殺螟丹與Pb對(duì)赤子愛勝蚓的聯(lián)合毒性效應(yīng)

高晨昕，朱艷，郭夢(mèng)煒，陶婧，艾敏，殷鴻洋，趙遠(yuǎn)，肖嫻,*

1. 常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，常州 213000 2. 無錫職業(yè)技術(shù)學(xué)院，無錫 214000 3. 江蘇龍衡環(huán)境科技有限公司，常州 213000

在實(shí)際環(huán)境中，污染物通常不以單一形式存在，而是以混合作用模式存在。由于污染物的種類或者來源不同，在共存時(shí)受環(huán)境因素影響容易產(chǎn)生聯(lián)合毒性效應(yīng)，嚴(yán)重危害環(huán)境[1]。當(dāng)多種污染物共存時(shí)，不同污染物之間會(huì)對(duì)生物體吸收、代謝及其他生化反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)雜的影響。殺螟丹(cartap)是我國經(jīng)常使用的一種中低毒農(nóng)藥[2-3]。它是一種沙蠶毒素類農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于水稻、蔬菜、茶樹和早糧作物害蟲的防治。鉛(Pb)是對(duì)環(huán)境和人體傷害較大的重金屬“五毒”之一，在土壤中具有難分解、易積累和傷害不可逆等特點(diǎn)，是生態(tài)環(huán)境和人體健康的潛在殺手[4-5]。然而，目前對(duì)殺螟丹和Pb復(fù)合污染毒性效應(yīng)的相關(guān)研究還很缺乏。

針對(duì)復(fù)合污染常用的指示性生物主要有鹵蟲、發(fā)光細(xì)菌、大型蚤、藻類、斑馬魚和蚯蚓等[6-7]。相關(guān)研究證明，斑馬魚胚胎透明，活體狀態(tài)下可進(jìn)行病變觀察，且大部分基因?qū)?yīng)人類同源基因，是目前毒理和病理學(xué)領(lǐng)域理想的生物標(biāo)志物[8]。丁克強(qiáng)等[9]的研究結(jié)果表明，發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)定方法可用于評(píng)價(jià)和測(cè)定污染土壤的毒性，是理想的生物標(biāo)志物。目前，相關(guān)研究顯示，重金屬與農(nóng)藥的復(fù)合污染對(duì)生物體的生理生化指標(biāo)有明顯影響，指標(biāo)變化可反映污染物對(duì)生物的毒性機(jī)制，指示土壤污染程度。劉文麗等[10]發(fā)現(xiàn)異丙甲草胺作用下，蚯蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)響應(yīng)不同，CAT所受影響更大。蘇連水[11]在研究多菌靈等農(nóng)藥和鎳復(fù)合污染對(duì)蚯蚓的毒性影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，蚯蚓繁殖和生長能力均受不同程度損傷，CAT和SOD響應(yīng)也不同。閻曉靜[12]研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉和鎘復(fù)合污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)丙二醛(MDA)含量有影響，對(duì)SOD和CAT活性有抑制作用。重金屬與農(nóng)藥聯(lián)合作用于生物體時(shí)產(chǎn)生的毒性作用與單一作用完全不同，并且多數(shù)表現(xiàn)為協(xié)同作用[13]。孟順龍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，滅多威和辛硫磷對(duì)羅非魚分別屬于極高毒和高毒，二元聯(lián)合在96 h內(nèi)為協(xié)同作用。吳淑杭等[15]的研究表明，甲氨基阿維菌素與阿維菌素聯(lián)合作用毒性為兩者單一作用毒性之和，二氯喹啉酸與莎稗磷的毒性互相促進(jìn)。目前，復(fù)合污染尤其是同源污染，即同一環(huán)境介質(zhì)中不同污染物構(gòu)成的污染類型(例如重金屬和農(nóng)藥)，造成的嚴(yán)峻的環(huán)境問題已逐步引起各國關(guān)注[16-17]。目前，關(guān)于復(fù)合污染的聯(lián)合毒性研究主要集中在急性致死方面，而在亞致死劑量下對(duì)生物體機(jī)體的損傷方面的研究還甚少。

