Hg2+對中國鱟幼體急性毒性及MT的誘導(dǎo)效應(yīng)

鮑虞園，葉國玲，鐘金香，陳海剛，李銀康，關(guān)杰耀，頡曉勇,*

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306 3. 廣東省土地調(diào)查規(guī)劃院，廣州 510075 4. 北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，欽州 535011

汞(Hg)是一種廣泛而持久存在的有毒重金屬污染物，是人和其他動物的非必需元素[1-2]。汞被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署列為全球性污染物，是除了溫室氣體外唯一一種對全球范圍產(chǎn)生影響的化學(xué)物質(zhì)，具有跨國污染的屬性，已成為全球廣泛關(guān)注的環(huán)境污染物之一[3]。自然水體中的汞主要源于大氣沉降和未經(jīng)處理的工業(yè)廢水(冶金、化工和顏料等)、生活污水、含汞農(nóng)藥、化肥及糞便等[4-5]。雷富等[6]對北部灣近岸海域海水中重金屬污染的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，汞含量變化范圍為0.013～0.237 μg·L-1，平均值為0.043 μg·L-1，超標(biāo)率為19.6%，存在潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。水環(huán)境中的汞不能被生物降解[7]，會通過抑制水生動物抗氧化酶活性來影響其防御系統(tǒng)[8]，引起機(jī)體損傷[9]，短暫暴露于高濃度汞會導(dǎo)致水生動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)、免疫力降低和代謝紊亂，并妨礙其生長和發(fā)育[10-11]。低濃度汞也具有很大毒性，水生動物通過呼吸和攝食等行為富集水體汞[12]，轉(zhuǎn)化為毒性更大的有機(jī)態(tài)，通過食物鏈危害人畜。20世紀(jì)50年代，日本水俁市周圍海域被工廠廢液中甲基汞大量污染，食用魚、蝦和蟹等水產(chǎn)品的人們出現(xiàn)水俁病[13]。這證明了汞被水生生物吸收后不僅危害這些生物自身的生長繁殖，而且可以通過食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)一步危害到人類的健康和生存。

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類普遍存在于生物體內(nèi)的低分子量(6～7 kDa)、富含半胱氨酸、熱穩(wěn)定性和可誘導(dǎo)型非酶蛋白[14]。MT的主要特點(diǎn)是在轉(zhuǎn)錄水平上易被環(huán)境中的重金屬所誘導(dǎo)，而且這種誘導(dǎo)與重金屬濃度具有相關(guān)性，可以反映環(huán)境中的重金屬含量水平[15]。Fang等[16]的研究表明，汞暴露顯著改變了四角蛤蜊消化腺外套膜和鰓中的MT mRNA的轉(zhuǎn)錄，MT含量隨Hg2+劑量上升而上升。因此，通過監(jiān)測生物體內(nèi)MT含量變化，可預(yù)測生物體受重金屬暴露的狀況和重金屬的污染壓力[17]。MT可作為重金屬污染物、潛在重金屬污染暴露和毒性效應(yīng)早期預(yù)警的主要生物標(biāo)志物，以及作為環(huán)境中重金屬污染脅迫與風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)以及監(jiān)測的分子生態(tài)毒理學(xué)診斷指標(biāo)。這對制定預(yù)防性的管理措施和及時(shí)監(jiān)控環(huán)境污染具有重要的指導(dǎo)意義。

中國鱟(Tachypleustridentatus)是具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值、藥用價(jià)值和科研價(jià)值的古老“活化石”[18]，現(xiàn)主要分布在我國北部灣海域。近30年來，因?yàn)槿斯ご笏敛稓⒃斐闪酥袊c數(shù)量急劇降低，而環(huán)境污染也使其繁殖生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，該物種瀕臨滅絕。2019年3月，世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)正式將中國鱟在IUCN紅色名錄中的等級從原本的數(shù)據(jù)缺乏更新為瀕危。目前該物種的生態(tài)毒理學(xué)研究匱乏，本研究采用靜水生物測試法研究了汞對中國鱟幼苗的急性毒性，同時(shí)測定了急性暴露96 h后幼鱟體內(nèi)MT含量的變化，目的在于了解Hg2+對中國鱟幼苗的安全濃度并初步探討MT的解毒效應(yīng)和作為重金屬污染生物標(biāo)志物的可行性，針對自然水體對幼鱟的安全性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，同時(shí)為漁業(yè)部門制訂水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

