Al^3＋和Cr^6＋對菊芋多酚氧化酶同工酶的酶活影響

黎軍

【摘 要】本文論述采用聚丙烯酰胺電泳法（PAGE），以 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四種濃度不同的凝膠系統(tǒng)分離經(jīng) Al3+ 和 Cr6+ 處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶進行的實驗，用兩種染色配方進行染色比較，并進行酶譜分析，得到的結(jié)果表明：（1）在 T=10% 凝膠系統(tǒng)中菊芋 PPO 同工酶分離效果最好，共有10條酶帶;（2）在兩種染色液配方中，配方一的染色效果較好;（3）經(jīng) Al3+ 處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活比沒有處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活性低，說明 Al3+ 對菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的活性有抑制作用;（4）經(jīng) Cr6+ 處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活與沒有處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活相差不大，說明 Cr6+ 對菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的活性抑制不明顯。

【關(guān)鍵詞】菊芋 聚丙烯酰胺電泳法 多酚氧化酶同工酶? Al3+ Cr6+

【中圖分類號】G? 【文獻標識碼】A

【文章編號】0450-9889（2020）38-0039-03

菊芋，別名鬼子姜、洋姜，菊科（compositae）向日葵屬植物，能形成地下塊莖的多年生草本植物，學名heianthustuberosusl，染色體數(shù) 2N=102，六倍體物種。原產(chǎn)北美洲，經(jīng)歐洲傳入我國。現(xiàn)我國大多數(shù)地區(qū)都栽培種植，是一種抗旱、抗風沙、耐寒、無病蟲害、抗逆性強并具有廣泛適應性的物種，植株高 1—3 米，根系發(fā)達，具有再生性強等特點。據(jù)相關(guān)資料報道，菊芋可用于治理沙漠但未廣泛應用。菊芋能成為沙漠之星與它的生長特性有關(guān)，而它的生長特性與菊芋植物體內(nèi)的酶系統(tǒng)有關(guān)。目前未見有太多關(guān)于菊芋多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，簡稱 PPO）同工酶研究資料的報道。本文運用聚丙烯酰胺電泳及活性染色方法，對菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶酶譜進行分析，為尋找與菊芋特殊生命力有關(guān)的酶提供基礎(chǔ)資料，并為菊芋能作為治理干旱地區(qū)的植物之一提供一些生理化指標。

一、材料與試劑

（一）材料

實驗材料：菊芋。

菊芋的預處理：種植 14 盆菊芋幼苗，每 2 盆作為 1 個編號，分別編號 1，2，3，4，5，6，7。其中，1 號為對照，只澆清水，不用作其他任何處理。用 Al2（SO4）3 分別配成濃度為 50 umol/L，100 umol/L，200 umol/L 的溶液各適量，分別澆在 2，3，4 號植株中，每次各 50 ml，每隔 3 天澆一次，共要澆 4 次。用 K2Cr2O7 分別配成濃度為 50umol/L，100umol/L，200 umol/L 的溶液各適量，分別澆在 5，6，7 號植株中，每次各 50 ml，每隔 3 天澆一次，共要澆 4 次。

（二）藥品

丙烯酰胺（Acr，廣州醫(yī)藥站化學試劑公司），N N 一甲雙叉丙烯酰胺（Bis，F(xiàn)luka），過硫酸胺（Ag，廣東汕頭新寧華工廠），三羥基甲基氨基甲烷（Tris，成都化學試劑廠），氨基乙酸（Gly，廣東汕頭新寧華工廠），四甲基乙二胺（TEMED，東京化成工業(yè)株式會社），分析純鹽酸。

染色藥品：鄰苯二胺（O—phen，上海試劑總廠第三分廠），對苯二胺（P—phen，上海五聯(lián)化工廠），鄰苯二酚（Pyro，上海試劑總廠第三分廠），草酸（Dxal，廣東汕頭西隴化工廠），蔗糖（Sucr，廣州化學試劑廠），磷酸氫二鈉（Diso，廣東汕頭西隴化工廠），磷酸二氫鈉（上海新華化工廠）。

（三）儀器

離心機（TGL—16 型，上海醫(yī)療機器六廠），電泳儀（702B型上海市醫(yī)藥公司）。

二、方法

（一）酶液的提取

稱取菊芋成熟葉子 200mg，置于預冷的小研缽中，加 0.05mol/L Tris-HCL（PH=8.0）提取緩沖液 1 ml，在冰浴中研磨成勻漿，然后冷凍離心（12000/min）20 min，棄沉淀，收集上清液為粗酶液并滴加 10% 蔗糖溶液 2 滴保存于冰箱中備用。

