一株氯嘧磺隆降解菌分離鑒定及降解條件優(yōu)化

楊峰山，張瑞，肖延臣，劉春光，付海燕

1 黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500

2 黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080

3 黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080

氯嘧磺隆 (Chlorimuron-ethyl) 是美國杜邦公司20世紀(jì)80年代研制的一種廣譜、高效的選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型磺酰脲類除草劑，在我國廣泛用于防除大豆、玉米等作物田間闊葉及禾本科雜草[1]。氯嘧磺隆的田間使用量和殘留量不高，但殘留時(shí)間長、難降解，尤其實(shí)際使用過程中存在長期、超量、重復(fù)使用等問題，對后茬敏感作物產(chǎn)生不同程度藥害[2-4]，造成減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，對農(nóng)田土壤和周邊水體造成污染，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成潛在威脅[5]。氯嘧磺隆在土壤中的降解主要包括光解、化學(xué)水解和微生物降解 3種途徑，微生物降解因其具有高效、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)成為各國學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[6]。目前已經(jīng)報(bào)道的具有氯嘧磺隆降解特性的微生物有真菌如擲孢酵母Sporobolomycessp.LF1、粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescensN80、黑曲霉Aspergillus niger[7-10]，細(xì)菌如假單胞菌Pseudomonassp. LW3、克雷伯氏菌Klebsiella jilinsis2N3、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisYB1、Hansschlegeliasp. CHL1、紅球菌Rhodococcussp.D310-1、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophiliaD310-3和路德維希氏腸桿菌屬Enterobacter ludwigiisp.等[11-17]。深入挖掘氯嘧磺隆降解菌株資源，獲得種類更多、降解特性更高的氯嘧磺隆降解菌株，進(jìn)行氯嘧磺隆污染土壤生物修復(fù)，對農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

本研究從氯嘧磺隆污染土壤中分離鑒定了1株以氯嘧磺隆為唯一碳源的高效降解菌, 研究其對氯嘧磺隆的降解特性，優(yōu)化菌株降解條件，提高其降解效率。為氯嘧磺隆污染土壤原位生物修復(fù)提供理論及應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

從山東省高密市呼家莊鎮(zhèn)小南莊村氯嘧磺隆藥害農(nóng)田中采集土壤樣品，去除作物根系及地表浮土，隨機(jī)選取10個(gè)采樣點(diǎn)，每點(diǎn)取樣200 g，深度5–13 cm，置于滅菌自封袋中，4 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

氯嘧磺隆20%可濕性粉劑，大連瑞澤農(nóng)藥廠生產(chǎn)；氯嘧磺隆標(biāo)樣 (GSBG24151-42國標(biāo)液)：100 ng/μL，介質(zhì)為丙酮，農(nóng)業(yè)部天津環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所監(jiān)制；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (天根生化科技有限公司)；引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成；pMD18-T Vector購自大連寶生物公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 氯嘧磺隆降解菌株分離

以氯嘧磺隆為唯一碳源，采用搖瓶富集培養(yǎng)技術(shù)分離土壤中的降解菌株。氯嘧磺隆起始含量200 mg/L，30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d后5%接種量轉(zhuǎn)接，終濃度至800 mg/L，3次重復(fù)。應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的檢測。選取降解率較高的樣品，梯度稀釋，30 ℃反復(fù)純化培養(yǎng)，4 ℃冰箱保存[18]。

1.4 氯嘧磺隆降解菌鑒定

1.4.1形態(tài)特征鑒定

采用平板劃線法將氯嘧磺隆降解菌接種于無機(jī)鹽基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基 (MSM, NaCl 0.50 g/L，KH2PO40.50 g/L，K2HPO41.50 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，NH4NO31.00 g/L，Agar 20 g/L，pH 7.0)，30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)。采用革蘭氏染色法和KOH反應(yīng)試驗(yàn)確定菌株革蘭氏類型。掃描電子顯微鏡觀察菌株顯微結(jié)構(gòu)。

