大氣PM2.5全身暴露對大鼠多臟器病理、氧化應激指標和炎癥因子的影響

白麗榮，譚子康，龔航遠，耿紅，董川，李瑞金

山西大學環(huán)境科學研究所，太原 030006

細顆粒物(PM2.5)是我國主要的大氣污染物及霧霾的主要成因。太原市大氣全年PM2.5質量濃度在冬季最高，超標嚴重，太原市10月超標污染物主要是PM2.5和PM10，超標時間均為14 d，超標率為64%，而11月除了顆粒物外，SO2也超標，PM2.5、PM10和SO2超標時間分別為10、9和4 d，超標率分別為56%、50%和22%。采暖開始后的約2周內(11月1—16日)，大氣PM2.5和PM10平均質量濃度分別為(57.7+31.3) μg·m-3和(108.2±48.8) μg·m-3，較采暖前有所下降，均未超標；11月17—23日其平均質量濃度分別為(133.0±44.5) μg·m-3和(213.5+55.5) μg·m-3，大氣PM2.5和PM10濃度大幅上升，超標倍數(shù)增加。太原市大氣中PM2.5的主要成分是有機碳(OC)、元素碳(EC)、硫酸鹽、硝酸鹽和銨鹽，金屬元素成分包括Na、K、Zn、Pb、As、Cd和Cu[1]?；剂先紵⒐I(yè)生產(chǎn)排放、汽車尾氣、生物質燃燒和道路揚塵是我國PM2.5的主要來源。國際癌癥研究機構確定空氣顆粒物為人類一類致癌物[2]。許多流行病學研究顯示，PM2.5暴露導致呼吸系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及肺癌的發(fā)病率和死亡率上升[3-4]，其毒理機制主要涉及氧化應激損傷機制和炎癥介質機制[5]。PM2.5對肺、心臟和腦的健康效應和毒性研究是人們關注的主要課題。

胃腸道和肝臟屬于機體的消化系統(tǒng)，脾臟屬于免疫系統(tǒng)，腎臟屬于泌尿系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露與胃癌、慢性腎病和肝癌的發(fā)生有關[6-8]。毒理學研究也表明，PM2.5可引起肝臟、腎臟、腸道和脾臟損傷效應[9-14]。這說明，人們不僅非常關注PM2.5對心肺和神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究，同時也注意到PM2.5對全身其他器官的影響，PM2.5的全身毒性效應研究正被逐漸重視。

在PM2.5毒理學相關研究中，實驗動物暴露方式有滴注(氣道滴注和鼻滴注)[10,12,15-16]和全身暴露[9,11,17]。動物全身PM2.5吸入系統(tǒng)主要有濃縮式和實時暴露2種，目前已成為科學的PM2.5暴露研究手段。采用PM2.5混懸液人工氣道滴注的方法與動物吸入暴露的方式有差別，全身吸入暴露系統(tǒng)更能模擬動物在現(xiàn)實大氣實際暴露的情境，已成為人們更認可的暴露模式。

太原市工業(yè)以煤炭、焦化和冶金為主，大氣污染以煤煙型為主，特別是其盆地結構和嚴重的冬季輻射逆溫，加劇了大氣污染。本研究于2018年11月中旬開始采用全身PM2.5真實暴露模型(通氣籠暴露系統(tǒng))進行SD大鼠暴露實驗，分別暴露1個月和2個月，研究了太原市冬季PM2.5亞慢性暴露對大鼠肝、腎、胃、脾和小腸的病理損傷、脂質過氧化效應和炎癥因子變化，揭示PM2.5對消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的損傷效應，為研究PM2.5全身性毒性機制提供實驗數(shù)據(jù)。這種PM2.5真實暴露模型模擬現(xiàn)實生活中PM2.5亞慢性暴露情境，籠內動物吸入PM2.5，符合實際情況，更有助于揭示PM2.5真實致病機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 暴露系統(tǒng)

本研究采用了一個獨特新穎的PM2.5暴露系統(tǒng)(IVC通氣籠)，購自蘇州市君圣實驗動物設備有限公司。該系統(tǒng)的特點是實驗動物可在通氣籠內全身暴露、真實吸入大氣環(huán)境PM2.5。對照籠使用3層HEAP過濾膜，有效阻擋了顆粒物，使得籠內PM2.5濃度低于TSI顆粒物測定儀的檢出限(1 μg·m-3)；暴露籠使用特殊的過濾膜，只允許PM2.5顆粒進入籠內。經(jīng)測定，籠內PM2.5濃度約為室外大氣濃度的70%，即61 μg·m-3。實驗過程中嚴密監(jiān)測籠內氣象條件，保持相對恒定的溫度(22～27 ℃)、濕度(30%～40%)，溫/濕度通過儀器顯示屏控制，在顯示屏上設定適宜的溫濕度后儀器自動調整，并保證PM2.5暴露籠內的物理條件與對照籠一致。