（二）凝膠的制備

制備聚丙烯酰胺凝膠。凝膠配制系統(tǒng)，如表 1 所示（見下頁）。

（三）加樣

用微量進樣器上樣。菊芋 PPO 同工酶用 T=10% 膠濃度進行電泳，每管上樣量為 60ul。電泳上樣前在酶液中加入 1 滴 0.1% 溴酚藍，混勻后上樣。

（四）電泳

開始電泳時采用穩(wěn)壓 49V，25 分鐘后，電壓加大為 149V，電泳在常溫下進行，時間約需 2.5 小時。

（五）染色

當樣品從（-）電泳到距（+）還有大概 1 厘米的時候，用注射器吸取蒸餾水注射到玻璃管中使凝膠從玻璃管中滑出，分別放到干凈試管中，然后現(xiàn)配染色液。配染色液采用的染色配方有兩種：

配方一：按 0.06% 對苯二胺（用適量 0.01M 草酸溶解后再加蒸餾水混合）∶1% 鄰苯二酚∶0.05M 磷酸緩沖液（PH=6.8）=1∶6∶1（V/V）配制，將配好的染色液加入各個試管中（染色液要浸過凝膠），待染色 15—20 分鐘后觀察酶帶的出現(xiàn)情況，待酶帶較為清晰的時候倒去染色液，加 2% 的醋酸浸泡，保存，拍照。

配方二：按 0.06% 鄰苯二胺（用適量 0.01M 草酸溶解后再加蒸餡水混合）：1% 鄰苯二酚：0.05M 磷酸緩沖液（PH=6.8）=1∶6∶1（V/V）配制，將配好的染色液加入各個試管中（染色液要浸過凝膠），待染色 15—20 分鐘后觀察酶帶的出現(xiàn)情況，待酶帶較為清晰的時候倒去染色液，加 2% 的醋酸浸泡，保存，拍照。

（六）Al3+，Cr6+ 對菊芋處理后的菊芋 PPO 同工酶酶活性的測定

方法：以 50 m mol/L 的鄰苯二酚（磷酸緩沖液，pH=6.5）為底物，加入適量的酶液，作用 5 分鐘后測產(chǎn)物在 420 nm處的吸光度，直接用吸光度表示酶活大小。

步驟：3 ml 酶液+5ul 顯色劑（鄰苯二酚），5 分鐘后測得A420 的值。

三、結(jié)果與分析

（一）菊芋 PPO 在不同凝膠濃度中和在不同染色配方中的電泳圖譜

1.菊芋 PPO 同工酶酶譜如圖 1 所示，在 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四種不同膠濃度中分別見到 9，10，8，7條 PPO 同工酶酶帶。在 T=15% 分離膠中僅見 7 條 PPO 同工酶酶帶，說明膠孔隙太小不能使分子量相近、形狀相似的同工酶分開。在 T=13% 中膠孔隙比在 T=15% 稍大，見到 8 條 PPO 同工酶酶帶，比 T=15% 膠多一條帶，在 T=7.5% 膠孔隙比在 T=13% 更大，見到 9 條 PPO 同工酶帶，比 T=15% 和 T=13% 分別多 2 條、1 條。而在 T=10% 中見到 PPO 同工酶酶帶有 10 條，可知在此濃度中 PPO 同工酶酶帶分辨率最高，分離效果最好。

2.在圖 1 中，Al，Bl，Cl，Dl 用的染色配方為染色配方一，染出帶數(shù)為 9，10，8，7。在 A2，B2，C2，D2 中，染色配方為染色配方二，染出帶數(shù)為 9，10，8，7。第二種染色配方相比于第一種染色配方，其染色酶帶清晰度低于第一種染色配方，可見第一種染色配方的染色效果較好。

（二）不同上樣量的菊芋 PPO 電泳圖譜

不同上樣量的菊芋 PPO 電泳圖譜如圖 2 所示，其中 A，B，C 上樣量分別為 50ul，60ul，70ul，經(jīng)染色后 A 有 9 條酶帶，B 和 C 各有 10 條酶帶，但其中 B 的酶帶比 C 中的酶帶較清晰，可知 60ul 的上樣量使酶帶分辨率更高，分離效果更好。

（三）Al3+，Cr6+ 對菊芋 PPO 同工酶酶活性的影響

由 Al3+，Cr6+ 對菊芋處理后的菊芋 PPO 同工酶酶活性的測定方法測得結(jié)果如表 2 所示（見下頁）。

由表 2 的數(shù)據(jù)可知，受處理過的 2，3，4 號的 PPO 同工酶的酶活受到 Al3+ 的影響酶活明顯下降;受處理過的 5，6，7 號的 PPO 同工酶的酶活受到 Cr6+ 的影響酶活變化不是很明顯。

