超積累植物伴礦景天鎘耐受基因SpMT2的分離及功能鑒定

彭佳師，易紅英，龔繼明

1 湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 重金屬污染土壤生態(tài)修復(fù)與安全利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 湘潭 411201

2 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/植物生理生態(tài)研究所 植物分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

重金屬超積累植物由于其高積累與高耐受重金屬的特性，不僅可以直接用于環(huán)境污染的植物修復(fù)，還可以在深入解析其高富集和高耐受重金屬機(jī)理的基礎(chǔ)上為植物修復(fù)技術(shù)提供基因資源和研究思路。對(duì)十字花科“模式超積累植物”葉芽鼠耳芥 Arabidopsis halleri和天藍(lán)遏藍(lán)菜 Thlaspi caerulescens的研究表明，除了關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如ZIP (ZRT and IRT-like protein) 家族蛋白、HMA4(Heavy metal ATPases 4) 和MTP (Metal Transport Protein) 等的組成型高表達(dá)外，一些金屬螯合物如組氨酸 (Histidine) 和NA (Nicotinamine) 等在超積累植物耐受和富集重金屬的過程中也發(fā)揮著重要的作用[1]。然而，人們對(duì)另一類廣泛存在于植物體內(nèi)的金屬螯合蛋白——金屬硫蛋白(Metallothioneins，MTs) 在超積累植物耐受和富集重金屬的過程中所發(fā)揮的作用卻知之甚少。

金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸(Cys)并能夠結(jié)合多種重金屬如鋅 (Zn)、鎘 (Cd) 以及銅(Cu) 等的小分子蛋白。已有的證據(jù)表明，MTs在植物體內(nèi)金屬離子脅迫的解毒過程中發(fā)揮著重要作用[2]。植物金屬硫蛋白家族在序列和功能上雖具多樣性，但大多數(shù)被子植物MTs在序列的兩端富含Cys，并且一般具有4種相對(duì)保守的Cys排列順序，從而將植物 MTs分為 4種類型[2-3]。而對(duì)于重金屬超積累植物，大量的研究證實(shí)一些MTs家族成員的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其近親非超積累植物，這暗示它們可能參與了其超富集和超耐受重金屬的過程[4-7]。這些 MTs在酵母、擬南芥或煙草中表達(dá)后能提高對(duì)重金屬的抗性[6-11]。然而，遺傳學(xué)的證據(jù)表明MTs的高表達(dá)并沒有與超積累植物對(duì)重金屬的超耐受性連鎖[7,11-12]。這也就使MTs在超積累植物富集和耐受 Cd的過程中的作用至今仍未被人們所解析。

伴礦景天Sedum plumbizincicola是近期在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的景天科超積累植物新種[13-14]。地上部重金屬超量積累以及較大的生物量和實(shí)驗(yàn)室種植方便等特性使伴礦景天成為較為理想的模式超積累植物。為了鑒定其富集和耐受重金屬Cd的關(guān)鍵基因，我們通過篩選伴礦景天的 cDNA文庫得到一個(gè)富含Cys的金屬硫蛋白家族基因SpMT2。通過酵母異源表達(dá)系統(tǒng)解析了其介導(dǎo)Cd耐受性的機(jī)制，并結(jié)合其在植物中的亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式，推測(cè) SpMT2可能通過在伴礦景天細(xì)胞質(zhì)內(nèi)螯合 Cd以增強(qiáng)對(duì) Cd的耐受性，同時(shí)這種螯合減少了 Cd向液泡中的區(qū)隔化從而保持了 Cd在植物體內(nèi)的流動(dòng)性，促進(jìn)了 Cd的高效長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及培養(yǎng)條件