土壤中生物量最大的寡毛綱陸棲動(dòng)物代表是蚯蚓。由于蚯蚓對(duì)污染物敏感度高，極易受到污染物的影響導(dǎo)致生存和遺傳等多方面的變化，所以常被用作鑒別和診斷土壤污染，作為模式生物應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)[18]。為了探究重金屬和農(nóng)藥對(duì)土壤生態(tài)的聯(lián)合毒性，筆者選取赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)作為研究對(duì)象，研究殺螟丹和Pb單一及二元復(fù)合脅迫下蚯蚓的死亡率和生理生化指標(biāo)的變化，為深入研究重金屬與農(nóng)藥復(fù)合污染的作用機(jī)理提供研究方法和數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試生物

赤子愛勝蚓購置于江蘇某蚯蚓養(yǎng)殖場。試驗(yàn)前經(jīng)實(shí)驗(yàn)室預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，試驗(yàn)過程中選擇體型相似、體重約0.3 g的性成熟的成年蚯蚓。

1.2 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.2.1 單一毒性實(shí)驗(yàn)

蚯蚓清腸：在預(yù)先培養(yǎng)的蚯蚓中挑取性成熟的成年蚯蚓，洗凈后吸干體表水分后放入燒杯中，燒杯底部鋪有濾紙并加適量水潤濕，用解剖針扎好孔的保鮮膜封口。將燒杯置于的恒溫培養(yǎng)箱中，溫度為(20±1) ℃，濕度約80%，于暗處清腸24 h。

暴露實(shí)驗(yàn)：依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)濃度區(qū)間進(jìn)行等對(duì)數(shù)間距稀釋形成5個(gè)濃度梯度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。將雙圈定性濾紙墊入玻璃培養(yǎng)皿中，準(zhǔn)確吸取4 mL試驗(yàn)濃度的試劑均勻淋灑于濾紙上，已清腸的蚯蚓沖洗干凈并吸干體表多余水分后在每個(gè)濃度處理中放入一條，每個(gè)試驗(yàn)處理組設(shè)10個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。用保鮮膜封口扎緊，再將玻璃培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)溫度為(20±1) ℃，濕度為80%左右，于暗處培養(yǎng)72 h，并于24、48和72 h分別記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數(shù)。

1.2.2 聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則 第15部分：蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)》(GB/T 31270.15—2014)[19]中濾紙法的規(guī)定，以殺螟丹和Pb對(duì)蚯蚓的48 h的半致死濃度(LC50)值為一個(gè)毒性單位，按照等毒性比1∶1的混合比例以等對(duì)數(shù)間距設(shè)置試驗(yàn)濃度進(jìn)行聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)，具體程序參照單一毒性實(shí)驗(yàn)的方法。

1.2.3 聯(lián)合毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)

當(dāng)前，在國際上并未確定統(tǒng)一的關(guān)于污染物對(duì)土壤動(dòng)物的聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法，本研究采用Marking相加指數(shù)法[20]評(píng)價(jià)重金屬與農(nóng)藥復(fù)合污染對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性作用，計(jì)算方式如下：

(1)

(2)

S>1時(shí)，AI=1.0-S

(3)

式(1)中：An、Bn和Cn值分別代表混合物中不同毒物的LC50值，Aj、Bj和Cj分別代表A、B和C毒物單獨(dú)作用時(shí)的LC50值。

依照相加指數(shù)(AI)值判斷聯(lián)合毒性的類型[21]，當(dāng)-0.2

1.3 蚯蚓生理生化指標(biāo)實(shí)驗(yàn)

分別采集不同時(shí)間各處理的蚯蚓樣本，按照稱取的蚯蚓質(zhì)量的9倍加入0.86%的生理鹽水，用勻漿器在冰浴條件下勻漿，用冷凍離心機(jī)將勻漿好的蚯蚓組織液在2 500 r·min-1條件下離心10 min。取上清液用生理鹽水稀釋成所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組織勻漿，待測(cè)。

蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)試盒(南京建成生物科技研究所)，試驗(yàn)設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管，其中，空白管中加入雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.563 g·L-1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定管中加入各處理的蚯蚓組織勻漿。試驗(yàn)時(shí)先加入樣品，再加入考馬斯亮藍(lán)顯色液，混勻靜置10 min，用酶標(biāo)儀(E7031，美國普洛麥格公司)在波長595 nm處測(cè)定各管的吸光度值(OD)。根據(jù)測(cè)得的OD計(jì)算蚯蚓樣本2%濃度的組織勻漿液的蛋白含量[22]，計(jì)算方法如下：

SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，試劑盒購于南京建成生物科技研究所，試管設(shè)置測(cè)定管和對(duì)照管，測(cè)定管加樣品，對(duì)照管加同樣體積的雙蒸水，室溫靜置10 min后，用酶標(biāo)儀(E7031，美國普洛麥格公司)在波長550 nm處[23]，測(cè)定各管的吸光度值，SOD活性計(jì)算方法如下：

CAT活性采用可見光法測(cè)定，試劑盒購于南京建成生物科技研究所，試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照管和測(cè)定管，按照試劑盒的說明進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀(E7031，美國普洛麥格公司)在波長405 nm處，測(cè)定各管的吸光度值[24]。計(jì)算方法如下：

(6)

MDA含量采用TBA法測(cè)定，試驗(yàn)設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管和對(duì)照管，按照試劑盒(南京建成生物科技研究所)說明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀(E7031，美國普洛麥格公司)在波長405 nm處測(cè)定各管的吸光度值[25]。計(jì)算方法如下：

(7)

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin8.5軟件對(duì)混合體系中各物質(zhì)濃度與蚯蚓死亡率進(jìn)行非線性擬合，并采用非線性回歸方程計(jì)算得出蚯蚓的24、48和72 h的LC50值。

2 結(jié)果(Results)

2.1 殺螟丹和Pb對(duì)蚯蚓的急性毒性效應(yīng)

2.1.1 殺螟丹和Pb對(duì)蚯蚓的單一毒性

蚯蚓經(jīng)殺螟丹暴露后，出現(xiàn)一些中毒癥狀：軀體顏色加深且軀體極度延展、失去彈性，部分蚯蚓爬行緩慢，反應(yīng)遲緩，對(duì)刺激不敏感。蚯蚓經(jīng)Pb染毒后主要表現(xiàn)為：軀體變軟、有小泡，出現(xiàn)“抱團(tuán)”現(xiàn)象，染毒時(shí)間延長后，一些蚯蚓表皮滲出血液，有些個(gè)體出現(xiàn)軀體腐爛、變黑和斷節(jié)現(xiàn)象。

殺螟丹和Pb對(duì)蚯蚓的單一毒性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，2種藥物對(duì)蚯蚓毒性有差異，并且毒性都隨著暴露時(shí)間的延長而增強(qiáng)。染毒24 h時(shí)，殺螟丹對(duì)蚯蚓的單一毒性大于Pb，其24 h-LC50值為14.3 mg·L-1。蚯蚓對(duì)Pb的耐受能力更強(qiáng)，為殺螟丹的67.9倍。染毒48 h時(shí)，殺螟丹和Pb的48 h-LC50分別為12.4 mg·L-1和911.6 mg·L-1，毒性分別增強(qiáng)1.2倍和1.0倍，殺螟丹毒性更強(qiáng)，是Pb的73.8倍。染毒72 h時(shí)，殺螟丹和Pb單一毒性繼續(xù)增強(qiáng)，較48 h增強(qiáng)1.2倍和1.1倍，殺螟丹72 h-LC50值為10.4 mg·L-1，毒性更強(qiáng)。

表1 殺螟丹和Pb對(duì)赤子愛勝蚓的單一毒性Table 1 The individual toxicity of cartap and Pb on Eisenia foetida

2.1.2 殺螟丹和Pb對(duì)蚯蚓的二元聯(lián)合毒性

殺螟丹-Pb對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性作用類型結(jié)果如表2所示，殺螟丹與Pb等毒性1∶1配比、暴露24、48和72 h時(shí)，AI分別為-0.17、-0.19和-0.25，聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加作用、相加作用和拮抗作用，二者隨著暴露時(shí)間的延長，相互作用逐漸減弱。二元混合體系下，殺螟丹和Pb的LC50幾乎是各自單一作用時(shí)的1/2，且隨著暴露時(shí)間延長，LC50值逐漸降低。在混合體系中，二者毒害性大于各自單一作用時(shí)產(chǎn)生的毒害，但隨暴露時(shí)間的延長，聯(lián)合作用逐漸減弱。