1.4.2生理生化鑒定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[19]完成菌株生理生化指標(biāo)測定，包括淀粉水解試驗(yàn)、液化明膠試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、耐鹽性、氧化酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、MR試驗(yàn) (甲基紅試驗(yàn))、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、乙醇氧化、高溫培養(yǎng) (60 )℃、吲哚試驗(yàn)等。

1.4.3 16S rDNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

采用CTAB法和SDS高鹽沉淀法提取菌體總DNA。利用16S rDNA通用上、下游引物P2/P7，P2：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 P7：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′擴(kuò) 增 降 解 菌株的16S rDNA區(qū)域序列。PCR產(chǎn)物回收、純化，與 T載體連接。將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，檢測陽性克隆子。利用pMD18-T載體上的通用引物，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序，應(yīng)用BLAST進(jìn)行DNA序列分析。測序結(jié)果與GenBank上的序列進(jìn)行同源性比對，用ClustalX進(jìn)行序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 氯嘧磺隆降解性能測定

降解菌株在 LB液體培養(yǎng)基活化至對數(shù)生長期，離心去上清，0.02 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH 7.0) 緩沖液洗滌2次，用等體積緩沖液懸浮菌體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

制備氯嘧磺隆300 mg/L的無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液(MSM，不含瓊脂)，接入終濃度為8.0×107cfu/mL降解菌株，30 ℃、200 r/min條件搖床振蕩培養(yǎng)5 d，離心取上清液2 mL，參照肖延臣[18]建立的氯嘧磺隆的高效液相色譜條件，測定氯嘧磺隆濃度，設(shè)不接菌為對照。降解率計(jì)算公式：

降解率(%)=(殘留農(nóng)藥量/起始農(nóng)藥量)×100%。

1.6 氯嘧磺隆降解菌降解條件優(yōu)化

分別以 10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃作為溫度試驗(yàn)組，以初始pH分別為 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0作為pH試驗(yàn)組，以分別裝入25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL、150 mL/250 mL、200 mL/250 mL培養(yǎng)基作為裝液量試驗(yàn)組，以氯嘧磺隆濃度分別為50 mg/L、l00 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L作為初始濃度試驗(yàn)組，分別按1%、2%、4%、6%、8%、10%、15% (V/V) 的量定量接種菌懸液作為接種量試驗(yàn)組。以上各試驗(yàn)組均使用初始濃度300 mg/L無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，對照組加藥不接菌，200 r/min搖床培養(yǎng)5 d后，測定培養(yǎng)液OD600值及氯嘧磺隆降解率，研究不同環(huán)境因素對降解菌株生長和氯嘧磺隆降解率的影響。

1.7 氯嘧磺隆降解菌株降解性能正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對pH值、濃度、接種量、培養(yǎng)溫度和裝液量進(jìn)行5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。以降解率作為考察指標(biāo)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)分析和制圖采用Origin8.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯嘧磺隆降解菌分離

通過富集培養(yǎng)、逐級馴化和平板分離等方法，分離出一株氯嘧磺隆降解菌，命名為 T9DB-01，該菌株以氯嘧磺隆為唯一碳源。測得菌體濃度為8.0×107CFU/mL，30 ℃、pH 7.0、200 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，對濃度為300 mg/L的氯嘧磺隆的降解率為92.1%。

菌落呈白色，不透明，形態(tài)呈圓形，表面光滑，微微隆起，邊緣整齊。菌株為革蘭氏陰性，無芽孢。掃描電鏡下觀察到菌體細(xì)胞長桿狀，菌體大小(0.2–0.4)×(0.8–0.9) μm，側(cè)生鞭毛 (圖 1)，好氧，能運(yùn)動。

2.2 氯嘧磺隆降解菌株生理生化鑒定

對氯嘧磺隆降解菌株T9DB-01進(jìn)行24項(xiàng)生理生化指標(biāo)鑒定，結(jié)果如表2所示。

表1 T9DB-01降解特性正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Or thogonal expe riments de sign of strain T9DB-01 about degradation characteristics

圖1 菌株T9DB-01掃描電鏡圖 (A) 和無機(jī)鹽培養(yǎng)基上菌落形態(tài) (B)Fig. 1 Morphological observation of strain T9DB-01. (A)A scanning electron micrograph of strain T9DB-01. (B) A photograph of the colony after 2 days culture on mineral medium.