伴礦景天采集自浙江省衢州市一處廢棄的鋅/鉛礦 (N29°14′29″，E118°50′32″)。實(shí)驗(yàn)室條件下，選擇生長(zhǎng)良好、莖部粗細(xì)基本一致的植物材料，截取含頂芽的3–5 cm長(zhǎng)帶葉枝條，扦插進(jìn)行土壤培養(yǎng)，或進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。伴礦景天營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)配方：1 L 營(yíng)養(yǎng)液中含 2 000 μmol Ca(NO3)2、100 μmol KH2PO4、500 μmol MgSO4、100 μmol KCl、700 μmol K2SO4、10 μmol H3BO3、0.50 μmol MnSO4、1 μmol ZnSO4、0.20 μmol CuSO4、0.01 μmol (NH4)6Mo7O24、100 μmol Fe-EDTA，pH 5.5–5.8。生長(zhǎng)環(huán)境為相對(duì)濕度60%–70%，恒溫22–24 ℃，光照周期為16 h光照/8 h黑暗[15]。

1.2 cDNA文庫構(gòu)建及抗Cd基因篩選

用不同濃度梯度以及時(shí)間梯度處理的伴礦景天分根和地上部取材后利用CTAB法 (2% CTAB，25 mmol/L EDTA-Na2，0.1 mol/L Tris，pH 8.0，1.4 mol/L NaCl) 提取伴礦景天總RNA[15]。按照試劑盒說明書(Invitrogen公司)步驟構(gòu)建酵母表達(dá)全長(zhǎng)cDNA文庫，酵母表達(dá)載體為半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體pYES-DEST52。將文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后，按照Gietz & Schiestl的方法[16]轉(zhuǎn)化對(duì)Cd敏感的酵母ycf1突變體，涂布200個(gè)平板 (碳源為葡萄糖)，每塊大平板 (150 mm×15 mm)涂布約5 000個(gè)酵母轉(zhuǎn)化子。收集平板上的轉(zhuǎn)化子，混合后涂布到含有相應(yīng)濃度 Cd的培養(yǎng)基平板上 (碳源為半乳糖)，每塊平板涂布約 10萬個(gè)細(xì)胞，涂布約200塊平板。30 ℃培養(yǎng)7 d左右，對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選鑒定。

1.3 酵母表型鑒定

將目的基因連入酵母表達(dá)載體pYES2，并轉(zhuǎn)化酵母[17]。挑取單克隆培養(yǎng)至OD600為1.0左右。用 2 mL新鮮的液體培養(yǎng)基將適量菌液稀釋至OD600為0.2左右，培養(yǎng)至OD600為0.6。取1 mL菌液，12 000×g離心收集菌體，用無菌水重懸菌體。將菌液依次稀釋至 OD600=1、0.1、0.01。分別取10 μL菌體懸液滴至含有不同濃度重金屬的培養(yǎng)基平板上，28–30 ℃培養(yǎng)4–7 d。并拍照。

1.4 酵母液泡提取

酵母液泡提取參考Li等的方法[18]，并略有改動(dòng)。簡(jiǎn)要步驟如下：從平板上刮取適量的酵母接種到20 mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為1–1.5左右。將培養(yǎng)液倒入 400 mL新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為1時(shí)加入相應(yīng)濃度的重金屬處理，并繼續(xù)培養(yǎng)6 h。1 800×g離心5 min，收集細(xì)胞。用30 mL含有 100 mmol/L Tris-SO4(pH 9.3)和10 mmol/L DTT的溶液重懸細(xì)胞至OD600為10，30 ℃靜置 10 min。離心，棄上清，菌體沉淀用緩沖液(1.2 mol/L 山梨醇，20 mmol/L 磷酸鉀，pH 7.4) 洗一次。加入20 mg/mL酵母細(xì)胞壁裂解酶 (Sigma公司)，30 ℃靜置 30 min 以上。1 000×g、4 ℃離心5 min，用3.5 mL預(yù)冷的15% 菲可緩沖液 (15%菲可，0.2 mol/L山梨醇，10 mmol/L PIPES-KOH,pH 6.8) 將無壁細(xì)胞懸起 (至OD600=70)。加入二乙胺乙基葡聚糖至50 mg/mL，冰上3 min，30 ℃5 min，加入MgCl2至終濃度為1.5 mmol/L。裂解液轉(zhuǎn)至離心管中，上面依次覆蓋3 mL 8%菲可、4 mL 4%菲可和1 mL 0%菲可緩沖液 (10 mmol/L PIPES-KOH，pH 6.8，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mol/L山梨醇)，110 000×g、4 ℃離心90 min，收集0%和4%菲可的液相界面間的液泡。提取得到的液泡分為兩份，一份用BSA法測(cè)定其總蛋白含量，另一份測(cè)定重金屬含量。

