蜈蚣草中砷超富集的分子機(jī)制研究進(jìn)展

張?zhí)?，閆慧莉，何振艷

1 中國(guó)科學(xué)院植物研究所 北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093

2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

砷是一種自然界中廣泛存在的類金屬元素，由于其強(qiáng)毒性而被歸類于重金屬。隨著社會(huì)發(fā)展，化石燃料的燃燒、砷礦的開(kāi)采、含砷農(nóng)藥及化學(xué)制品的使用、工業(yè)廢水的排放等人為因素，使得土壤中的砷濃度日益增加，引起了世界范圍內(nèi)不同程度的土壤砷污染問(wèn)題。土壤中的砷可通過(guò)食物鏈富集到人體中，進(jìn)而誘發(fā)皮膚癌和肺癌、肝癌等疾病[1]。目前，世界范圍內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)面臨著嚴(yán)峻的土壤砷污染問(wèn)題。土壤砷污染對(duì)食品安全和人類健康已造成嚴(yán)重威脅。一些國(guó)家如波蘭、墨西哥的砷污染區(qū)，土壤砷濃度甚至超出標(biāo)準(zhǔn)限值 (24 mg/kg US EPA) 的百倍以上[2]。我國(guó)是世界上砷污染最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，尤其是湖南、云南、廣西、廣州、貴州等省份土壤砷污染程度更為突出[3]。土壤砷污染是全球共同面臨的挑戰(zhàn)，砷污染土壤的治理對(duì)人類健康具有重要意義。

蜈蚣草Pteris vittataL.是一種砷的超富集植物，具有極強(qiáng)的砷抗性和超富集砷的能力，可在砷濃度高達(dá)1 500 mg/kg的土壤中正常生長(zhǎng)，地上部分積累的砷可達(dá)22 630 mg/kg，遠(yuǎn)高于一般常見(jiàn)植物 (<10 mg/kg)[4]。與非超富集砷的植物相比，蜈蚣草中的砷從根到地上部分的易位更為高效，砷的生物轉(zhuǎn)移系數(shù)可達(dá)24，能迅速將砷富集到地上部分，從而增加砷的積累量[5]。蜈蚣草作為超富集砷的典型植物，以該植物為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的植物修復(fù)技術(shù)，成本低、操作簡(jiǎn)單、不易造成二次污染，近年來(lái)已在我國(guó)蜈蚣草適生的河南、湖南和廣西等地進(jìn)行修復(fù)技術(shù)示范[6-8]。以蜈蚣草為研究對(duì)象，對(duì)其超富集砷的分子機(jī)制進(jìn)行解析，闡釋蜈蚣草對(duì)砷的轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒機(jī)理，可為超富集砷的工程植株的改良和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，是砷污染植物修復(fù)技術(shù)廣泛應(yīng)用的核心理論基礎(chǔ)，該領(lǐng)域的研究已日益成為科研人員的關(guān)注熱點(diǎn)。

1 蜈蚣草超富集砷的組學(xué)研究

蜈蚣草基因組十分龐大，有研究人員推測(cè)蜈蚣草基因組大小約為4 834 Mb[9]，分別為擬南芥和人類的40倍和1.6倍，且蜈蚣草細(xì)胞組成十分復(fù)雜，包括二倍體、三倍體、四倍體、五倍體和六倍體5種細(xì)胞型[10]，基因組測(cè)序難度巨大，迄今未有基因組信息的報(bào)道。為了在組學(xué)水平上對(duì)蜈蚣草超富集砷的分子機(jī)制進(jìn)行解析，Yan等[11]通過(guò)優(yōu)化后的三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組 (Single-molecular real-time，SMRT) 策略，建立了一個(gè)蜈蚣草的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。作為新一代的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，SMRT測(cè)序的讀長(zhǎng)可達(dá)50 kb，轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度和完整性高于二代測(cè)序技術(shù) (Next-generation sequencing，NGS)，已廣泛應(yīng)用于玉米和高粱等植物的研究中。然而，SMRT測(cè)序的單堿基錯(cuò)誤率較高，對(duì)于有參物種，研究人員通過(guò)參考基因組對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正。由于基因組信息的缺乏，該策略無(wú)法運(yùn)用于蜈蚣草。為了解決這一問(wèn)題，Yan等[11]使用二代測(cè)序NGS高質(zhì)量的短讀長(zhǎng)片段對(duì)SMRT的測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了SMRT測(cè)序的準(zhǔn)確率。通過(guò)優(yōu)化后的二代結(jié)合三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組策略，構(gòu)建了一個(gè)包含69 615個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本、381個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA,lncRNA)、1 482個(gè)可變剪切事件的蜈蚣草全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。