中國鱟幼苗：于2018年5—10月在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所湛江中國鱟研究基地人工繁育所得。選擇反應(yīng)靈敏、大小一致的中國鱟幼體在室內(nèi)水族箱中馴養(yǎng)7 d用于試驗(yàn)，經(jīng)測定，供試幼鱟個(gè)體鮮質(zhì)量為(0.028±0.002) g，頭胸甲寬(0.581±0.026) cm。

實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)過濾消毒的自然海水，鹽度為27～30，pH為7.6～7.8，溶氧不低于4 mg·L-1，水質(zhì)符合《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB11607—89)[19]。實(shí)驗(yàn)所用HgCl2為分析純(國藥集團(tuán)上海有限公司)；預(yù)先用去離子水配制為1 g·L-1的母液，于4 ℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用海水進(jìn)行稀釋。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

實(shí)驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度為26 ℃，晝夜時(shí)間比14 h∶10 h，采取靜水生物測試法，實(shí)驗(yàn)期間不更換實(shí)驗(yàn)液，為確定實(shí)驗(yàn)用液質(zhì)量濃度的大致范圍，先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)的HgCl2質(zhì)量濃度設(shè)定5個(gè)梯度,分別為0.005、0.05、0.5、5和50 mg·L-1。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果24 h絕對致死濃度(24 h-LC100)及96 h最大非致死濃度(96 h-LC0)確定正式實(shí)驗(yàn)濃度范圍，按等對數(shù)間距設(shè)立6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(0.500、0.997、2.000、3.990、7.962和16.00 mg·L-1)及1個(gè)對照組，每組3個(gè)平行。每個(gè)平行組放入10只幼鱟。試驗(yàn)過程中，前8 h連續(xù)觀察幼鱟的行為狀況和中毒癥狀，記錄個(gè)體的死亡時(shí)間及死亡數(shù)，及時(shí)撈出死亡個(gè)體。死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)為用玻璃棒連續(xù)觸碰剌激個(gè)體無任何反應(yīng)即視為死亡。

根據(jù)《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB11607—89)[19]中汞濃度≤0.0005 mg·L-1，同時(shí)結(jié)合急性毒性實(shí)驗(yàn)的96 h半數(shù)致死濃度(96 h-LC50)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組質(zhì)量濃度為0.005、0.025和0.250 mg·L-1和對照組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行放置60尾中國鱟幼苗，整個(gè)試驗(yàn)持續(xù)96 h，試驗(yàn)期間不投喂。在試驗(yàn)進(jìn)行0、24、48、72和96 h時(shí)從每個(gè)燒杯中取幼鱟活體10尾，放入清潔海水中，洗去表面的污垢和重金屬，放入離心管，置于-80 ℃超低溫冰箱中，以備測定MT。

1.3 MT含量測定

將凍存的樣品于低溫下解凍，用預(yù)冷的生理鹽水沖凈，再用濾紙吸去表面水分，稱取適量的樣品，按m∶m=1∶10加入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴條件下，用超聲波進(jìn)行勻漿。勻漿液用冷凍離心機(jī)在4 000 r·min-1下離心10 min，取上清液置于4 ℃下保存，24 h內(nèi)測定完畢。

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定MT含量[20]。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，操作按試劑盒說明進(jìn)行。試劑盒在室溫放置30 min后打開，首先用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，測定吸光值，繪制MT標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后向酶標(biāo)板依次加入待測樣品、生物素標(biāo)記的抗-MT抗體、鏈霉親和素-HRP；酶標(biāo)板經(jīng)洗板機(jī)洗板后，加顯色劑，振蕩混勻后，避光顯色10 min；加終止劑50 μL終止反應(yīng)；10 min內(nèi)用Biorad xMark酶標(biāo)儀在450 nm波長測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MT含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，利用概率單位法計(jì)算出24、48、72和96 h的LC50，求出死亡率概率單位與實(shí)驗(yàn)液質(zhì)量濃度對數(shù)的回歸方程[21]；安全質(zhì)量濃度(mg·L-1)按下式計(jì)算[22]：