1.5 熒光蛋白融合構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

以eGFP-L和eGFP-R為引物擴(kuò)增eGFP (表1)，并利用 KpnⅠ和 SacⅠ酶點(diǎn)連入酵母表達(dá)載體pYES2得到pYES2-eGFP載體。以SpMT2-L1和SpMT2-R2為引物擴(kuò)增 SpMT2 (表 1)，通過Hind Ⅲ和KpnⅠ連入酵母表達(dá)載體pYES2-eGFP得到酵母亞細(xì)胞定位載體pYES2-SpMT2-eGFP，并轉(zhuǎn)化酵母，用共聚焦顯微鏡 (Olympus-FV1000)觀察亞細(xì)胞定位，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，接受光波長(zhǎng)500–550 nm。

以SpMT2-L1和SpMT2-R2擴(kuò)增SpMT2 (表1)，通過 XhoⅠ和 SalⅠ連入植物瞬時(shí)表達(dá)載體PA7-YFP得到用于擬南芥葉片細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)的載體PA7-SpMT2-YFP。參考He等[19]的方法轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡(Olympus-FV1000) 觀察亞細(xì)胞定位，激發(fā)光波長(zhǎng)514 nm，接受光波長(zhǎng)530–600 nm。

1.6 鎘含量測(cè)定

待測(cè)酵母細(xì)胞依次用超純水、5 mmol/L的EDTA、超純水各洗2次，每次5 min。清洗好后烘干，稱干重，用70%濃硝酸硝解，稀釋，用電感耦合等離子質(zhì)譜 (ICP-MS) 測(cè)定鎘離子含量[13]。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

提取RNA后，去除總RNA中的基因組DNA。精確量取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將合適濃度梯度的SpMT2/pGEM T-easy質(zhì)粒和伴礦景天cDNA在同一批次進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR。將 SpMT2/pGEM T-easy的反應(yīng)循環(huán)數(shù)和模板拷貝數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算伴礦景天轉(zhuǎn)錄組中SpMT2的表達(dá)豐度[13]。引物見表1。

表1 本研究中所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.8 序列信息

SpMT2的cDNA序列已經(jīng)提交至GenBank，序列號(hào) (Accession Number) 為MK893990。

2 結(jié)果與分析

2.1 伴礦景天cDNA文庫篩選及SpMT2的鑒定

酵母具有真核生物基因的優(yōu)良表達(dá)系統(tǒng)、高效的轉(zhuǎn)化方法和可供篩選的豐富突變體、因此是篩選目的外源基因的高效系統(tǒng)。植物中很多抗Cd基因都是利用酵母互補(bǔ)系統(tǒng)對(duì)其cDNA文庫進(jìn)行篩選而被鑒定，如擬南芥的AtPCS1和AtPCR1、小麥 Triticum aestivum 的 TaPCS1、TaTM20 和TaHsfA4a、印度芥菜 Brassica juncea的 BjOXS3等[19-25]。伴礦景天由于遺傳背景不明，基因序列信息缺失，因此利用酵母的遺傳互補(bǔ)系統(tǒng)對(duì)其cDNA文庫進(jìn)行篩選以得到抗Cd的關(guān)鍵基因是研究伴礦景天富集和耐受Cd機(jī)理的有效方法。

