研究提供理論基礎[3]。竹類植物屬于禾本科植物，具有更長的幼年期和營養(yǎng)生長階段，營養(yǎng)生長周期可長達幾十年甚至上百年[4]。多數竹子是典型的多年生一次開花植物，開花后往往會出現(xiàn)大面積的死亡，甚至導致全林枯死，給竹子開花生物學研究帶來了極大困難[5]。因此，竹子從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉變過程，即竹子開花過程，更值得深入研究。

植物花粉生活力是指花粉具有存活、生長、萌發(fā)或發(fā)育的能力。花粉生活力由遺傳基礎決定，同時受各種外界環(huán)境的影響，包括溫度、相對濕度、貯藏介質、輻射、光照等[6]。竹類植物花粉萌發(fā)率普遍較低，且存在不同類型的敗育現(xiàn)象，竹花自然授粉不良[7]。自然條件下，竹子花粉容易因溫度過高和空氣干燥使花粉破裂皺縮失活，大大降低了竹子結實率[7]。因此，育種過程中人工輔助授粉成為提高竹子授粉率和種實產量的重要手段。然而人工授粉過程中，花粉的采集和儲存會使花粉生命力受到一定程度的影響，導致授粉成功率下降[5]。因而，花粉的形態(tài)及萌發(fā)特性成為竹子開花生物學中非常必要的研究內容。

黃條金剛竹(Sasaellakongosanensis‘Aureostriatus’)是東笆竹屬金剛竹的一個變異類型，具有較高的觀賞價值。2015年3月份南京林業(yè)大學黃條金剛竹出現(xiàn)開花現(xiàn)象，為其開花生物學特性研究提供了契機。文中對黃條金剛竹的開花類型、開花期、花序及花粉形態(tài)、花粉萌發(fā)力、開花林相等進行了系統(tǒng)詳細的研究，為了解其開花特性及引種栽培等提供了數據基礎。此外，本研究進一步豐富了竹類植物生殖生物學的理論研究，也為其他竹類植物開花相關研究提供參考依據。

1 研究地概況

試驗地點位于江蘇省南京林業(yè)大學(118°48′17″E，32°4′44″N)，土壤屬于下蜀系黃壤，氣候屬于亞熱帶季風氣候，四季分明，春秋短、冬夏長。雨量充沛，平均降水量為971.7 mm，全年積溫(10 ℃以上)為4 897 ℃，年平均氣溫為15.7 ℃，全年無霜期233 d。年溫差較大，7月份平均28 ℃，1月份平均2.2 ℃。

2 材料與方法

黃條金剛竹是東笆竹屬(Sasaella)金剛竹的一個變異類型，于1984年8月份由周芳純教授從日本富士竹類植物園引種到南京林業(yè)大學[8]。直至2015年還未有關于其開花結實的相關記載或報道。2015年3月份在南京林業(yè)大學竹種園開花。本研究用于花粉萌發(fā)力測定的材料采自開花黃條金剛竹盛花期成熟且未散粉的花藥。

2016年每月定點觀察，詳細記錄1年間黃條金剛竹開花林相的變化。

開花進程：小穗開花進程觀察，標記30個成熟小穗，記錄小穗中小花數量及小穗的開花進程。記錄內容包括已開放的小花數目、半開放的小花數目以及將要開放的小花數目，直到30個小穗全部觀察完畢。

花粉形態(tài)觀察：采成熟未散粉的花藥用70% FAA固定24 h。用蒸餾水將花粉FAA洗去，依次經過70%-90%-100%(兩次)的乙醇梯度脫水。在英國EMITECH公司K850臨界點干燥儀中干燥，將花粉粘臺，利用日本日立公司E1010離子濺射儀噴金，在美國FEI(菲達康)有限責任公司Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡鏡下進行拍照與觀察。

花粉活力測定：花粉活力測定采用I2-KI染色測定法?；ㄋ庪S采隨用。收集成熟未散粉的花藥置于載玻片上，加1滴蒸餾水，用鑷子將花藥充分搗碎，使花粉粒釋放，再加1～2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片，于低倍顯微鏡下觀察。活力強的花粉呈紫黑色或著深色，活力弱或無活力的花粉染色淺或不著色。將染色后花粉置于顯微鏡下進行觀察，統(tǒng)計顯微鏡各個視野中花粉?？倲岛透黝愋腿旧ǚ哿?，計算花粉活力。每次檢查10個視野，每視野花粉粒數大于25，重復3次。