表2 降解菌株T9DB-01生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical c haracteristics of strain T9DB-01

2.3 氯嘧磺隆降解菌分子生物學(xué)鑒定

菌株T9DB-01的16S rDNA序列與假單胞菌屬的序列同源性達(dá)到100%。說明該菌株在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上屬于假單胞菌屬，學(xué)名為Pseudomonassp.。用Clustalx軟件分析比對菌株的16S rDNA基因序列，利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 2)。結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征，綜合推斷該菌株為假單胞菌Pseudomonassp.。菌株T9DB-01序列已在GenBank中注冊，GenBank登錄號為GU395783。

2.4 環(huán)境因素對 T9DB-01生長和氯嘧磺隆降解的影響

溫度對菌株 T9DB-01降解率影響比較大(圖3A)，10–45 ℃降解率呈先增加后減小的趨勢，30 ℃時(shí)菌體的降解率為 86.3%達(dá)到最大值，此時(shí)菌體OD600值為0.771。pH 4.0–10.0范圍內(nèi)，降解率先增加后減小 (圖3B)，pH值為7.0時(shí)降解率達(dá)到最大值 90.4%，此時(shí)菌體OD600值為 0.904。氯嘧磺隆的降解率隨著接種量增加而增大 (圖3C)，但在接種量達(dá)4%以后，降解率不再顯著增加，故確定4%為最佳接種量。氯嘧磺隆初始濃度對菌株T9DB-01的生長及降解率的影響呈先升后降的趨勢 (圖3D)，氯嘧磺隆濃度在50–300 mg/L范圍內(nèi)，降解菌的生長呈逐漸上升趨勢，氯嘧磺隆濃度在300–800 mg/L范圍內(nèi)，菌株T9DB-01生長受到抑制，降解率也隨之逐漸減低。隨著三角瓶中裝液量的增加，菌株的生長速度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖3E)，裝液量為100 mL時(shí)，菌體的生長量和降解率均達(dá)到峰值。

2.5 正交法對環(huán)境條件的優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果單一，為進(jìn)一步優(yōu)化菌株降解條件，提高菌株對氯嘧磺隆降解率，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)5因素4水平正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，正交試驗(yàn)第12組 (A2B3C2D2E2) 為菌株T9DB-01降解氯嘧磺隆最佳條件：30 ℃，pH 8.0，接種量4%，裝液量100 mL/250 mL，底物濃度為200 mg/L，培養(yǎng)5 d，降解率為93.7% (表3)。

圖2 菌株T9DB-01基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA genes of strain T9DB-01.

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test results

進(jìn)一步對方差分析可以發(fā)現(xiàn)，5個(gè)因素中濃度的F值最大，為 126.32，對其降解氯嘧磺隆效果影響達(dá)到極顯著水平。其次是溫度，裝液量的F值最小。所以5個(gè)因素的顯著性差異由大到小的順序是：底物濃度>溫度>pH值>接種量>裝液量。