表2 殺螟丹-Pb二元混合體系對(duì)赤子愛勝蚓聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cartap and Pb to Eisenia foetida

2.2 殺螟丹單一作用對(duì)蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響

設(shè)置殺螟丹染毒濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1，以不加殺螟丹為空白對(duì)照(CK)，分別在24、48和72 h采集蚯蚓樣本進(jìn)行前處理，測(cè)定其蛋白含量、體內(nèi)SOD活性、CAT活性以及MDA含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 殺螟丹單一染毒24、48和72 h對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 1 Effect of cartap on protein content, superoxide dismutase (SOD) activity, catalase (CAT) activity and malondialdehyde (MDA) content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

蚯蚓經(jīng)不同濃度殺螟丹染毒后，蛋白含量在染毒時(shí)間內(nèi)先升高后降低并趨于穩(wěn)定(圖1(a))。染毒24 h時(shí)，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1濃度組蛋白含量分別較CK增加12.9%、9.5%、43.6%、29.6%和23.8%，在濃度為1.5 mg·L-1時(shí)出現(xiàn)峰值。染毒48 h時(shí)，在濃度為1.0 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值。染毒72 h時(shí)，在濃度為1.5 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值。不同染毒時(shí)間內(nèi)，峰值濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。暴露時(shí)間內(nèi)，24、48和72 h內(nèi)SOD活性分別呈現(xiàn)先降低后升高、先升高后降低和持續(xù)降低的趨勢(shì)(圖1(b))。暴露24 h時(shí)，各處理SOD活性分別高于CK 10.93%、3.02%、-2.06%、5.51%和19.04%。染毒48 h的SOD活性呈現(xiàn)與24 h相反趨勢(shì)，在濃度為2.0 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值，隨后降低。暴露72 h時(shí)SOD活性持續(xù)降低并遠(yuǎn)低于CK。24 h和48 h時(shí)各濃度組間SOD活性差異不顯著，72 h時(shí)各濃度組之間以及與CK均存在顯著性差異(P<0.05)。CAT活性在暴露時(shí)間內(nèi)，整體呈現(xiàn)先上升后降低趨勢(shì)(圖1(c))。CK體內(nèi)CAT活性無明顯波動(dòng)。染毒24 h時(shí)CAT活性被誘導(dǎo)迅速上升，并在0.5 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值。48 h時(shí)CAT活性在2.0 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值后大幅降低，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1濃度組與24 h相比分別降低52.18%、46.51%、41.24%、32.58%和40.37%。72 h時(shí)CAT活性相對(duì)48 h整體略升高，在1 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值。除72 h時(shí)各濃度組之間差異不顯著，其余暴露時(shí)間不同濃度組之間均有顯著性差異(P<0.05)。72 h內(nèi)隨著染毒時(shí)間的增加，蚯蚓體內(nèi)MDA含量整體降低(圖1(d))。CK中蚯蚓體內(nèi)MDA含量較穩(wěn)定，基本不變。染毒24 h時(shí)，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1濃度組的MDA含量分別高于CK 29.37%、66.87%、34.70%、14.77%和2.2%，并呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)且在1.0 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值。染毒48 h時(shí)，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1濃度組中MDA含量分別高于CK 1.79%、15.83%、38.13%、5.45%和2.49%，整體含量較染毒初期降低。染毒72 h時(shí)，MDA含量基本與CK相當(dāng)。除24 h和48 h內(nèi)峰值濃度組與CK存在顯著性差異(P<0.05)外，其他濃度組之間、與CK之間均無明顯差異。

2.3 Pb單一作用對(duì)蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響

經(jīng)50、100、150、200和250 mg·L-1Pb處理后，分別于24、48和72 h采集蚯蚓樣本，進(jìn)行蛋白含量、體內(nèi)SOD活性、CAT活性和MDA含量的測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