最佳花粉萌發(fā)時間確定：最佳花粉萌發(fā)時間采用培養(yǎng)基發(fā)芽法[9]進行確定。于盛花期采取新鮮未散粉的花藥，用濕報紙包裹至實驗室。將花藥用解剖針和鑷子攪碎，置于簡單液體培養(yǎng)基中(150 g·L-1蔗糖+0.010 g·L-1硼酸)，于25 ℃環(huán)境中培養(yǎng)觀察。觀察時間由1 h到4 h，時間間隔為0.5 h，選出黃條金剛竹花粉萌發(fā)的最佳觀測時間。在不同觀察點，用吸管取一滴溶液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，利用顯微鏡進行統(tǒng)計。每次統(tǒng)計需10個視野，每次鏡檢的花粉總數不少于200個，設置3個重復，統(tǒng)計萌發(fā)花粉總數及花粉總數，計算萌發(fā)率?；ǚ勖劝l(fā)率=(總萌發(fā)花粉數/花粉總數)×100%。

花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基篩選：通過正交試驗法將不同質量濃度的蔗糖、硼酸和CaCl2·2H2O設置成16種組合，pH值5.8，以明確適宜黃條金剛竹花粉萌發(fā)不同質量濃度培養(yǎng)基組分的最佳組合。

3 結果與分析

3.1 開花林相

黃條金剛竹開花屬于成片開花類型。由于2015年3月份黃條金剛竹在南京林業(yè)大學校園內開花導致2016年1月份呈枯黃狀(圖1A)。2016年2月下旬黃條金剛竹新老植株頂端出現(xiàn)大量花芽(圖1B、C)。2016年3月中旬黃條金剛竹部分開花植株開始抽穗(圖1D、E)。4月上旬大量植株開花即盛花期(圖1F)，并且出現(xiàn)大量筍芽。5月下旬依然有少數植株開花(圖1G)。9月份黃條金剛竹基部有大量筍芽產生(圖1H)。10—11月份黃條金剛竹新生幼竹進行高生長。12月份部分開花植株衰老死亡(圖1I)。

3.2 小穗開花進程及小花開花動態(tài)

根據觀察，每一小穗交互排列著7～9朵小花，小穗開花為下始式，一般小穗的花由基部向頂部依次開放；單一小穗上自第一朵小花開放直至全部開放需要4～7 d。黃條金剛竹花序的開放是有次序的，不同花序上各部位小穗的開花進程為由底部到頂部。

于2016年4月份盛花期，對黃條金剛竹20朵小花進行觀察統(tǒng)計，得出黃條金剛竹小花從花藥微露至花藥全部開裂所需時間為7～9 h，從全部開裂到內外稃閉合需要2 h左右。以其中3朵小花開花進程為例，07:00花藥微露(圖2A)—09:05露出大半(圖2B)—11:20全部露出(圖2C)—11:59趨于下垂(圖2D)—12:30完全下垂(圖2E)—15:28花藥全部開裂—16:45內外稃閉合(圖2F)；11:30花藥微露—13:40露出大半—16:00全部露出—16:40趨于下垂—17:20完全下垂—19:35全部開裂—21:05內外稃閉合；09:00花藥微露—11:05露出大半—13:30全部露出—14:08趨于下垂—16:05完全下垂—17:50全部開裂—19:46內外稃閉合。

A.1月份黃條金剛竹竹林；B、C.2月份出現(xiàn)花芽；D.3月中旬抽穗；E.3月下旬部分植株開花；F.4月上旬盛花期；G.5月上旬盛花期后；H.9月份地下鞭上出現(xiàn)大量筍芽；I.12月部分開花植株衰老死亡。

