丙烯腈暴露通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)大鼠腦組織氧化應(yīng)激

張瑞萍，魏倩，高霞，趙粉線，薛紅麗，李芝蘭

蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000

丙烯腈(acrylonitrile, ACN)是一種高毒類有機(jī)氰化物，用于制造腈綸纖維、丁腈橡膠和ABS塑料等高分子材料，是職業(yè)環(huán)境中的常見污染物[1]。腦組織是ACN毒作用的靶器官，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，ACN染毒后，大鼠海馬區(qū)和大腦皮層區(qū)膠質(zhì)增生，神經(jīng)元排列不規(guī)則；膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)陽性細(xì)胞數(shù)目增加，胞體肥大，突體增粗且不規(guī)則[2]。通過ACN處理人星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)含量增加，谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量降低，過氧化氫酶(catalase, CAT)活性上升[3]。羅波艷等[4]以不同劑量ACN染毒SD大鼠也得出相似結(jié)果，提示ACN可誘導(dǎo)機(jī)體腦組織氧化損傷。國外有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期接觸ACN使神經(jīng)衰弱綜合征的發(fā)生率較高，包括頭暈、頭痛、乏力、失眠多夢及心悸等癥狀。此外，3年以上接觸濃度接近6 mg·m-3的ACN使部分工人發(fā)生頭痛、全身無力、易激動(dòng)、不自主運(yùn)動(dòng)和工作效率低下等神經(jīng)精神癥狀[5-6]。

核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)是存在于真核細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)錄因子，未激活狀態(tài)下，與其抑制因子IκB在非活化的形式存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高或處于氧化/抗氧化失衡過程中，其可激活NF-κB信號(hào)通路，被稱為氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子。Dang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)作為一種有效的抗氧化劑，可抑制ROS介導(dǎo)的NF-κB活化以及凋亡相關(guān)基因BaxmRNA表達(dá)水平。高玲等[8]用TNF-α和IL-1β處理大鼠腦皮層培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，可使NF-κB蛋白相對表達(dá)水平升高，環(huán)孢素A預(yù)處理可抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB活化。以上研究結(jié)果表明，ROS和炎癥細(xì)胞因子均可激活NF-κB信號(hào)通路。

本研究通過不同劑量ACN灌胃染毒雄性SD大鼠，建立短期腦損傷模型，測定大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子水平的變化，檢測大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，探討ACN通過誘導(dǎo)腦組織氧化/抗氧化失衡和炎癥反應(yīng)對NF-κB信號(hào)通路的影響，為ACN的神經(jīng)系統(tǒng)毒性機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康成年SPF級(jí)雄性SD大鼠(動(dòng)物合格證編號(hào)：SYXK(甘)2015-0005)。將60只大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，對照組灌胃玉米油，染毒組分別給予11.5、23.0和46.0 mg·kg-1ACN灌胃，NAC干預(yù)組先給予300 mg·kg-1NAC灌胃，30 min后再灌胃46.0 mg·kg-1ACN。每天1次，每周6 d，連續(xù)灌胃28 d。染毒劑量主要依據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期研究成果設(shè)定。

1.2 試劑

ACN(純度>99%)購買于天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，NAC購買于美國Amersco公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、CAT、GSH、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購買于南京建成生物工程研究所，IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫(Elisa)試劑盒購買于武漢Elabscience生物科技有限公司。BCA總蛋白測定試劑盒購買于美國Thermo公司，IKKα、p-IKKα/β、p-IκBα、NF-κB(兔抗)、IκBα和TLR4(鼠抗)一抗購買于美國CST公司，GAPDH一抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購買于美國SAB公司，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購買于美國CST公司，引物由日本TAKARA公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 大鼠腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測定

染毒結(jié)束后，處死大鼠。每組隨機(jī)選取6只大鼠腦組織，按腦組織質(zhì)量(g)∶勻漿介質(zhì)體積(mL)=1∶9的質(zhì)量體積比在冰水浴下用玻璃勻漿器將其制成10%勻漿，12 000 g·min-1、4 ℃下低溫離心10 min，分裝上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說明書操作，測定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。