目前，鉀肥市場總體供應(yīng)量減少，但鉀肥需求支撐較弱，新單采購意愿不強(qiáng)。復(fù)合肥企業(yè)正處于秋季備肥生產(chǎn)周期，將對鉀肥市場起到需求支撐作用；全球鉀肥市場供給偏緊，貿(mào)易商探漲可能仍存。預(yù)計(jì)短期內(nèi)國內(nèi)氯化鉀價(jià)格將高位持穩(wěn)，重點(diǎn)關(guān)注國內(nèi)鉀肥大合同談判情況。

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比較法對不同濃度組間的MT含量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05為差異顯著)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Results)

2.1 中國鱟幼體的中毒癥狀

實(shí)驗(yàn)開始后，不同質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)組的中毒現(xiàn)象存在明顯差異，具體表現(xiàn)為濃度為0.500 mg·L-1和0.997 mg·L-1的HgCl2溶液對實(shí)驗(yàn)個(gè)體的毒性作用不明顯，與對照組基本相同，受試個(gè)體在入液后沒有表現(xiàn)明顯的不適反應(yīng)，于容器中仰泳3～5 min后靜置于試驗(yàn)容器底部，少數(shù)緩慢游動或爬行；而16.000 mg·L-1濃度組中實(shí)驗(yàn)個(gè)體的中毒癥狀明顯，受試個(gè)體入液后顯得十分不安，在燒杯內(nèi)上下游動，時(shí)有與杯壁碰撞現(xiàn)象，經(jīng)過約40 min適應(yīng)才趨于安靜、沉于底部。濃度為0.500 mg·L-1和0.997 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組幼鱟24 h內(nèi)無明顯異常和死亡，24 h后個(gè)別幼鱟活動緩慢，甚至不活動，逐漸出現(xiàn)個(gè)體死亡。其他濃度組實(shí)驗(yàn)個(gè)體隨著時(shí)間延長，在容器內(nèi)的活動能力明顯減弱，伏于底部，活動頻率顯著降低。實(shí)驗(yàn)開始后8 h，16.000 mg·L-1濃度組個(gè)體僅附肢尚可顫動，對外界刺激(用玻璃棒刺激)反應(yīng)也變得較為遲鈍，約10 h，16.000 mg·L-1濃度組首先出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。濃度為2.000、3.990和7.962 mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過3～5 h后才陸續(xù)出現(xiàn)死亡。死亡個(gè)體腹部微微翹起，附肢逐漸松弛呈伸展?fàn)?，鰓書呈打開的書本狀。

2.2 Hg2+對中國鱟幼體的急性毒性

急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度重金屬溶液對幼鱟造成不同程度傷害，隨Hg2+濃度的增加，幼鱟死亡率呈逐漸上升趨勢，直至全部死亡。對各試驗(yàn)組中受試幼鱟死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算死亡率。根據(jù)表1結(jié)果計(jì)算得知，不同暴露時(shí)間下幼鱟累計(jì)死亡率(y)與Hg2+質(zhì)量濃度對數(shù)(x)的關(guān)系均為直線回歸，兩者之間具有較好相關(guān)性；進(jìn)一步計(jì)算可得24、48、72和96 h-LC50以及安全質(zhì)量濃度(SC)，結(jié)果如表2所示。結(jié)合表1和表2結(jié)果可知，Hg2+質(zhì)量濃度≤2.000 mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組96 h的累積死亡率均<50%，最高劑量組(16.000 mg·L-1)96 h的累積死亡率接近100%。Hg2+質(zhì)量濃度≤0.997 mg·L-1時(shí)，24 h內(nèi)幼鱟反應(yīng)與對照組無明顯差異，未見死亡；隨著Hg2+濃度增大或?qū)嶒?yàn)時(shí)間延長各實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)死亡，且死亡率逐步上升，其24 h-LC50為15.013 mg·L-1。同一Hg2+質(zhì)量濃度組的幼鱟，隨著時(shí)間延長毒性效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，死亡率明顯上升。而相同時(shí)間內(nèi)不同Hg2+質(zhì)量濃度組的幼鱟，隨著質(zhì)量濃度增大，毒性效應(yīng)增強(qiáng)，死亡率上升，其48 h-LC50為7.084 mg·L-1。由表2可知，半致死質(zhì)量濃度隨暴露時(shí)間的增加而越來越小，72 h和96 h-LC50分別為4.008 mg·L-1和2.683 mg·L-1，安全質(zhì)量濃度為0.473 mg·L-1。