24、48和72 h暴露時(shí)間內(nèi)，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量變化趨勢(shì)相似(圖2(a))。暴露24 h時(shí)，蛋白含量呈現(xiàn)升高、降低、升高趨勢(shì)，50、100、150、200和250 mg·L-1濃度組相對(duì)CK分別增加11.25%、33.91%、22.82%、13.42%和21.55%，在濃度為100 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值，隨后降低。染毒48 h的變化趨勢(shì)與24 h相同。染毒72 h時(shí)，濃度≥100 mg·L-1時(shí)蛋白含量逐漸降低，在250 mg·L-1時(shí)降至與CK相當(dāng)。不同時(shí)間段內(nèi)，峰值濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。隨著暴露時(shí)間延長，CK中蚯蚓體內(nèi)SOD活性幾乎穩(wěn)定不變(圖2(b))。染毒24 h時(shí)，各濃度組SOD活性均大于CK并呈現(xiàn)逐步升高趨勢(shì)，50、100、150、200和250 mg·L-1濃度組分別較CK增加了5.06%、11.18%、21.48%、33.03%和40.37%，在250 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值。暴露48 h時(shí)SOD活性先升高后降低，在Pb濃度為100 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值，與CK相比升高50.90%。暴露72 h時(shí)SOD活性逐步降低并趨于平穩(wěn)。除72 h內(nèi)各濃度組間無顯著性差異，其余暴露時(shí)間各濃度組間、與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。CK中蚯蚓體內(nèi)CAT活性隨暴露時(shí)間延長無明顯變化(圖2(c))。染毒24 h時(shí)，CAT活性呈現(xiàn)降低、升高、降低趨勢(shì)，在Pb濃度為200 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值，50、100、150、200和250 mg·L-1濃度組分別高于CK 48.75%、33.95%、46.99%、61.89%和44.82%。染毒48 h時(shí)，CAT活性整體大幅下降，甚至低于CK，各濃度組與CK均存在顯著性差異(P<0.05)。染毒72 h時(shí)，CAT活性恢復(fù)至與CK相當(dāng)并保持平穩(wěn)。各濃度組之間均無顯著性差異。隨著暴露時(shí)間延長，CK中蚯蚓體內(nèi)MDA含量變化幅度很小(圖2(d))。染毒24 h和48 h時(shí)，MDA含量均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。24 h的最小值出現(xiàn)在濃度150 mg·L-1時(shí)，低于CK 11.83%，然后在200 mg·L-1和250 mg·L-1時(shí)分別高出CK 24.09%和37.44%。48 h時(shí)基本回落至CK水平。染毒72 h時(shí)，MDA含量逐步上升，整體較48 h略升高。3個(gè)不同時(shí)間段內(nèi)，峰值濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。

圖2 Pb單一染毒24、48和72 h對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的影響Fig. 2 Effect of Pb on protein content, SOD activity, CAT activity and MDA content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

2.4 殺螟丹和Pb二元聯(lián)合對(duì)蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響

經(jīng)過0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的殺螟丹與50 mg·L-1Pb梯度處理24、48和72 h后采集蚯蚓樣本，測(cè)定其體內(nèi)蛋白含量、體內(nèi)SOD活性、CAT活性以及MDA含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 殺螟丹與50 mg·L-1 Pb聯(lián)合染毒24、48和72 h對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的影響Fig. 3 Effect of cartap and Pb (50 mg·L-1) on protein content, SOD activity, CAT activity and MDA content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