1.4 大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子的測定

嚴(yán)格按照IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫(Elisa)試劑盒步驟，測定炎癥細(xì)胞因子濃度。

1.5 RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)水平

采用Trizol法提取大鼠腦組織總RNA，加入30 μL DEPC水充分溶解總RNA；測定總RNA濃度，選取吸光度比值(A260/A280)在1.8～2.2的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，選擇20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系，37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min后，85 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s，最終獲得cDNA模板。RT-qPCR檢測大鼠腦組織IKKα、IκBα、NF-κB和β-actinmRNA相對表達(dá)水平，選擇25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)(三步法)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性反應(yīng)30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50個(gè)循環(huán)；60 ℃熔解反應(yīng)15 s，共71個(gè)循環(huán)(表1)。

采用Pfaffl法計(jì)算基因mRNA相對表達(dá)水平，公式為

式中：E為擴(kuò)增效率，E=(Rn,A/Rn,B)1/(CT,ACT,B)-1，A和B為熒光擴(kuò)增曲線上的任意2個(gè)點(diǎn)，Rn,A、Rn,B為A和B這2點(diǎn)對應(yīng)的熒光值。E靶基因?yàn)槟繕?biāo)基因的擴(kuò)增效率，E內(nèi)參基因?yàn)閮?nèi)參基因的擴(kuò)增效率；ΔCT靶基因=對照組目標(biāo)基因CT值-待測樣本目標(biāo)基因CT值，ΔCT內(nèi)參基因=對照組內(nèi)參基因CT值-待測樣本內(nèi)參基因CT值。

1.6 Western-Blot檢測蛋白表達(dá)水平

隨機(jī)提取6只大鼠腦組織總蛋白，測定腦組織勻漿總蛋白含量，根據(jù)測定結(jié)果加入RIPA裂解液和5×上樣緩沖液，調(diào)整樣品蛋白濃度為4 μg·μL-1，沸水變性5 min。然后在各泳道內(nèi)加入15 μL各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)彩虹marker標(biāo)識(shí)裁取所需部分，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉2 h后，孵育一抗，用含BSA的5%的封閉液配制IKKα(1∶1 000)、p-IKKα/β(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)和TLR4(1∶1 000)一抗(鼠抗)。GAPDH(1∶5 000)、IκBα(1∶1 000)和p-IκBα(1∶1 000)用含脫脂奶粉的5%的封閉液配制，4 ℃水平搖床過夜，TBST漂洗后孵二抗2 h，顯影成像并保存，采用Image J軟件對目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

表1 各基因引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequence and product size of each gene

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 ACN對大鼠腦組織抗氧化能力及脂質(zhì)過氧化的影響

如表2所示，ACN染毒后，與對照組比較，11.5、23.0和46.0 mg·kg-1ACN組大鼠腦組織MDA含量均升高(P<0.05)；23.0 mg·kg-1和46.0 mg·kg-1ACN組GSH含量降低(P<0.05)；46.0 mg·kg-1ACN組GSH-Px活性下降(P<0.05)；11.5 mg·kg-1組CAT活性下降(P<0.05)；各暴露組大鼠腦組織SOD活性與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NAC組大鼠腦組織SOD活性與46.0 mg·kg-1ACN組比較升高，MDA含量和CAT活性與46.0 mg·kg-1ACN組比較均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 ACN對大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子水平的影響

如圖1所示，ACN染毒后，與對照組相比，各劑量組大鼠腦組織TNF-α濃度均升高(P<0.05)；23.0 mg·kg-1和46.0 mg·kg-1ACN組IL-1β濃度均升高(P<0.05)；46.0 mg·kg-1ACN組IL-6濃度升高(P<0.05)。與46.0 mg·kg-1ACN組比較，NAC組大鼠腦組織中炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α濃度均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 ACN染毒后大鼠腦組織IL-6、IL-1β和TNF-α濃度變化注：與對照組比較，* P<0.05；與NAC組比較，# P<0.05；n=6。Fig. 1 Effects of ACN exposure on the changes of IL-6, IL-1β, TNF-α concentrations in rat brainNote: Compared with the control group, *P<0.05; compared with the NAC group, # P<0.05; n=6.