2.3 Hg2+對中國鱟幼體MT含量的影響

由圖1可知，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，對照組中國鱟幼苗體內(nèi)MT含量變化范圍為(5.20±0.16)～(5.47±0.25) ng·mL-1，表明在沒有外源重金屬誘導(dǎo)時(shí)，幼鱟體內(nèi)MT含量相對比較穩(wěn)定。隨著Hg2+濃度升高，幼鱟體內(nèi)MT含量均呈顯著變化(P<0.05)。在設(shè)定的3個(gè)濃度處理中，不同濃度Hg2+均能顯著誘導(dǎo)MT產(chǎn)生(P<0.05)，處理組MT含量為對照組的1.152倍～1.716倍，其中以0.025 mg·L-1組72 h的MT誘導(dǎo)量最高，為(8.93±0.16) ng·mL-1?？v向比較可知，在0.005～0.250 mg·L-1Hg2+溶液中暴露24 h的中國鱟幼苗體內(nèi)MT含量隨Hg2+濃度增大而增大，但只有0.250 mg·L-1組顯著高于對照組。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到48、72和96 h，隨著Hg2+濃度增大，幼鱟體內(nèi)MT含量表現(xiàn)為先增后減，均是在Hg2+濃度為0.025 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，分別為(7.77±0.21)、(8.93±0.16)和(8.87±0.20) ng·mL-1。該結(jié)果表明，不同濃度Hg2+均具有誘導(dǎo)MT的能力，但是當(dāng)Hg2+濃度過高則會降低誘導(dǎo)能力甚至抑制。

表1 Hg2+急性脅迫下中國鱟幼體死亡率Table 1 Cumulative mortality of larva of T. tridentatus after acute exposure to Hg2+

表2 Hg2+對中國鱟幼體急性毒性及回歸分析Table 2 Linear regression analysis of Hg2+ acute toxicity on larva of T. tridentatus

圖1 不同濃度Hg2+脅迫下中國鱟幼苗體內(nèi)金屬硫蛋白(MT)含量隨暴露時(shí)間的變化注：*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Effects of different concentrations of Hg2+ on metallothionein (MT) content in tissues of larva of T. tridentatusNote: *represents statistical significance (P<0.05) compared to the control.

在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)Hg2+誘導(dǎo)產(chǎn)生MT的含量隨著作用時(shí)間延長而不同程度升高。在0.025 mg·L-1的Hg2+脅迫下，72 h內(nèi)幼鱟體內(nèi)MT含量顯著升高(P<0.01)，在72 h時(shí)達(dá)到最高含量，為(8.93±0.16) ng·mL-1，72 h后變化不顯著(P>0.05)，稍有下降。低濃度組(0.005 mg·L-1)和高濃度組(0.250 mg·L-1)脅迫下，幼鱟體內(nèi)MT含量隨著作用時(shí)間延長持續(xù)增長，在96 h時(shí)達(dá)到最高含量，分別為(7.66±0.13) ng·mL-1和(8.35±0.35) ng·mL-1。試驗(yàn)開始后24 h內(nèi)，幼鱟體內(nèi)MT含量增加量與重金屬Hg2+質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。24 h時(shí)，幼鱟體內(nèi)MT含量增加量與Hg2+濃度(cHg)的回歸方程為Y(ΔMT, ng·mL-1)=6.686X(cHg, mg·L-1)+0.123 (r2=0.940,n=4)。24 h內(nèi)各試驗(yàn)濃度組幼鱟體內(nèi)MT含量增加速率為0.006～0.074 ng·mL-1·h-1。試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度的Hg2+脅迫下，幼鱟體內(nèi)MT含量變化在0～24 h內(nèi)呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