（四）Al3+，Cr6+ 對菊芋中 PPO 同工酶電泳圖譜的影響

1.由圖 3 可以知道：（1）當菊芋經(jīng) Al3+ 處理過后，它的電泳圖譜對照 1 號為 10 條酶帶;2，3，4 號的酶帶數(shù)分別為 9 條、8 條、7 條;2 號樣比 1 號樣少第 P7 條帶，3 號樣比 1 號樣少第 P4 和 P7 兩條帶，4 號樣比 1 號樣少第 P4、P6、P7 三條帶，帶數(shù)是呈遞減趨勢，酶帶顏色也逐漸變淺，酶帶粗度相對變小。原因可能是隨著 A13+ 的加入和濃度的增加，菊芋中的 PPO 及其同工酶的酶活性明顯降低，同時說明，Al3+ 對菊芋的生長影響較大。如果菊芋在生長環(huán)境中大量吸收 Al3+，那么 Al3+ 會抑制 PPO 及其同工酶的活性，極大降低菊芋的抗病性，不利于菊芋的生長。

2.菊芋經(jīng) Cr6+ 處理過后，它的電泳圖譜 5，6，7 號的酶帶數(shù)分別為 9，10，9;5 號樣比 1 號樣少第 P7 條帶，7 號樣比 1 號樣少第 P7 條帶，帶數(shù)變化不大，酶帶顏色變化不大，酶帶粗度相差也不大。這表明 Cr6+ 對菊芋的 PPO 及其同工酶的活性影響不是太明顯，但大量吸收也會破壞菊芋 PPO 及其同工酶的抗病性，不利菊芋的生長。

3.第 P7 條帶受 Al3+ 和 Cr6+ 的影響最大，其敏感性最強。其次為 P4 和 P6 兩條帶。

4.在七個樣品中，它們的 Pl、P2、P3 三條帶的顏色最深，說明它們的酶活力最大。

四、結(jié)論與討論

同工酶是指生物體內(nèi)催化相同反應，但分子結(jié)構(gòu)不同的一組酶。同工酶（蛋白質(zhì)）在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率不同，能反映它們在分子大小上的差異。大多數(shù)基因性同工酶（由不同基因產(chǎn)生的肽鏈而衍生的同工酶）常表現(xiàn)不同的生理功能。同工酶既可以作為生理指標，又可以作為可靠的遺傳指標。我們可以根據(jù)同工酶譜的變化，來鑒別生物類別及其親緣關(guān)系。在生物學中，同工酶可用于研究組織分化、個體發(fā)育、遺傳變異、物種進化、雜交育種等。

多酚氧化酶（PPO）是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱，是自然界分布極廣的一種金屬蛋白酶，也是一類氧化還原酶。普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中。目前科研人員已對多酚氧化酶與生物體抗病性之間的關(guān)系進行了大量的研究。植物中的多酚氧化酶能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對應的醌類化合物，進而發(fā)揮抗菌和驅(qū)趕捕食者的作用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是讓所分離的物質(zhì)帶上負電，然后根據(jù)所帶的負電荷數(shù)的不同、分子量大小的不同、分子形狀的不同，以及分子通過三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠時因遷移率的不同從而分離出同工酶。凝膠濃度的大小、pH 的大小、電極緩沖液離子強度的高低都會對分離結(jié)果造成一定的影響，使電泳結(jié)果產(chǎn)生或多或少的誤差。通過反復電泳實驗探究和實驗結(jié)果驗證，需注意以下幾方面：（1）凝膠貯液使用前應過濾 1～2 次，便于除去藥品中的雜質(zhì)。（2）凝膠貯液從冰箱中取出，應過 20 分鐘以后再用，可以避免因熱脹冷縮而在凝膠柱中形成氣泡，影響實驗結(jié)果。（3）電泳時間應控制在 2～3 小時之間，時間過長，玻璃管發(fā)熱，酶帶擴散，出現(xiàn)拖尾。（4）PPO 宜在 149V～200V 低壓電泳，電壓過高，電泳時間過短，不利于分子量相近的同工酶分離。

在 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四種不同凝膠系統(tǒng)中，T=10% 的凝膠系統(tǒng)最適合菊芋中多酚氧化酶（PPO）同工酶的分離，其分離結(jié)果最清晰，效果最好。

在 T=10% 的凝膠系統(tǒng)中，上樣量為 60 ul 的分離效果最好，酶帶最為清晰。

在兩種染色配方中，配方一的染色效果比配方二清晰。

經(jīng)過 Al3+ 處理過的菊芋中的 PPO 同工酶活性明顯受到抑制，而經(jīng)過 Cr6+ 處理過的菊芋中的 PPO 同工酶活性影響不明顯。其中，第 P7 條帶受 Al3+ 和 Cr6+ 的影響最大，敏感性最強，其次為 P4 和 P6 兩條帶。在七個樣品中，它們的 P1，P2，P3 三條帶的顏色最深，說明它們的酶活力最大。

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（責編 盧建龍）