24、48和72 h的暴露時(shí)間內(nèi)，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量整體呈現(xiàn)升高、降低、升高、降低趨勢(shì)(圖3(a))。染毒24 h時(shí)，蛋白含量在1.0 mg·L-1殺螟丹與50 mg·L-1Pb聯(lián)合染毒時(shí)達(dá)到峰值，與CK存在顯著性差異(P<0.05)。染毒48 h時(shí)，蛋白含量呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，各濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。72 h時(shí)，蛋白含量呈現(xiàn)與48 h相反趨勢(shì)，即隨著暴露濃度的增加蛋白含量降低，與CK差異性也越顯著。不同處理組蚯蚓體內(nèi)SOD活性幾乎均高于CK(圖3(b))。CK的SOD活性在48 h時(shí)達(dá)到峰值。染毒24 h時(shí)，SOD活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的殺螟丹+50 mg·L-1Pb組較CK升高10.70%、22.40%、32.53%、45.89%和54.54%，在殺螟丹(2.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組達(dá)到峰值。各濃度組之間、與CK均存在顯著性差異(P<0.05)。染毒48 h時(shí)，SOD活性變化趨勢(shì)同24 h，各濃度組之間差異不顯著。染毒72 h時(shí)，SOD活性先升高后降低，峰值出現(xiàn)在殺螟丹(1.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組，各濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。CK中蚯蚓體內(nèi)CAT活性隨暴露時(shí)間增加無明顯變化(圖3(c))。染毒24 h時(shí)，CAT活性較CK大幅升高，并呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在殺螟丹(2.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組達(dá)到峰值。染毒48 h時(shí)，CAT活性較24 h時(shí)大幅降低，殺螟丹(0.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組CAT活性低于CK，峰值出現(xiàn)在殺螟丹(1.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組，較24 h峰值降低24.97%。染毒72 h時(shí)，CAT活性較48 h升高，但不同濃度組CAT活性變化不大。除24 h各濃度組間存在顯著性差異，其余染毒時(shí)間內(nèi)差異均不顯著。CK中蚯蚓體內(nèi)MDA含量較穩(wěn)定，隨暴露時(shí)間增加無明顯變化(圖3(d))。染毒24 h時(shí)，低濃度組中MDA基本未受到誘導(dǎo)作用，在殺螟丹(1.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組中受到抑制。高濃度殺螟丹(2.0、50和2.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)處理組MDA受到的誘導(dǎo)作用較強(qiáng)，分別高于CK 31.91%和58.75%。染毒48 h時(shí)，MDA含量變化幅度較24 h更小，并呈先降低后升高趨勢(shì)，其中，在殺螟丹(1.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組中與CK相當(dāng)。各濃度組之間無顯著性差異。染毒72 h時(shí)，MDA含量整體升高，各濃度組之間以及與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

筆者研究了農(nóng)藥殺螟丹與重金屬Pb對(duì)蚯蚓單一和聯(lián)合毒性效應(yīng)，考察了亞致死劑量下蚯蚓體內(nèi)蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的變化趨勢(shì)，找出反映蚯蚓受污染物脅迫程度的生物學(xué)指標(biāo)。

殺螟丹和Pb對(duì)蚯蚓的單一毒性研究結(jié)果表明，殺螟丹毒性大于Pb。這可能由于殺螟丹具有神經(jīng)性殺蟲活性，尤其對(duì)土壤生物具有較大殺傷力，毒害作用高于土壤中富集的重金屬[26]。而蚯蚓對(duì)不同重金屬的耐受性和富集能力均不同。相關(guān)研究證明，蚯蚓對(duì)Pb的富集能力隨著土壤中Pb濃度的增加而增強(qiáng)[27]。宋玉芳等[28]發(fā)現(xiàn)蚯蚓對(duì)Pb的耐受度較強(qiáng)。在殺螟丹與Pb等毒性比1∶1二元混合體系中，聯(lián)合毒性以相加為主，在暴露72 h時(shí)減弱為拮抗作用?？赡茉?yàn)?，隨著暴露時(shí)間的增加，殺螟丹逐漸損傷蚯蚓細(xì)胞膜[29]，抑制了蚯蚓機(jī)體對(duì)毒性物質(zhì)的吸收，從而表現(xiàn)出聯(lián)合毒性減弱的結(jié)果。