利用均長(zhǎng)為1 200 bp的酵母表達(dá)cDNA文庫轉(zhuǎn)化釀酒酵母 Ycf1突變體 DTY168，得到大于400 000個(gè)酵母單克隆。收集這些單克隆并混勻，取部分涂布于含有400 μmol/L Cd的平板上，最終篩選得到約6 000個(gè)抗Cd克隆。隨機(jī)挑取200個(gè)克隆分析了其插入片段，發(fā)現(xiàn)只有兩個(gè)基因，命名為 KG7和 KG8。KG8已經(jīng)發(fā)表[13]，在此選取KG7作為研究對(duì)象。由于KG7符合植物金屬硫蛋白特征，因此命名為SpMT2。

SpMT2的CDS 全長(zhǎng)240 bp，編碼79個(gè)氨基酸，其中Cys殘基 14個(gè)。根據(jù) Zimeri 等[3]通過相鄰Cys位置的間距對(duì)植物4種類型MTs的表征(表 2)，SpMT2 (Cys 排列順序：1424243…24232)屬于植物MT2亞家族。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SpMT2在酵母中的功能，將其在酵母Cd敏感突變體Δyap1及其野生型Y252中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能極大地提高突變體以及野生型酵母對(duì)Cd的抗性 (圖1A)。值得一提的是，SpMT2的表達(dá)并沒有增強(qiáng)酵母對(duì)Zn的耐受性 (圖1B)。

表2 植物金屬硫蛋白的半胱氨酸數(shù)目及分布類型Table 2 Total numbers and spa cing patt erns of cysteine residues in different types of plant MTs

圖1 SpMT2的表達(dá)增強(qiáng)了酵母對(duì)Cd的抗性Fig. 1 Expression of SpMT2 enhanced Cd tolerance in yeast. The cadmium-sensitive yeast mutant Δyap1 and its wild type Y252 (A), zinc-sensitive yeast mutant Δzrc1 and its wild type CM100 (B) were transformed with EV(pYES2 empty vector), SpMT2, and grown on SD plates with indicated concentrations of metals for 7 days.

2.2 SpMT2定位于酵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中

由于 SpMT2的分子量遠(yuǎn)小于綠色熒光蛋白eGFP，為了利用eGFP的融合來觀察SpMT2的亞細(xì)胞定位，我們先將SpMT2-eGFP的融合載體在酵母中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其抗Cd功能并未受到eGFP融合的影響 (圖 2A)。在此基礎(chǔ)之上，我們檢測(cè)了其亞細(xì)胞定位，SpMT2主要定位在酵母細(xì)胞質(zhì)中(圖2B)，暗示其可能主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用從而降低了Cd的毒害。

2.3 SpMT2減少了酵母中Cd向液泡中的轉(zhuǎn)運(yùn)

由于酵母 Δyap1突變體的液泡 Cd區(qū)隔化功能受到影響[26]，并且SpMT2的表達(dá)能提高野生型酵母Y252對(duì)Cd的抗性 (圖1A)，因此用50 μmol/L Cd處理Y252轉(zhuǎn)化子酵母并提取了液泡，通過測(cè)定液泡中 Cd含量發(fā)現(xiàn)，SpMT2的表達(dá)極大地減少了液泡中Cd的含量 (圖3A)，然而并沒有改變酵母中總Cd 的含量 (圖3B)。

圖3 SpMT2的表達(dá)減少了酵母中Cd向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)Fig. 3 Expression of SpMT2 reduced Cd transport into vacuole. Total Cd accumulation (A) and vacuolar Cd accumulation (B) in yeast containing EV (pYES2 empty vector) or SpMT2. Yeast was treated with 50 μmol/L CdCl2 for 5 hours. Data are x±s, n=3. Statistical significance was indicated by lowercase letters above the bars (ANOVA test, P<0.05).