3 討論(Discussion)

3.1 Hg2+對中國鱟幼體的急性毒性效應(yīng)及安全濃度評價(jià)

汞是水環(huán)境中最常見最危險(xiǎn)的重金屬污染物之一，低濃度汞就具有較大毒性，進(jìn)入水環(huán)境后隨食物鏈累積，轉(zhuǎn)化為毒性更大的有機(jī)態(tài)，有機(jī)汞不僅危害水生生物，還通過食物鏈的生物放大和累積作用大量富集[24]。不同海洋節(jié)肢動物對汞離子的敏感性存在一定差異，與其他海洋節(jié)肢動物早期發(fā)育階段相比，中國鱟幼體對汞的耐受性相對更高。李建軍等[25]研究發(fā)現(xiàn)Hg2+對黑褐新糠蝦(Neomysisawatschensis)的24、48、72和96 h-LC50分別為0.161、0.150、0.150和0.150 mg·L-1。張亞娟等[26]的研究表明，Hg2+對日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)的24、48、72和96 h-LC50分別為0.0602、0.0524、0.0476和0.0380 mg·L-1。趙艷民[27]研究發(fā)現(xiàn)，水體汞對中華絨鰲蟹(Eriocheirsisensis)幼蟹的24、48、72和96 h-LC50分別為0.6248、0.5716、0.5332和0.4423 mg·L-1。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明中國鱟幼苗對于Hg2+的耐受性較強(qiáng)。幼鱟對其他重金屬也表現(xiàn)出較高耐受性，在銅和鋅的短期急性脅迫中[28]，Cu2+對美洲鱟幼體的72-LC50高達(dá)到637 mg·L-1，而Zn2+對美洲鱟幼體的72 h-LC50遠(yuǎn)超過1 000 mg·L-1。推測該結(jié)果源于中國鱟作為一種底棲雜食“活化石”，受到重金屬脅迫機(jī)會比較大，從而產(chǎn)生一定的抗性所致。鱟的胚胎和幼體可以在潮間帶的嚴(yán)峻環(huán)境下生存，可以耐受低氧和鹽度、溫度的極端變化[29]。鱟對污染物的抗性可能與其某些生理機(jī)制有關(guān)，需要從生理和代謝等角度開展更多研究。

表3 急性水環(huán)境毒性分級標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Toxicity grading standard for acute toxicity test

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Hg2+對中國鱟幼苗的安全質(zhì)量濃度為0.268 mg·L-1，明顯高于Hg2+對斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)仔蝦(0.019 mg·L-1)、南美白對蝦(Litopenaeusvanname)幼體(0.123 mg·L-1)和鋸緣青蟹(Scyllaserrata)成體(0.068 mg·L-1)等其他海洋節(jié)肢動物的安全質(zhì)量濃度[27]。同時(shí)也遠(yuǎn)高于《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB11607—89)[19]所規(guī)定的指標(biāo)(≤0.0005 mg·L-1)，表明中國鱟幼苗對Hg2+具有很高耐受性。本實(shí)驗(yàn)中Hg2+對中國鱟幼苗的安全濃度是在Hg2+單獨(dú)作用下的結(jié)果，天然水體中通常同時(shí)存在多種懸浮物、污染物和有機(jī)質(zhì)等[30]。因此，生產(chǎn)實(shí)踐中可能出現(xiàn)的多種環(huán)境因子與Hg2+的聯(lián)合毒性作用仍需進(jìn)一步深入研究。