蜈蚣草高效的砷轉(zhuǎn)運(yùn)和區(qū)隔化效率是其超富集砷的重要基礎(chǔ)。為探究蜈蚣草轉(zhuǎn)運(yùn)砷的分子機(jī)制，研究人員對(duì)蜈蚣草砷處理前后地上和地下部分的差異基因進(jìn)行了鑒定，結(jié)合基因注釋、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes) 富集、WGCNA (Gene co-expression network analysis)等分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了砷響應(yīng)的226個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要屬于六大蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)家族：砷抗性蛋白家族(ACR3)、ATP結(jié)合盒 (ABC) 超家族、P型 ATP酶、主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族 (MFS)、水通道蛋白家族MIP和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3.1家族 (NRT3.1)。相比于其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，該六大家族在砷處理后表達(dá)水平極高，暗示其可能作為蜈蚣草轉(zhuǎn)運(yùn)砷的重要成員發(fā)揮作用。

除轉(zhuǎn)錄組外，Shen等[12]利用碘克沙醇 (Iodixanol)密度梯度離心的方法提取了蜈蚣草羽葉液泡膜，并通過(guò)輕重鏈標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)了蜈蚣草羽葉液泡膜蛋白的表達(dá)情況。研究共鑒定得到1 512個(gè)液泡膜蛋白肽段信息，并初步在NCBI綠色植物數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到56種液泡膜蛋白，其中24種為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，7種在砷處理?xiàng)l件下差異表達(dá)。差異表達(dá)的蛋白包括表達(dá)上調(diào)的 TDT family蛋白、TerC family蛋白和PDR-like蛋白 (ABCG 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族)，及表達(dá)下調(diào)的H+pump、V-ATPase C、E和G亞基以及液泡V-PPase。Yan等[11]進(jìn)一步在全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)蜈蚣草液泡膜蛋白質(zhì)組結(jié)果重新注釋，結(jié)果共得到119個(gè)液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其中ATP結(jié)合盒 (ABC) 超家族、水通道蛋白家族MIP、主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族 (MFS)、P型ATP酶這4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族對(duì)砷響應(yīng)且表達(dá)水平最高，暗示其可能在砷的液泡區(qū)隔化中起關(guān)鍵作用。以上研究為闡明蜈蚣草超富集砷的分子機(jī)制提供了新的候選基因，尤其對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)和區(qū)隔化機(jī)制提供了重要參考。

與非超富集植物相比，蜈蚣草的另一個(gè)特點(diǎn)是具有極高的砷抗性，暗示其在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中蘊(yùn)含著特殊的解毒機(jī)制幫助其緩解砷的毒害。通過(guò)對(duì)砷誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類分析，Yan等[11]推測(cè)出兩條新的砷抗性途徑：錯(cuò)誤折疊蛋白降解途徑和谷胱甘肽 (Glutathione，GSH) 代謝途徑。前人研究表明，重金屬可引發(fā)植物細(xì)胞內(nèi)蛋白的錯(cuò)誤折疊，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，造成細(xì)胞損傷[13]。細(xì)胞通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)降解 (Endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD) 途徑與泛素蛋白酶體途徑 (Ubiquitin proteasome pathway，UPP) 特異性地降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊蛋白，緩解重金屬的傷害[14]。通過(guò)蜈蚣草差異轉(zhuǎn)錄組分析，Yan等[11]發(fā)現(xiàn)砷處理后的蜈蚣草中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)的基因并沒(méi)有響應(yīng)，而參與ERAD和UPP通路的基因在地上和地下組織中都上調(diào)表達(dá)。值得注意的是，這些基因在根中的表達(dá)量顯著高于地上部分。根是與環(huán)境中砷直接接觸的組織，錯(cuò)誤折疊蛋白降解途徑的上調(diào)表達(dá)，減少了砷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，保證了根正常代謝活動(dòng)的進(jìn)行，從而使根系具有較強(qiáng)的抗砷能力。