圖1黃條金剛竹開花林相

A、B.內外稃片微微張開；C.花藥露出大半；D.花藥全部露出且微下垂；E.花藥完全下垂；F.內外稃閉合。

3.3 花粉特征

黃條金剛竹花粉外表呈近球形(圖3A)，具單個萌發(fā)孔(圖3B)，孔明顯，圓至橢圓形，萌發(fā)孔內凹，孔周圍具加厚不一的孔環(huán)(圖3C)?；ǚ哿Ｆ骄睆郊s(28.46±5)μm?；ǚ弁獗诩y飾為細顆粒狀。

A.花粉外在形態(tài)；B.單個萌發(fā)孔；C.孔環(huán)。

3.4 花粉活力

在普通光學顯微鏡下觀察30個視野，統(tǒng)計不同顏色的花粉，結果如下，共鏡檢花粉數為593粒，其中藍色花粉數量為456粒，即發(fā)育良好的花粉數為456，占總鏡檢數量的76.9%；發(fā)育不良的花粉數量為99粒，占總數的16.7%；無活力花粉為38粒，占總數的6.4%；發(fā)育不良以及無活力花粉共占總數的23.1%。

3.5 花粉萌發(fā)時間以及萌發(fā)最適培養(yǎng)基的確定

收集黃條金剛竹盛花期花粉置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間，分別觀測其花粉萌發(fā)率(圖4)。結果表明，隨著時間的延長，花粉萌發(fā)率逐步提高。培養(yǎng)2.5 h黃條金剛竹花粉萌發(fā)率高達38.5%(圖4B)，3 h趨于平穩(wěn)(圖4C)，之后不再隨著時間延長而提高。因此，觀察統(tǒng)計黃條金剛竹花粉萌發(fā)率的最佳時間為培養(yǎng)后2.5 h。

A.黃條金剛竹花粉在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h;B.黃條金剛竹花粉在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2.5 h；C.黃條金剛竹花粉在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h。

黃條金剛竹在不同培養(yǎng)基中的萌發(fā)率不同，由表1可以看出，黃條金剛竹的花粉在150 g·L-1蔗糖+0.020 g·L-1硼酸+0.294 g·L-1CaCl2·2H2O的培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，為38.91%±1.12%；在200 g·L-1蔗糖+0.005 g·L-1硼酸+0.007 g·L-1CaCl2·2H2O的培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，為18.22%±3.27%。在蔗糖質量濃度一定的條件下，隨著硼酸質量濃度的增加，萌發(fā)率呈增加趨勢；蔗糖質量濃度為150 g·L-1的時候，萌發(fā)率總體上較高，而在蔗糖質量濃度為200 g·L-1時，萌發(fā)率隨之降低。而硼酸質量濃度一定的條件下，隨著蔗糖質量濃度的增加，萌發(fā)率先升高后降低。通過比較，最適合花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基是150 g·L-1蔗糖+0.020 g·L-1硼酸+0.294 g·L-1CaCl2·2H2O。

表1黃條金剛竹在不同質量濃度培養(yǎng)基組分條件下的花粉萌發(fā)率

組合編號蔗糖質量濃度/g·L-1硼酸質量濃度/g·L-1CaCl2·2H2O質量濃度/g·L-1萌發(fā)率/%1500.0050.147(18.73±1.18)d 2500.0100.294(24.53±2.81)cd3500.0150.441(30.70±10.50)abc4500.0200.007(34.89±6.70)ab51000.0050.294(22.77±5.31)cd61000.0100.441(25.61±2.74)cd71000.0150.007(28.13±5.01)bc81000.0200.147(37.23±3.26)ab91500.0050.441(31.75±4.62)abc101500.0100.007(35.33±2.40)ab111500.0150.147(36.17±3.00)ab121500.0200.294(38.91±1.12)a132000.0050.007(18.22±3.27)d142000.0100.441(23.70±4.35)cd152000.0150.294(25.67±2.90)cd162000.0200.147(28.61±7.42)bc