3.2 Hg2+對中國鱟幼苗體內(nèi)MT含量的影響

MT具有調(diào)節(jié)微量元素儲存、運(yùn)輸和代謝作用，對重金屬具有解毒作用。由圖1可知，各實(shí)驗(yàn)組幼鱟體內(nèi)MT含量與暴露時(shí)間之間均表現(xiàn)出不同程度的正相關(guān)，在96 h后，各濃度組幼鱟體內(nèi)MT含量均顯著高于對照組。推測該結(jié)果是由于暴露組的幼鱟受到進(jìn)入機(jī)體的重金屬離子脅迫后，組織通過合成新的MT，與進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的Hg2+結(jié)合，將其轉(zhuǎn)化為無毒形式，從而防止重金屬離子對機(jī)體的損傷，與對貽貝的研究結(jié)果相似[31]。其他研究也得到相似結(jié)果，如牡蠣幼蟲對重金屬等污染物高度敏感，當(dāng)其受精卵暴露于重金屬Cu2+和Cd2+環(huán)境中孵化后，幼蟲體內(nèi)MT含量顯著增加[32]；凡納濱對蝦肝胰腺中MT含量隨金屬離子濃度的增加和暴露時(shí)間的延長而顯著變化(P<0.05)[33]。

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)開始的前24 h，0～0.250 mg·L-1Hg2+暴露下中國鱟幼苗體內(nèi)MT含量隨Hg2+濃度增大而增大，而48 h后幼鱟體內(nèi)MT含量隨Hg2+增大呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)前期暴露時(shí)間較短，較高濃度的Hg2+有利于誘導(dǎo)MT產(chǎn)生，而隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，幼鱟體內(nèi)合成的MT與Hg2+趨于飽和。較低濃度的Hg2+脅迫下，組織尚能通過不斷合成MT與Hg2+結(jié)合，減少對機(jī)體的毒性作用。而MT和金屬的結(jié)合是有限度的[34](1 mol MT分子通常結(jié)合7 mol Hg)，過多的重金屬進(jìn)入生物體后，超過MT的結(jié)合能力，大量游離態(tài)金屬離子對生物體產(chǎn)生明顯毒性效應(yīng)，包括MT在內(nèi)的金屬結(jié)合蛋白的合成過程也會受到嚴(yán)重抑制，導(dǎo)致MT含量不再增加甚至出現(xiàn)降低的現(xiàn)象[35]。

3.3 幼鱟MT誘導(dǎo)量與Hg2+暴露濃度和暴露時(shí)間的相關(guān)性分析

Amiard等[36]發(fā)現(xiàn)，MT可被某些必需金屬元素(Cu和Zn)和非必需金屬元素(Cd和Hg等)顯著誘導(dǎo)，MT的誘導(dǎo)量與環(huán)境中的金屬污染水平相關(guān)。因此，可以通過野外調(diào)查采集海洋生物組織中MT含量，判斷海域受重金屬污染的程度[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，較低濃度Hg2+即可引發(fā)幼鱟體內(nèi)MT含量顯著增加，可見幼鱟MT對水體中Hg2+具有較高敏感性。需要特別指出的是Hg2+濃度與MT含量之間并非始終存在線性關(guān)系，只對一定范圍的暴露濃度和暴露時(shí)間表現(xiàn)為線性響應(yīng)。

北部灣潮間帶灘涂是中國鱟幼體的重要棲息地。熊丹等[39]對北部灣潮間帶表層沉積物中汞含量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，研究區(qū)域各站位潮間帶表層沉積物汞含量介于0.025～0.126 mg·kg-1之間，平均值為0.061 mg·kg-1。而海水中汞含量范圍為0.013～0.237 μg·L-1，平均值為0.043 μg·L-1[6]，且汞的年際變化呈明顯上升趨勢[40]，值得關(guān)注。因此，可利用幼鱟機(jī)體MT指標(biāo)評價(jià)不同潮間帶海水環(huán)境對于中國鱟種群所造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)初步評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)揭示室內(nèi)受控條件下研究幼鱟對重金屬Hg2+暴露的響應(yīng)規(guī)律，確定MT對Hg2+的響應(yīng)特征及線性關(guān)系、最佳暴露時(shí)間等。因天然海域中容易受到多種環(huán)境因素(鹽度、溫度和其他污染物等)干擾，Hg2+暴露是否與其他環(huán)境因素存在相互作用[41]，這些問題需要進(jìn)一步研究探討。