除錯(cuò)誤折疊蛋白降解途徑外，砷與硫醇類化合物的絡(luò)合作用也是許多植物中一種重要的砷解毒機(jī)制[15-16]。有生理實(shí)驗(yàn)表明蜈蚣草中的GSH含量高于非超富集植物，且GSH含量可隨砷處理濃度增加而升高[17-19]。Yan等[11]對(duì)砷處理后相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)砷處理后催化亞砷酸鹽與GSH絡(luò)合的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 表達(dá)上調(diào)。但是 Zhao等[20]在蜈蚣草體內(nèi)僅檢測(cè)到少量As-GSH復(fù)合物的存在。因此，科研人員推測(cè)蜈蚣草中的砷以As-GSH絡(luò)合物的形式進(jìn)入液泡，但是由于液泡不含GST且As-GSH具有高度不穩(wěn)定性，液泡中的絡(luò)合物很快被降解。亞砷酸鹽與GSH的高效絡(luò)合-轉(zhuǎn)運(yùn)-降解途徑可能也是蜈蚣草砷抗性的重要機(jī)制之一。

2 蜈蚣草超富集砷的分子元件

砷在蜈蚣草中的積累主要涉及砷的吸收、砷的還原、砷的運(yùn)輸和砷的區(qū)隔化4個(gè)環(huán)節(jié)[21-24]。土壤中的砷主要以砷酸鹽的形式通過(guò)根的吸收進(jìn)入蜈蚣草體內(nèi)，并在根中還原成亞砷酸鹽[5,25]。進(jìn)入根中的砷少部分被區(qū)隔化到液泡和囊泡中，大部分通過(guò)細(xì)胞水平的短距離運(yùn)輸?shù)竭_(dá)木質(zhì)部附近，并通過(guò)木質(zhì)部的裝載進(jìn)入中柱[26-27]。到達(dá)中柱的砷通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管介導(dǎo)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)竭_(dá)地上部分，并通過(guò)液泡區(qū)隔化作用在羽葉的液泡中聚集[28-29]。目前，砷運(yùn)輸?shù)姆肿釉€未見(jiàn)報(bào)道，其他環(huán)節(jié)均已鑒定得到部分相關(guān)分子元件。

2.1 砷的吸收

環(huán)境中最常見(jiàn)的砷形態(tài)為無(wú)機(jī)態(tài)的砷酸鹽(AsⅤ) 和亞砷酸鹽 (AsⅢ)，AsⅤ是在有氧條件下土壤中主要的砷形態(tài)，但也有少量 AsⅢ存在[30]。蜈蚣草可同時(shí)吸收砷酸鹽和亞砷酸鹽，但對(duì)砷酸鹽的吸收更為高效，研究人員推測(cè)可能是蜈蚣草中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)砷酸鹽的親和力更高[31]。蜈蚣草體內(nèi)砷形態(tài)檢測(cè)結(jié)果表明，在蜈蚣草根中，砷酸鹽為主要形態(tài)，占根中總砷的40%–70%。而在羽葉中，砷大多以亞砷酸鹽的形態(tài)存在，其含量為植株中總砷的70%–90%[32-34]。這表明砷主要以砷酸鹽的形態(tài)被蜈蚣草根吸收，在向羽葉轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中被還原為亞砷酸鹽。

由于砷不是生命體必需的物質(zhì)，尚未在植物中鑒定到砷的特異性吸收系統(tǒng)。砷的吸收途徑都是通過(guò)模擬其他底物利用其轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，例如磷酸鹽通道、葡萄糖和甘油通道等[35]。研究表明蜈蚣草砷酸鹽作為磷酸鹽的類似物，與磷酸鹽的吸收存在明顯競(jìng)爭(zhēng)，增加磷酸鹽處理濃度會(huì)減少蜈蚣草對(duì)砷酸鹽的吸收，增加砷酸鹽處理濃度會(huì)降低根中磷酸鹽含量[36]。以73AsV作為同位素示蹤劑的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蜈蚣草遵循米氏動(dòng)力學(xué)，利用磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收砷酸鹽[37]。