急性毒性實(shí)驗(yàn)只能通過研究蚯蚓存活率和死亡率等指標(biāo)觀察毒性效應(yīng)，而不能進(jìn)一步表征機(jī)體內(nèi)各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化，有局限性。因此，研究蚯蚓經(jīng)亞致死劑量殺螟丹和Pb單一和復(fù)合染毒后，其體內(nèi)蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的變化趨勢(shì)。綜合分析生理生化指標(biāo)變化發(fā)現(xiàn)，蚯蚓在機(jī)體遭受污染物脅迫時(shí)，首先蛋白含量會(huì)發(fā)生變化以警示受到污染損害，與此同時(shí)第一道抗氧化防御啟動(dòng)，機(jī)體內(nèi)SOD活性等迅速被誘導(dǎo)，用于清除體內(nèi)過多的氧自由基并產(chǎn)生H2O2，隨后CAT活性增強(qiáng)并將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2。SOD活性隨染毒時(shí)間延長而降低，此時(shí)，MDA含量增強(qiáng)，表明機(jī)體受氧化損傷程度加重。因此，SOD活性和MDA含量均可作為蚯蚓應(yīng)對(duì)氧化脅迫和機(jī)體受氧化損傷程度的判斷指標(biāo)。

蚯蚓主要通過腸道與土壤中的污染物接觸，其表皮和中腸受到損傷進(jìn)而危害其生長，蛋白含量在這種情況下極易發(fā)生變性[30]。殺螟丹、Pb單一作用以及二者聯(lián)合作用下，隨著暴露時(shí)間增加，不同濃度下蚯蚓體內(nèi)蛋白含量變化在初期均表現(xiàn)為不穩(wěn)定。這是由于污染物的刺激導(dǎo)致蚯蚓機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，如C-反應(yīng)蛋白(CRF)、纖維連接蛋白(Fn)等，這引起蚯蚓體內(nèi)蛋白總量的升高[31]。也有可能由于蚯蚓機(jī)體受到損傷，內(nèi)環(huán)境紊亂造成體內(nèi)蛋白含量的急劇增加。3種染毒模式均在中后期出現(xiàn)蛋白含量峰值，后又逐步降低，這與邰托婭等[32]的研究結(jié)果相似?？赡芤?yàn)楹笃谌径緷舛容^高且染毒時(shí)間較長時(shí)，經(jīng)表皮的毒性和胃毒破壞了蛋白產(chǎn)生源，而機(jī)體代謝也需要蛋白提供能量，致使蛋白合成量減少。

染毒初期，殺螟丹單一作用主要脅迫蚯蚓胃部，經(jīng)表皮細(xì)胞吸收后，蚯蚓機(jī)體作出抗氧化防御反應(yīng)，SOD活性逐漸被誘導(dǎo)，因此，呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)。后期由于時(shí)間增長導(dǎo)致機(jī)體脅迫程度加重，代謝受到影響而抑制SOD活性，當(dāng)SOD被消耗后，機(jī)體不足以抵抗氧化反應(yīng)，酶活性也隨之降低，導(dǎo)致SOD下降甚至低于CK。Pb單一作用時(shí)，短時(shí)間內(nèi)能夠明顯誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)SOD活性，染毒后期也呈現(xiàn)SOD受到抑制的現(xiàn)象，這與Shao等[33]的研究結(jié)論相似。殺螟丹與Pb二元聯(lián)合作用時(shí)，初期聯(lián)合毒性的相加作用促使SOD含量升高以抵抗氧自由基對(duì)機(jī)體的損害，后期聯(lián)合毒性降低但對(duì)SOD活性抑制作用依舊增強(qiáng)，蚯蚓機(jī)體修復(fù)能力已無法承受傷害，氧化損傷嚴(yán)重，趙逸昳[34]在研究農(nóng)藥與重金屬復(fù)合污染對(duì)蚯蚓SOD活性的影響時(shí)，得出了相似結(jié)果。值得注意的是，殺螟丹與Pb混合體系在后期對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD活性脅迫作用均大于單一脅迫，說明復(fù)合污染對(duì)蚯蚓機(jī)體抗氧化性毒害大于單一污染。