2.3 ACN染毒對大鼠腦組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示(圖2)，23.0 mg·kg-1和46.0 mg·kg-1ACN組大鼠腦組織IKKα和NF-κB mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各暴露組IκBmRNA表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NAC組大鼠腦組織IKKα和NF-κB mRNA表達(dá)水平與46.0 mg·kg-1ACN組比較均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 丙烯腈(acrylonitrile，ACN)染毒對大鼠腦組織抗氧化能力及脂質(zhì)過氧化的影響Table 2 Effects of ACN (acrylonitrile) exposure on the anti-oxidative capacity and lipid peroxidation of rat brain tissues

圖2 ACN染毒后大鼠腦組織IKKα、IκBα和NF-κB mRNA表達(dá)水平變化注：與對照組比較，*P<0.05；與NAC組比較，# P<0.05；n=6。Fig. 2 Effects of ACN exposure on IKKα, IκBα and NF-κB mRNA expression in rat brain tissueNote: Compared with the control group, *P<0.05; compared with the NAC group, # P<0.05; n=6.

2.4 ACN染毒對大鼠腦組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

Western Blot結(jié)果表明(圖3)，各劑量染毒組大鼠腦組織p-IKKα/β、IKKα和NF-κB蛋白相對表達(dá)水平均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；23.0 mg·kg-1和46.0 mg·kg-1ACN組p-IκBα蛋白相對表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；各暴露組IκBα蛋白相對表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與46.0 mg·kg-1ACN組比較，NAC組大鼠腦組織p-IKKα/β和NF-κB蛋白相對表達(dá)水平降低(P<0.05)。

圖3 ACN染毒后大鼠腦組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化注：(a)和(b)為蛋白免疫印跡條帶((a)和(b)共用同一內(nèi)參GAPDH條帶)；(c) p-IKKα/β和IKKα蛋白相對表達(dá)水平；(d) p-IκBα、IκBα和NF-κB蛋白相對表達(dá)水平；n=6；與對照組比較，*P<0.05；與NAC組比較，# P<0.05。Fig. 3 Effects of ACN exposure on protein expression related to NF-κB signaling pathway in rat brainNote: (a) and (b) the immune printing strips ((a) and (b) share the same GAPDH strip); (c) relative protein expression of p-IKKα/β and IKKα; (d) relative protein expression of p-IκBα, IκBα and NF-κB; n=6; compared with the control group, *P<0.05; compared with the NAC group, # P<0.05.

2.5 ACN對大鼠腦組織TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

如圖4所示，46.0 mg·kg-1ACN組大鼠腦組織TLR4 mRNA、蛋白相對表達(dá)水平均升高(P<0.05)，與46.0 mg·kg-1ACN組比較，NAC組TLR4 mRNA、蛋白相對表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 ACN染毒后大鼠腦組織TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化注：(a)蛋白免疫印跡條帶；(b)TLR4蛋白相對表達(dá)水平；(c)TLR4 mRNA相對表達(dá)水平；與對照組比較，*P<0.05；與NAC組比較，# P<0.05；n=6。Fig. 4 Effects of ACN exposure on the TLR4 mRNA and protein expression in rat brainNote: (a) the immune printing strips; (b) TLR4 relative protein expression; (c) TLR4 relative mRNA expression; compared with the control group, *P<0.05; compared with the NAC group, # P<0.05; n=6.

3 討論(Discussion)