已有研究證明在其他植物，例如水稻和擬南芥中，砷酸鹽可通過(guò)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Pht1(Phosphate transporter 1) 家族成員進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[38-39]。在蜈蚣草中，研究人員克隆得到了3個(gè)Pht1家族成員基因PvPht1;1、PvPht1;2和PvPht1;3[40]。在酵母體系中對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化PvPht1;3的酵母表現(xiàn)出對(duì)砷酸鹽敏感的表型，且對(duì)砷酸鹽的積累量增加，說(shuō)明PvPht1;3蛋白具有砷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)能力。將其與擬南芥AtPht1;5蛋白的功能進(jìn)行比較，結(jié)果表明前者具有比后者更高的砷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)效率。放射性標(biāo)記攝取實(shí)驗(yàn)表明PvPht1;3蛋白對(duì)砷酸鹽的親和力遠(yuǎn)高于 AtPht1;5蛋白，進(jìn)一步表明PvPht1;3是一個(gè)具有高親和的砷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能在蜈蚣草對(duì)砷酸鹽的高效吸收機(jī)制發(fā)揮了重要作用。將PvPht1;3基因在煙草中異源表達(dá)，可增強(qiáng)煙草對(duì)砷酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，提高地上部分對(duì)砷酸鹽的積累量[41]，暗示PvPht1;3基因可作為提高修復(fù)植物對(duì)砷的富集能力的候選基因元件。

在亞砷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，Wang等[36]發(fā)現(xiàn)磷酸鹽的存在不影響亞砷酸鹽的吸收，說(shuō)明砷酸鹽和亞砷酸鹽以不同的方式被根吸收。在植物中，水通道蛋白被證明是植物亞砷酸吸收的主要途徑之一[42]。植物的水通道蛋白超家族極為豐富，包括多個(gè)亞家族，如NIPs (26-like intrinsic proteins)、PIPs (Plasma membrane intrinsic proteins)、TIPs(Tonoplast intrinsic proteins) 等。其中在高等植物如擬南芥、水稻中，NIPs被證明負(fù)責(zé)根部亞砷酸鹽的吸收[27]。在蜈蚣草中，He等[43]克隆到一個(gè)介導(dǎo)亞砷酸鹽吸收的蜈蚣草 TIP類水通道蛋白PvTIP4;1。將PvTIP4;1基因在酵母中進(jìn)行表達(dá)可增加酵母中砷的積累量，表明PvTIP4;1蛋白為砷轉(zhuǎn)運(yùn)通道。進(jìn)一步將PvTIP4;1基因在擬南芥中異源表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)砷敏感且體內(nèi)砷積累量顯著增加。組織和亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，PvTIP4;1蛋白主要定位于蜈蚣草根的質(zhì)膜，推測(cè)PvTIP4;1基因介導(dǎo)蜈蚣草根部亞砷酸鹽的吸收過(guò)程。

2.2 砷的還原

蜈蚣草根中的主要砷形態(tài)為砷酸鹽，羽葉中為亞砷酸鹽，說(shuō)明蜈蚣草砷代謝存在著砷酸鹽還原的過(guò)程[44]。對(duì)蜈蚣草根狀莖的砷形態(tài)檢測(cè)結(jié)果表明，在根的表皮和皮層中，砷主要以AsⅤ形式存在，而從內(nèi)皮層到維管束AsⅢ所占比例增加。因此研究人員推測(cè)根部砷酸鹽的還原主要發(fā)生在根狀莖的內(nèi)皮層。砷從AsⅤ被還原為AsⅢ可能有助于其從根狀莖細(xì)胞中的排出及木質(zhì)部裝載[45]。Wang等[25]的研究發(fā)現(xiàn)在低濃度砷處理的條件下，蜈蚣草根中積累的砷較少，AsⅢ優(yōu)先于AsⅤ被裝載轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部分。但是當(dāng)蜈蚣草根中的砷含量超越了根部的還原能力時(shí)，會(huì)出現(xiàn) AsⅤ和 AsⅢ競(jìng)爭(zhēng)性的裝載轉(zhuǎn)移，無(wú)法在根部還原的AsⅤ會(huì)直接轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部羽葉中，并在羽葉中被還原。