CAT與SOD一起構(gòu)成生物體防御體系，用于清除蚯蚓體內(nèi)H2O2以免除機(jī)體氧化損傷。3種染毒模式下CAT活性整體變化均呈現(xiàn)先上升后下降并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。殺螟丹單一作用時(shí)，染毒初期蚯蚓體內(nèi)吸收殺螟丹較少，代償性地誘導(dǎo)CAT活性升高，隨時(shí)間延長CAT活性恢復(fù)至正常水平。后期蚯蚓機(jī)體對(duì)殺螟丹產(chǎn)生適應(yīng)，CAT活性上升同時(shí)趨于穩(wěn)定，這與已有研究結(jié)論相似[35]。Pb單一作用時(shí)，初期CAT活性變化同殺螟丹作用時(shí)相似，中后期CAT活性下降可能是由于SOD活性增強(qiáng)，產(chǎn)生的H2O2超過CAT轉(zhuǎn)化能力，或蚯蚓機(jī)體受損嚴(yán)重，需要啟動(dòng)第二道抗氧化防御機(jī)制CAT酶來維持機(jī)體代謝平衡，這與Vitória等[36]觀察到的生物體遭受脅迫時(shí)CAT活性變化的情況相同。殺螟丹與Pb二元聯(lián)合染毒時(shí)，前中期變化均與殺螟丹和Pb單一染毒時(shí)相似，后期CAT活性有大幅回升甚至與初期活性相同，推測(cè)是因?yàn)楹笃诼?lián)合毒性減弱，蚯蚓機(jī)體已啟動(dòng)CAT酶用于維持機(jī)體平衡，這與丁詩華等[37]提出的機(jī)理相似。

MDA含量可反映蚯蚓在受毒害時(shí)脂質(zhì)過氧化水平，以評(píng)價(jià)蚯蚓細(xì)胞受損程度。殺螟丹和Pb分別單一作用時(shí)，MDA含量變化趨勢(shì)相反。殺螟丹作用時(shí)，暴露時(shí)間內(nèi)，MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，推測(cè)可能由于染毒初期蚯蚓受殺螟丹脅迫，抗氧化防御系統(tǒng)還未完全恢復(fù)功能，機(jī)體受氧化損傷導(dǎo)致脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量迅速升高。隨著抗氧化防御系統(tǒng)的開啟，各種抗氧化酶活性增強(qiáng)，消除了過多的氧自由基，機(jī)體逐漸適應(yīng)脅迫環(huán)境，機(jī)體受氧化脂質(zhì)損傷程度減輕，MDA含量降低。Pb作用時(shí)，MDA含量變化出現(xiàn)相反趨勢(shì)，考慮是由于染毒初期蚯蚓受低濃度Pb脅迫，抗氧化防御系統(tǒng)中的SOD等足以清除氧自由基，機(jī)體氧化損傷較輕，隨著Pb濃度的升高，SOD活性降低，機(jī)體氧化損傷嚴(yán)重。中期機(jī)體逐步適應(yīng)Pb脅迫后，MDA含量達(dá)到平衡。后期染毒時(shí)間延長致使機(jī)體脂質(zhì)氧化加重，導(dǎo)致MDA含量增加。Jager等[38]研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)MDA含量越高，則機(jī)體受到氧化損傷程度越大。這說明，長時(shí)間Pb脅迫對(duì)蚯蚓機(jī)體氧化損傷大于殺螟丹。殺螟丹與Pb二元聯(lián)合作用下，MDA含量變化趨勢(shì)與Pb脅迫時(shí)相似，但整體含量上升，考慮是由于聯(lián)合毒性相比單一脅迫導(dǎo)致蚯蚓機(jī)體產(chǎn)生更多的自由基以致無法清除，自由基不斷累積導(dǎo)致氧化應(yīng)激而使MDA含量過高，該結(jié)果與段曉塵[39]和Narbonne等[40]的研究結(jié)果相似。與單一毒性不同，復(fù)合染毒中殺螟丹與Pb同時(shí)作用，殺螟丹破壞了細(xì)胞膜，影響了蚯蚓對(duì)體內(nèi)Pb的降解代謝能力，Pb會(huì)逐漸積累至機(jī)體無法消除，MDA含量的升高也反映了這點(diǎn)。值得注意的是，與CK相比，二元混合體系下高濃度脅迫對(duì)蚯蚓體內(nèi)MDA含量具有較強(qiáng)誘導(dǎo)作用，低濃度脅迫幾乎無誘導(dǎo)作用，說明高濃度復(fù)合污染對(duì)蚯蚓機(jī)體氧化損傷較大。