注：表中萌發(fā)率數據為平均值±標準差；同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

4 結論與討論

大多數竹種為一次性開花植物，開花結實后，竹株進入衰老死亡[10]。但也有竹種花后經過復壯而繼續(xù)無性生長，即開花株稈花后死亡，但由鞭根不斷生出新的竹株，反復幾年后整片竹林不再開花[5]。林新春等[11]對雷竹林的開花林相進行觀察，發(fā)現(xiàn)開花竹株與未開花竹株并存，開花竹林整體呈枯黃色，竹稈黃色，夾雜著枯死竹株。雷竹林開花后竹筍產量急劇下降，粗壯竹筍很少甚至沒有，且非筍期出筍較多，形成矮小開花竹叢，開花后即枯死。開花麻竹與未開花麻竹相比，同化能力較差，異化作用較大，光合系數小，葉質質量(單位葉面積質量)和N、P、K及灰分等含量低[12]。開花會影響竹子的生理生化，竹林大面積開花會引起林相衰敗，不僅造成嚴重的經濟損失，還會破壞生態(tài)環(huán)境[13]。本研究對黃條金剛竹開花竹林林相進行了追蹤觀察，發(fā)現(xiàn)黃條金剛竹開花后，開花植株衰老死亡，但地下鞭根系統(tǒng)會生出新的竹株，如此反復，從開花至今已經5 a，目前仍處于花期。

竹子開花類型可分為全體成片開花、零星開花；開花后死亡、開花后不死；開花后結實、開花后不結實等類型[14]。竹子開花原因主要解釋為內因論和外因論，內因論認為，竹子開花受其獨特的生物鐘調控，外因論認為，竹子開花受外界環(huán)境變化所引發(fā)[15]。1984年到1996年在南京林業(yè)大學竹類植物園發(fā)現(xiàn)11種竹子開花，包括篌竹(Phyllostachysnidularia)、水竹(Ph.hetercolada)、壽竹(Ph.bambusasoides)等[16]。近年來，在南京林業(yè)大學竹種園內開花的竹子有月月竹(Chimonobambusasichuanensis)、鵝毛竹(Shibataeachinensis)、孝順竹(B.multiplex)等[17-19]。2015年，黃條金剛竹在南京林業(yè)大學校園內開花[20]，2016年通過每月定點觀察，黃條金剛竹屬于開花不定期、成片開花類型。

目前，有關竹子花器官形態(tài)和結構解剖的研究報道較多。例如，邢新婷等[21]對麻竹(D.latiflorus)小穗結構及花器構造進行了觀察研究；彭晟等[22]對云龍箭竹(Fargesiapapyrifera)和元江箭竹(F.yuanjianggensis)的花序特征做了詳細研究；林樹燕等[23-24]對月月竹和孝順竹的花芽分化及孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育進行了研究。竹子的花一般為穎花，由外稃、內稃、漿片、雄蕊、雌蕊5個部分構成。根據花的構造和開花特點，可將竹子的花分為開放型和閉合型兩種[25]。開放型小花開花時漿片因吸水而膨脹，將內外稃片撐開，此時雄蕊伸出，隨后雌蕊柱頭也伸出稃片接受花粉，如異葉苦竹(Pleioblastussimoniif.albostriatus)[18]、孝順竹[23]、月月竹[24]等；閉合型的小花開放時內、外稃不打開，開花時花藥從稃片頂端伸出，隨花絲伸長，花藥、花絲逐漸伸出稃片，如鵝毛竹[18]。本研究表明，黃條金剛竹開花為開放型，當小花發(fā)育成熟時，漿片吸水膨脹將稃片撐開，花藥伸出，風媒傳粉。