微生物中的砷酸鹽還原機(jī)制已被廣泛研究，在原核生物中，AsⅤ通過(guò)砷酸還原酶 ArsC被還原為AsⅢ[46]。在真核生物釀酒酵母中ACR2砷酸還原酶介導(dǎo) AsⅤ的還原[47]。迄今為止，ArsC蛋白家族在植物中還未有同源蛋白被鑒定得到，但ACR2家族在植物中的同源蛋白，如擬南芥AtACR2以及水稻 OsACR2.1、OsACR2.2等，都被證明具有砷酸還原酶活性，介導(dǎo)了 AsⅤ的還原[48-49]。Ellis等[50]也從蜈蚣草配子體中克隆到了砷酸還原酶基因 PvACR2，將其轉(zhuǎn)入還原酶基因ScACR2缺失的酵母突變體中，可抑制其對(duì)砷敏感和超積累的表型。PvACR2蛋白與ScACR2蛋白具有類似的砷酸還原酶活性，而其在擬南芥中的同源基因CDC25既有砷酸還原酶活性，又有磷酸酶活性，而PvACR2蛋白是一個(gè)缺乏磷酸酶活性的植物砷酸還原酶。另外，PvACR2蛋白在蜈蚣草配子體中的表達(dá)不受砷處理的影響，暗示了蜈蚣草的超富集砷的能力可能是一種組成型適應(yīng)特征，而不是由環(huán)境誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)。

然而，也有研究表明，將AtACR2在擬南芥中敲除或超表達(dá)不影響擬南芥中砷的氧化還原狀態(tài)與擬南芥對(duì)砷的解毒和積累，ACR2在植物中可能不是砷氧化還原的關(guān)鍵酶[51]。另一項(xiàng)研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，并通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析，在擬南芥中鑒定到一個(gè)新型砷酸還原酶 HAC1，可以催化根部外皮層中AsV的還原[52]。該蛋白的在水稻中的同家族成員如OsHAC1;1/2和OsHAC4也被證明是AsV的還原酶，在限制稻穗和籽粒中砷的積累方面起到重要作用[53-54]，在蜈蚣草中尚未見(jiàn)其同源基因的報(bào)道。

此外，Rathinasabapathi等[55]從蜈蚣草cDNA文庫(kù)中克隆了植物磷酸丙糖異構(gòu)酶 (TPI) 的同源基因 Pv4-8，該基因表達(dá)產(chǎn)物具有特異性磷酸丙糖異構(gòu)酶 (TPI) 活性。轉(zhuǎn)化Pv4-8基因的AsV大腸桿菌敏感菌株WC3110對(duì)AsV的抗性增強(qiáng)，且細(xì)胞內(nèi)AsⅢ的積累量高于轉(zhuǎn)入EcTPI基因的菌株。說(shuō)明Pv4-8可能直接或間接參與了蜈蚣草體內(nèi)AsV的還原。Cai等[56]在蜈蚣草中鑒定得到一個(gè)新的砷酸鹽還原酶PvGSTF1。PvGSTF1基因編碼phi類GST蛋白的成員，其表達(dá)量可受砷酸鹽誘導(dǎo)上調(diào)，且可以互補(bǔ)ΔarsC砷酸還原酶大腸桿菌突變體功能。將PvGSTF1蛋白在體外純化，測(cè)定到其具有砷酸還原酶活性，進(jìn)一步證明了PvGSTF1基因在蜈蚣草中起到AsV還原的作用。

2.3 砷的區(qū)隔化

蜈蚣草中轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分的 AsⅢ絕大多數(shù)貯存在羽葉細(xì)胞的液泡膜中。Yang等[57]通過(guò)直接分離細(xì)胞壁、原生質(zhì)體和液泡測(cè)定砷濃度的方法，對(duì)蜈蚣草愈傷組織細(xì)胞中砷的分布進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)愈傷組織中約94%的砷存在于原生質(zhì)體中，其中91%存在于液泡中，表明液泡是蜈蚣草中砷的主要貯藏部位。通過(guò)能量色散 X射線光譜儀 (Energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX) 技術(shù)和X射線吸收譜學(xué) (X-ray absorption spectroscopy，XAS)技術(shù)等觀察砷在蜈蚣草中的亞細(xì)胞原位分布，發(fā)現(xiàn)在砷處理的情況下，絕大部分砷會(huì)通過(guò)區(qū)隔化作用聚集到羽葉的液泡中[29,33,58]。