3 討論

以微生物修復(fù)理論為基礎(chǔ)的除草劑殘留降解技術(shù)是解決土壤修復(fù)問題的有效途徑[20]。文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了很多能降解或轉(zhuǎn)化氯嘧磺隆的微生物，包括真菌、細(xì)菌和放線菌，其中以細(xì)菌為主。Ma等[11]從污染土壤中分離到氯嘧磺隆降解菌為假單胞菌屬LW3，氯嘧磺隆50 mg/L，pH 7.0，30 ℃，接種7 d后，液體培養(yǎng)基中的降解率約為81.5%。Pan等[17]從污染土壤中分離得到氯嘧磺隆降解菌Enterobacter ludwigiisp.，生物降解作用隨著濃度(1–10 mg/L) 和溫度 (20–40 ℃) 的升高而增加，最佳pH為7.0。劉艷等[21]從長期施用氯嘧磺隆的土壤中分離得到 1株氯嘧磺隆降解菌惡臭假單胞菌L-6，200 mg/L、pH 8.0、30 ℃，接種4 d后氯嘧磺隆降解率達(dá)到80%以上。Zhang等[22]從污染農(nóng)田土壤中分離出苯磺隆甲基共代謝降解菌株假單胞菌屬NyZ42，當(dāng)葡萄糖或琥珀酸鹽作為補(bǔ)充碳源時(shí)，200 mg/L苯磺隆甲酯，接種4 d，降解率約80%。Li等[23]用兩種氯嘧磺隆-乙基降解菌株(Rhodococcussp. D310-1；Enterobactersp. D310-5)混合發(fā)酵制備氯嘧磺隆-乙基降解細(xì)菌聚生體，在溫室中用于修復(fù)氯嘧磺隆污染的 (20 mg/kg) 土壤，60 d后降解率達(dá)到 80.02%。Cheng等[24]對D310-1進(jìn)行了RNA-Seq分析，根據(jù)qRT-PCR，提出羧酸酯酶、細(xì)胞色素P-450和糖基轉(zhuǎn)移酶3個(gè)基因參與氯嘧磺隆的生物降解。本研究從氯嘧磺隆污染土壤中分離到1株高效氯嘧磺隆降解菌，經(jīng)鑒定為假單胞菌Pseudomonassp.。氯嘧磺隆200 mg/L，30 ℃，pH 8.0，接種量 4%，裝液量 100 mL/250 mL，培養(yǎng)5 d，降解率為93.7%。利用假單胞菌對氯嘧磺隆污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)具有巨大潛力。假單胞菌既可以降解氯嘧磺隆，也可以降解其他磺酰脲類除草劑，體現(xiàn)了微生物適應(yīng)環(huán)境的多重活性。

降解菌株氯嘧磺隆的效率與菌株活性密切相關(guān)，凡是能夠影響微生物活性的因素均能影響它們的降解率。如底物濃度、溫度、pH值、裝液量、接種量等因子。其中底物濃度對降解菌的降解效率影響達(dá)到極顯著水平，底物濃度小于300 mg/L可促進(jìn)菌株生長，大于300 mg/L則抑制菌株生長。這與劉艷等[21]在研究惡臭假單胞菌屬菌株 L-6降解特性時(shí)得到的結(jié)果基本相同，氯嘧磺隆濃度為200 mg/L時(shí)，菌株L-6的降解率達(dá)到86.75%。低于或高于該濃度，菌體生長量和降解率均有所下降。李春艷等[25]在研究腸桿菌屬菌株D310-5也得到同樣結(jié)果。這是因?yàn)槁揉谆锹∽鳛橐环N復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)，一方面為微生物的生長提供了碳源，隨著濃度增加，為菌體提供足夠的能量，使菌體大量繁殖，促進(jìn)了菌株對氯嘧磺隆的降解；另一方面氯嘧磺隆具有一定的毒性，且難以被微生物直接利用，當(dāng)氯嘧磺隆濃度過大時(shí)，對菌株產(chǎn)生了毒性，影響菌株生長，從而使降解率下降。當(dāng)氯嘧磺隆的濃度較低時(shí)，菌體可以耐受氯嘧磺隆的毒性，并能夠利用其提供的碳源生長，當(dāng)氯嘧磺隆的濃度高于菌體的耐受力時(shí)則抑制其生長。菌體對氯嘧磺隆的耐受能力因菌而異。

經(jīng)降解條件優(yōu)化，氯嘧磺隆降解菌株T9DB-01在實(shí)驗(yàn)室條件下較其他菌株表現(xiàn)出顯著優(yōu)良的降解性能，具有一定的應(yīng)用潛力，為氯嘧磺隆降解菌株資源提供了有益的補(bǔ)充，關(guān)于菌株T9DB-01在污染土壤中的降解能力及對后茬敏感作物藥害修復(fù)能力還需進(jìn)一步研究。