機(jī)體在細(xì)胞呼吸和能量代謝過程中發(fā)生有氧氧化并產(chǎn)生ROS，包括超氧根離子(·O2-)、羥自由基(·OH)和過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等。當(dāng)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS、抗氧化能力減弱引起ROS清除減慢時(shí)，會(huì)破壞機(jī)體的氧化/還原平衡狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激。ROS可引發(fā)組織細(xì)胞DNA氧化損傷、脂質(zhì)過氧化、蛋白變性或失活，并參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，衰老、神經(jīng)退行性病變、炎癥性疾病和癌癥等其他重大疾病也與氧化應(yīng)激有關(guān)[10]。細(xì)胞內(nèi)存在有效的抗氧化防御系統(tǒng)，抗氧化酶類如SOD、CAT和GSH-Px在消除ROS的過程中起著至關(guān)重要的作用[11]。Mahalakshmi等[12]以100 mg·kg-1ACN經(jīng)飲水染毒雄性Wistar大鼠，14 d和28 d后大鼠腦組織GST含量顯著減少，SOD、CAT和GSH-Px活性均顯著降低。本研究表明，11.5 mg·kg-1的ACN暴露導(dǎo)致大鼠腦組織CAT活性降低，提示CAT可保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷，但23.0 mg·kg-1和46.0 mg·kg-1ACN暴露組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是CAT通過代償性升高來催化H2O2生成無毒的H2O和O2，使H2O2不會(huì)被金屬離子催化分解為毒性更強(qiáng)的·OH。GSH-Px是含有巰基催化過氧化物分解的酶，其活性的高低間接反映機(jī)體清除活性氧的能力。46.0 mg·kg-1ACN組大鼠腦組織GSH-Px活性與對照組比較降低，其原因可能是GSH-Px在清除機(jī)體內(nèi)過量的過氧化物過程中被大量消耗，同時(shí)自由基攻擊GSH-Px的巰基部位引起酶活性的降低[13]。GSH是機(jī)體內(nèi)重要的非酶性小分子抗氧化劑，通過非酶促反應(yīng)清除單線態(tài)氧和·OH，是機(jī)體抵抗氧化損傷的第一道防線[14]。本次研究發(fā)現(xiàn)，23.0 mg·kg-1和46.0 mg·kg-1ACN組大鼠腦組織GSH含量降低，這與金娜等[15]的研究結(jié)果相一致，ACN及其代謝產(chǎn)物2-氰環(huán)氧乙烷(2-cyanoethyleneoxide, CEO)在體內(nèi)與GSH結(jié)合，GSH被消耗。CEO經(jīng)環(huán)氧化物水解酶水解后釋放CN-，CN-抑制線粒體呼吸鏈和抗氧化酶CAT和GSH-Px活性導(dǎo)致組織發(fā)生氧化損傷[16-17]。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量能間接反映生物膜系統(tǒng)受外源化學(xué)物氧化損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，各劑量染毒組大鼠腦組織MDA含量均明顯升高，這與國外學(xué)者的研究結(jié)果相似[18]，說明ACN可致大鼠腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激。

NAC是一種機(jī)體內(nèi)清除自由基的強(qiáng)有力親核試劑，也是細(xì)胞的巰基供應(yīng)體，可競爭性地阻止自由基與抗氧化酶發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)也可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)GSH的合成，減弱機(jī)體氧化損傷程度[19-20]。Esmat等[21]以5 mmol·L-1ACN處理大鼠原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GSH含量降低，MDA含量增加，并產(chǎn)生大量的CN-，NAC干預(yù)后可降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量、升高GSH含量，與ACN和/或其代謝產(chǎn)物反應(yīng)，阻止其轉(zhuǎn)化為CN-以及隨后的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)消耗。本研究發(fā)現(xiàn)，通過300 mg·kg-1NAC干預(yù)后，大鼠腦組織SOD活性升高，MDA含量及CAT活性均降低，提示NAC可調(diào)節(jié)ACN引起的機(jī)體氧化還原失衡狀態(tài)，使機(jī)體免受氧化損傷。

炎癥反應(yīng)是指當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)外在刺激時(shí)產(chǎn)生的一種自我保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。IL-6在自然免疫向獲得性免疫轉(zhuǎn)變的過程中起著關(guān)鍵作用，可促進(jìn)單核細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)B細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體以及T細(xì)胞的活化和增殖。IL-1有IL-1α和IL-1β這2種分子形式，正常生理狀態(tài)下腦組織中IL-1β濃度非常低，在發(fā)生創(chuàng)傷性腦損傷時(shí)，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速釋放IL-1β，神經(jīng)元發(fā)生腫脹、萎縮，隨后消失溶解，神經(jīng)元數(shù)目減少[22]。TNF有2種同源蛋白受體TNFR1和TNFR2，可通過激活下游NF-κB信號(hào)通路募集促炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，ACN染毒后，大鼠腦組織IL-6、IL-1β和TNF-α濃度均升高，提示ACN可誘導(dǎo)大鼠腦組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。

Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)是吞噬細(xì)胞表面的一種模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，可以識(shí)別一種或多種病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，對侵入機(jī)體的病原體迅速產(chǎn)生應(yīng)答，產(chǎn)生急性炎癥，調(diào)節(jié)機(jī)體的獲得性免疫反應(yīng)[24-25]。TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，分為胞外段、胞內(nèi)段和跨膜區(qū)3個(gè)部分，胞外段可識(shí)別PAMPs；跨膜區(qū)由半胱氨酸組成，胞內(nèi)段與IL-1受體同源，被稱為Toll/IL-1受體(Toll/interleukin-1 receptor, TIR)，即TIR區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域招募下游銜接蛋白形成復(fù)合體，將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)[26]。TLR4信號(hào)通路分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性/TRIF依賴性2條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，TLR4的TIR與MyD88連接，MyD88與IRAK-1及其配體結(jié)合，IRAK-1在激酶的作用下高度磷酸化，脫離MyD88與TNF受體相關(guān)因子6(TRAF-6)結(jié)合，TAK-1被TRAF-6激活后介導(dǎo)NF-κB抑制因子IκB磷酸化，激活NF-κB，與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子區(qū)域的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12基因的轉(zhuǎn)錄[27-28]。

NF-κB是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞未受刺激時(shí)，NF-κB二聚體p65/p50與其抑制蛋白IκB以無活性的三聚體復(fù)合物p65/p50·IκB存在于胞質(zhì)中，阻止NF-κB活化后向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。當(dāng)受到紫外線、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、IL-6、IL-1β、TNF-α及ROS等多種刺激時(shí)，該三聚體被激活，進(jìn)而激活I(lǐng)KK，使IκB磷酸化并發(fā)生泛素化，最后被26S蛋白酶小體識(shí)別并降解，NF-κB從胞質(zhì)易位到細(xì)胞核，活化后的NF-κB可上調(diào)下游多種促炎性因子(如IL-1、IL-6、TNF-α和IL-8)、黏附分子和趨化因子mRNA表達(dá)水平并產(chǎn)生次級(jí)炎癥介質(zhì)的酶(圖5)。同時(shí)NF-κB可被這些下游細(xì)胞因子再次刺激，造成炎癥反應(yīng)的持續(xù)或放大[29]。

圖5 NF-κB信號(hào)通路機(jī)理圖Fig. 5 Mechanism diagram of NF-κB signaling pathway

本次研究表明，ACN染毒后，大鼠腦組織IKKα、NF-κB和TLR4 mRNA相對表達(dá)水平均上調(diào)，IKKα、p-IKKα/β、IκBα、p-IκBα、NF-κB和TLR4蛋白相對表達(dá)量均升高，提示ACN誘導(dǎo)大鼠發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，TLR4參與了ACN染毒后NF-κB的活化。本研究發(fā)現(xiàn)，IκBαmRNA和蛋白相對表達(dá)量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其可能原因是IκBα基因啟動(dòng)子中的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)誘導(dǎo)IκBα基因表達(dá)迅速上調(diào)，當(dāng)胞漿內(nèi)IκBα濃度減少后，IκBα通過自身的負(fù)反饋調(diào)節(jié)NF-κB的活性，維持細(xì)胞的自身穩(wěn)定性[30-31]。經(jīng)300 mg·kg-1NAC干預(yù)后，與46.0 mg·kg-1ACN組比較，大鼠腦組織IKKα和NF-κB mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，p-IKKα/β和NF-κB蛋白相對表達(dá)量均下降，說明NAC通過拮抗ACN誘導(dǎo)腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激，抑制NF-κB的活化。

綜上所述，在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，ACN通過誘導(dǎo)大鼠腦組織氧化/抗氧化失衡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，這可能是ACN致大鼠腦損傷的機(jī)制之一。NAC干預(yù)可拮抗ACN誘導(dǎo)腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激，抑制NF-κB的活化。