研究人員在蜈蚣草中鑒定得到2個(gè)ACR3亞砷酸鹽外排基因同源物，分別為 PvACR3和PvACR3;1。2個(gè)同源基因都參與了砷的區(qū)隔化過(guò)程，但具有不同的表達(dá)模式。Indriolo等[59]報(bào)道了蜈蚣草液泡膜定位的PvACR3基因編碼一個(gè)同酵母中同源的亞砷酸鹽外排蛋白，可互補(bǔ)酵母ScACR3缺失突變體的表型，將其在蜈蚣草配子體中敲除可導(dǎo)致配子體對(duì)亞砷酸鹽敏感，說(shuō)明PvACR3基因?qū)︱隍疾菖渥芋w砷耐受性有重要作用。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，PvACR3蛋白定位在配子體液泡膜上，預(yù)測(cè)其可能負(fù)責(zé)將亞砷酸鹽泵到液泡中通過(guò)區(qū)隔化作用進(jìn)行解毒。Chen等[60]將 PvACR3基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，大大增加了砷從根部到地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn) PvACR3基因擬南芥地上部分砷的積累量約為野生型的 7.5倍，為超富集砷的工程植株的開(kāi)發(fā)提供了重要依據(jù)。在蜈蚣草根中，Chen等[61]鑒定得到另一個(gè)液泡膜區(qū)隔化基因PvACR3;1。該基因編碼的蛋白主要定位于液泡膜，介導(dǎo)砷在根部細(xì)胞液泡的區(qū)隔化過(guò)程。將 PvACR3;1基因在擬南芥和煙草中異源表達(dá)，可增加砷在根部的儲(chǔ)存，減少向地上部分的運(yùn)輸。此研究為限制砷在植物地上部分的積累提供了一種潛在策略。

研究人員在蜈蚣草羽葉中還克隆得到一種谷氧還原蛋白PvGrx5[62]，該蛋白可直接或間接地與液泡跨膜蛋白相互作用，影響細(xì)胞內(nèi)亞砷酸鹽積累水平。該研究推測(cè)在蜈蚣草羽葉中，谷氧還蛋白PvGrx5可能通過(guò)調(diào)節(jié)液泡GlpF蛋白的同源物(如液泡內(nèi)在蛋白 TIPs)，從而改變亞砷酸鹽向液泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響蜈蚣草液泡的區(qū)隔化過(guò)程。

Cai等[56]提出了一條類似于細(xì)菌的蜈蚣草砷區(qū)隔化機(jī)制。前人研究表明，在銅綠假單胞菌中存在一種新的砷酸鹽抗性系統(tǒng)，該系統(tǒng)將糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH) 與 MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白耦聯(lián)。GAPDH 可催化 1-砷-3-磷酸甘油酸(1As3PGA) 的形成，絡(luò)合物被外排到細(xì)胞外并水解成砷酸鹽和 3-磷酸甘油酸 (3PGA)，從而達(dá)到解毒的目的。Cai等[56]通過(guò)砷處理前后的蜈蚣草配子體差異轉(zhuǎn)錄組鑒定得到3個(gè)砷處理后表達(dá)顯著上調(diào)的基因，分別編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(PvGAPC1)、有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (PvOCT4) 和谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 (PvGSTF1)。研究表明PvGAPC1蛋白具有極強(qiáng)的砷酸鹽親和力，PvOCT4是一種主要在囊泡上表達(dá)的膜蛋白，PvGSTF1蛋白具有較強(qiáng)的砷酸還原酶活性。將這3個(gè)基因分別在蜈蚣草配子體中敲除，敲除后的配子體均表現(xiàn)出對(duì)砷抗性減弱的表型，暗示這3個(gè)基因是賦予蜈蚣草砷抗性的必要基因。亞細(xì)胞定位表明，PvGAPC1和PvGSTF1蛋白具有相似的定位，在蜈蚣草細(xì)胞中共同定位在與膜結(jié)合的囊泡上。根據(jù)銅綠假單胞菌的抗性機(jī)制，研究人員推測(cè)，在蜈蚣草中，PvGAPC1可將細(xì)胞中的砷酸鹽轉(zhuǎn)化為1-砷-3-磷酸甘油酸，通過(guò) PvOCT4泵入砷代謝囊泡，在囊泡中水解，釋放出砷酸鹽，PvGSTF1將砷酸鹽還原為亞砷酸鹽。最后囊泡與液泡膜融合后將亞砷酸鹽釋放到液泡中，進(jìn)而完成砷的區(qū)隔化過(guò)程。