2.4 SpMT2定位于植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)

為了探究 SpMT2在植物中是否也具有類似的功能，我們檢測(cè)了其在植物中的亞細(xì)胞定位。將 SpMT2-YFP的融合構(gòu)建在擬南芥的原生質(zhì)體細(xì)胞表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)其與對(duì)照YFP的定位一致，主要位于細(xì)胞質(zhì)中 (圖4)。

2.5 SpMT2在伴礦景天中的表達(dá)模式

基因的表達(dá)模式能夠?yàn)榛蚬δ艿耐茰y(cè)提供線索。我們通過分析單位總RNA中SpMT2的mRNA豐度來檢測(cè)其表達(dá)模式。結(jié)果表明，SpMT2在伴礦景天根部和地上部都高豐度表達(dá)，且表達(dá)豐度無顯著差異，1 μg總RNA中含有的SpMT2 mRNA的分子數(shù)超過108個(gè) (圖5)。需要指出的是，SpMT2的表達(dá)并不受Cd處理的誘導(dǎo)變化 (圖5)。

3 討論

本研究中我們通過高通量的 cDNA文庫篩選，克隆鑒定了金屬硫蛋白家族成員SpMT2。并利用酵母系統(tǒng)證實(shí) SpMT2主要在細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用從而降低了Cd的毒害，同時(shí)減少了Cd向液泡中的區(qū)隔化。由于伴礦景天是新鑒定的物種，其相關(guān)遺傳操作方法尚未成熟，但是我們根據(jù) SpMT2在植物細(xì)胞質(zhì)定位以及在伴礦景天根部和地上部高豐度表達(dá)的結(jié)果，推測(cè)其可能在伴礦景天富集和耐受Cd過程中發(fā)揮了重要的作用。

圖4 SpMT2定位于植物細(xì)胞質(zhì)Fig. 4 SpMT2 localized to the cytosol in plants. Subcellular location of SpMT2 in Arabidopsis mesophyll protoplasts.Bars=10 μm.

圖5 SpMT2在伴礦景天中的表達(dá)模式Fig. 5 Expression levels of SpMT2 in S. plumbizincicola.Plants were grown in hydroponics for 6 weeks, and were transferred to solution supplemented with 10 μmol/L CdCl2 and allowed growth for another 3 d. Data are x±s, n=3.

植物體內(nèi)存在多種類型的金屬元素的螯合物，越來越多的研究表明，這些螯合物通過與金屬元素形成穩(wěn)定的復(fù)合物，在調(diào)節(jié)金屬元素的液泡區(qū)隔容量 (Vacuolar sequestration capacity，VSC) 從而調(diào)節(jié)它們?cè)隗w內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中發(fā)揮重要的作用[27]。特別是在超積累植物中，這些螯合物在細(xì)胞質(zhì)中與重金屬離子的螯合不僅降低了游離重金屬離子造成的毒害，而且減少了根部重金屬離子向液泡中的區(qū)隔化，保證了重金屬離子流動(dòng)性從而促進(jìn)其在體內(nèi)的長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)。如NA在超積累植物葉芽鼠耳芥中的含量遠(yuǎn)高于其近親非超積累植物，在NA含量減少的AhNAS2-RNAi株系中，地上部Zn和Cd的積累量也隨之減少[28]。因此，我們推測(cè)SpMT2可能通過在伴礦景天細(xì)胞質(zhì)中螯合Cd以增強(qiáng)對(duì)Cd的耐受性。同時(shí)，減少了Cd向液泡中的區(qū)隔化從而促進(jìn)了Cd在體內(nèi)的高效長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)。

我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)，伴礦景天根部細(xì)胞中Cd的VSC顯著小于其近親非超積累植物[13]，而地上部積累的 Cd并不是主要儲(chǔ)存于液泡中而更多地儲(chǔ)存在細(xì)胞壁中[29]。因此，伴礦景天可能存在特殊的調(diào)節(jié)機(jī)制減少了Cd的VSC，SpMT2在根部和地上部都高豐度表達(dá)，可能在此過程中發(fā)揮作用。SpMT2在根部細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中通過螯合Cd促進(jìn)了Cd向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，而在地上部細(xì)胞質(zhì)中與Cd的螯合可能在Cd向胞外細(xì)胞壁部位再分配過程中發(fā)揮作用。這一推測(cè)需要在未來通過構(gòu)建和分析伴礦景天的 SpMT2突變體或過表達(dá)材料等方式來進(jìn)一步驗(yàn)證。