竹類植物花粉形態(tài)比較一致，為球形或近球形，單個萌發(fā)孔，花粉粒直徑一般為20～100 μm，各竹種間花粉外壁紋飾有差異。張文燕等[26]通過掃描電鏡對12種散生竹類花粉進行觀察，發(fā)現(xiàn)竹子花粉形狀均呈近球形，萌發(fā)孔形狀近圓形且大小不同，并且孔周圍有厚度不一的孔環(huán)。汪奎宏等[27]觀察早竹的花粉外觀，發(fā)現(xiàn)花粉有兩層壁，其中花粉外壁有較密集的細顆粒狀紋飾。本試驗利用掃描電鏡對黃條金剛竹花粉形態(tài)進行了觀察，花粉粒形態(tài)近球形，有明顯的萌發(fā)孔，近圓形且內凹，萌發(fā)孔具有孔環(huán)和孔蓋，外壁有細顆粒狀的紋飾。但不同竹種的花粉大小不同，同為剛竹屬的粉綠竹花粉粒平均直徑為80.86 μm，黃條早竹為74.32 μm，黃槽石綠竹為62.85 μm[7]；其他屬的竹種如異葉苦竹為27.86 μm，鵝毛竹為40.22 μm[18]，孝順竹為36.77 μm[19]。張文燕等[3]認為，竹子花粉粒的大小與花藥長度密切相關，即花藥越長，花粉粒越大。前期研究已對異葉苦竹、鵝毛竹、月月竹等進行比較，也得出類似結論[18，24]。粉綠竹花藥長度平均為13 mm，花粉粒平均直徑為80.86 μm[3]；孝順竹花藥長度為10～12 mm，花粉粒平均直徑為36.77 μm[19]。本試驗中，黃條金剛竹的花藥平均長度為8～10 mm，花粉粒平均直徑為(28.46±5)μm。

花粉萌發(fā)是影響竹類植物結實的重要條件，竹子花粉活力及萌發(fā)率相關研究較多。例如，張文燕等[26]對12種竹類的花粉萌發(fā)率的研究結果表明，竹類植物花粉萌發(fā)率普遍較低，最高不超過53.4%。汪奎宏等[27]利用I-KI染色法測定早竹的花粉活力為50%，培養(yǎng)基法測定的花粉萌發(fā)率為25.9%；林樹燕等[28]利用I2-KI染色法測定月月竹、異葉苦竹、鵝毛竹、福建茶稈竹、短穗竹(Semiarundinariadensiflora)的花粉活力分別為56%、78%、39%、68%、35%，培養(yǎng)基法測定的花粉萌發(fā)率分別為35.7%、76.5%、9.1%、60.0%、5.3%；李曉芬等[29]利用TTC染色法測定紫竹花粉活力為90%，培養(yǎng)基法測定花粉萌發(fā)率為8.0%。林樹燕等[30]測定了剛竹屬的黃槽石綠竹、粉綠竹和黃條早竹3個竹種的花粉萌發(fā)率，分別是58.7%、37.2%和21.7%。在已有相關研究的竹子中，花粉萌發(fā)率最低的是短穗竹(5.3%)，最高的是異葉苦竹(76.5%)，異葉苦竹的結實率較高，短穗竹則基本不結實[18，28]。經過比較發(fā)現(xiàn)，各竹種間花粉活力相差很大，且用染色法測定的花粉活力一般都較高，萌發(fā)率一般較低。本研究采用I2-KI染色法測定黃條金剛竹的花粉活力是76.9%，培養(yǎng)基法測定花粉萌發(fā)率最高為38.91%±1.12%。另外，明確了適宜黃條金剛竹花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基是150 g·L-1蔗糖+0.020 g·L-1硼酸+0.294 g·L-1CaCl2·2H2O，其中低質量濃度硼酸對花粉萌發(fā)具有明顯的促進作用，這與張文燕等[3]石翠綠竹和五月季竹花粉生活力相關研究中10%蔗糖液中再加入5 μg·g-1硼酸可明顯提高花粉發(fā)芽率的研究相似。

竹林成片開花后林相衰敗,只能通過有性天然/人工更新或無性復壯更新恢復[5]。竹子引種是避免竹子林相過快衰敗，提高竹子產量和質量的有效措施。竹子引種應考慮竹種本身優(yōu)良特性和適宜生態(tài)環(huán)境，了解其栽培歷史及生長情況[18]。為預防竹林大面積開花，可選擇起源和開花周期不同的竹苗造“混交”林，或混栽竹稈大小和出筍期大致相同的兩種或兩種以上的不同竹種[18]。另外，應及時砍除開花竹株,利于再生竹提早出筍,促進開花竹林的復壯更新[5]。本研究中黃條金剛竹竹林開花后，在沒有人工干預情況下基部有大量筍芽產生，竹林林相是否可通過有性天然或無性復壯更新還有待繼續(xù)觀察。