3 結(jié)論與展望

自砷的超富集植物蜈蚣草被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其超富集機(jī)制的研究多集中在生理生化水平。近年來(lái)，闡明蜈蚣草超富集砷的分子機(jī)制，挖掘應(yīng)用于植物修復(fù)的分子元件已逐漸成為研究的熱點(diǎn)。隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)已逐漸應(yīng)用于蜈蚣草超富集砷的分子機(jī)制研究中，部分參與蜈蚣草超富集砷的分子元件已被鑒定。

在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，蜈蚣草超富集砷的過(guò)程中已被鑒定得到的分子元件如圖1所示：土壤中的 AsⅤ通過(guò)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白 PvPht1;3進(jìn)入根部細(xì)胞，土壤中的 AsⅢ通過(guò)水通道蛋白PvTIP4;1被根部吸收。根部細(xì)胞中的AsⅤ可能經(jīng)由 2種途徑被還原。一種是通過(guò)砷酸還原酶PvACR2，并在磷酸丙糖異構(gòu)酶Pv4-8的參與下還原為AsⅢ。另一種是被PvGAPC1轉(zhuǎn)化為1-砷-3-磷酸甘油酸，通過(guò)PvOCT4泵入砷代謝囊泡，在囊泡中水解并釋放，最后經(jīng)由PvGSTF1被還原為AsⅢ (虛線，推測(cè)途徑)。還原后的AsⅢ小部分可通過(guò)PvACR3;1和PvACR3介導(dǎo)或通過(guò)囊泡與液泡膜的融合 (虛線，推測(cè)途徑) 隔離在根部液泡中，大部分 AsⅢ跟小部分未被還原的 AsⅤ一起分別由未知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白經(jīng)由木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分的羽葉中。在羽葉細(xì)胞中，AsⅤ以與根部細(xì)胞同樣的方式被還原為AsⅢ。AsⅢ在PvACR3的介導(dǎo)下或經(jīng)由囊泡融合隔離在羽葉的液泡中，完成砷在羽葉的富集。

然而，現(xiàn)有研究還存在很多不足，蜈蚣草富集砷的過(guò)程中只有少數(shù)基因被鑒定到，并不能完全闡明其分子機(jī)制，解析蜈蚣草超富集砷的分子機(jī)制任重而道遠(yuǎn)。針對(duì)目前對(duì)蜈蚣草分子機(jī)制研究的不足，對(duì)未來(lái)的研究趨勢(shì)提出了以下幾點(diǎn)展望：1) 蜈蚣草富集砷的4個(gè)環(huán)節(jié)中，砷的吸收、還原、區(qū)隔化3個(gè)環(huán)節(jié)中只有少數(shù)基因的功能被充分表征，砷積累的各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其是運(yùn)輸過(guò)程的功能基因還有待進(jìn)一步探索。蜈蚣草超富集砷的分子調(diào)控機(jī)制也將是未來(lái)重要的研究方向。2)基因組序列信息的缺乏嚴(yán)重限制了對(duì)蜈蚣草中超富集砷的分子機(jī)制的研究。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)蜈蚣草基因組進(jìn)行測(cè)序可為蜈蚣草提供更多的遺傳信息，為超富集砷機(jī)制的研究提供重要的基礎(chǔ)。3) 遺傳轉(zhuǎn)化方法的缺乏嚴(yán)重限制了對(duì)蜈蚣草中超富集砷的分子機(jī)制的研究。建立起蜈蚣草的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，會(huì)極大地促進(jìn)功能基因的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，以及遺傳改良的進(jìn)一步發(fā)展。

圖1 蜈蚣草超富集砷的過(guò)程及分子元件示意圖Fig. 1 Schematic diagram of arsenic hyperaccumulation process and molecular components in P. vittata.