1.2 動物分組

健康清潔級雄性SD大鼠20只，購自北京中國人民解放軍醫(yī)學科學院實驗動物中心，體質量(157.5±7.93) g，購入后在本研究室動物房飼養(yǎng)。20只大鼠隨機分為對照組(1個月和2個月)和PM2.5暴露組(1個月和2個月)，共4組，每組5只。在實驗過程中，大鼠被安置在對照籠和暴露籠中，分別連續(xù)暴露1個月和2個月(每天24 h，每周7 d)。PM2.5組大鼠全身暴露吸入真實環(huán)境大氣PM2.5；對照組大鼠吸入無顆粒物的空氣。光照和暗周期均為12 h。動物可隨意獲得食物和水。每3天更換一次籠內墊料。

1.3 大鼠組織的臟體比與組織病理學分析

暴露結束后，大鼠引頸脫臼處死，解剖、分離小腸、肝臟、脾臟、胃和腎臟組織。分別稱量大鼠體質量及肝、脾、胃和腎的質量，計算其臟器系數(shù)(%)(臟器質量/動物體質量×100%)。后分別取不同組大鼠5個組織(每個組織約5 mm3)固定于福爾馬林溶液中，石蠟包埋，制成5 μm的切片，脫蠟，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，脫水透明，中性樹膠固定，封片，顯微鏡下觀察。

1.4 促炎因子和脂質過氧化指標測定

取組織樣品，剪取0.1 g組織、加入1 mL生理鹽水于冰浴上進行組織勻漿，組織勻漿液離心后(3 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，收集上清液。采用ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)測定大鼠肝、腸、脾、胃和腎組織勻漿液中白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平；采用特定生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。具體操作步驟按照試劑盒說明書嚴格進行。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示，應用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用最小顯著性差異法(LSD)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果(Results)

2.1 PM2.5暴露組和對照組大鼠臟器系數(shù)變化

與對照相比較，1個月暴露組大鼠肝、脾和腎臟器系數(shù)增加有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。2個月暴露組和1個月暴露組相比，各組織臟器系數(shù)變化的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。如表1所示，PM2.5暴露后動物體質量較相應對照組增加較大；而臟器質量變化較小。

表1 PM2.5暴露對大鼠主要臟器系數(shù)的影響Table 1 Influence of PM2.5 exposure on main organ coefficients in rats

2.2 PM2.5暴露引起各組大鼠組織病理學變化

腸HE染色結果表明，對照組大鼠結腸黏膜上皮細胞完好，主要為單層柱狀上皮，腸腺有序排列規(guī)則整齊，未見損傷及炎性改變(圖1(a)和圖1(c))。與對照組相比，1個月暴露組大鼠結腸黏膜上皮細胞結構紊亂，腸腺排列不整齊(圖1(b))。2個月暴露組大鼠結腸損傷嚴重，表現(xiàn)為腺體壞死、萎縮，黏液分泌減少，固有層與黏膜下層有部分炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞等浸潤(圖1(d))。

圖1 4組大鼠腸組織病理學改變情況(HE染色，200×)Fig. 1 Pathological changes of intestine in four groups of rats (HE staining, 200×)

肝臟對照組的肝細胞以中央靜脈為中心向周圍放射狀排列，無明顯異常(圖2(a)和圖2(c))。與對照組相比，1個月暴露組大鼠肝組織結構紊亂，有少量出血現(xiàn)象(圖2(b))。2個月暴露組出現(xiàn)明顯脂肪變性，肝細胞水腫，肝細胞渾濁，可見個別細胞壞死和炎細胞浸潤(圖2(d))。

圖2 4組大鼠肝組織病理學改變情況(HE染色，200×)Fig. 2 Pathological changes of liver tissue in four groups of rats (HE staining, 200×)

脾臟HE染色結果表明，對照組大鼠脾白髓邊緣區(qū)的界線清晰，均勻致密藍染且組織排列有序(圖3(a)和圖3(c))；與對照組比較，PM2.5染毒組脾臟有明顯的結構異?，F(xiàn)象，紅髓和白髓的界線不清楚，團塊狀結構消失且有炎性細胞浸潤。2個月PM2.5暴露大鼠脾臟損傷比1個月暴露更嚴重，伴有大量充血現(xiàn)象(圖3(b)和圖3(d))。

圖3 4組大鼠脾組織病理學改變情況(HE染色，200×)Fig. 3 Pathological changes of spleen in four groups of rats (HE staining, 200×)

腎臟對照組無明顯異常，各曲管上皮排列有序(圖4(a)和圖4(c))。PM2.5的1個月暴露組有不同程度腎間質水腫和腎介質炎性細胞浸潤，腎小管再生，再生細胞呈現(xiàn)多形，有明顯出血現(xiàn)象(圖4(b))。PM2.5的2個月暴露組有腎小球固縮，腎小管上皮細胞水腫，有明顯出血現(xiàn)象(圖4(d))。

圖4 4組大鼠腎組織病理學改變情況(HE染色，200×)Fig. 4 Pathological changes of kidney in four groups of rats (HE staining, 200×)

HE染色結果表明，對照組大鼠無明顯異常(圖5(a)和圖5(c))。1個月暴露組大鼠胃體部淺層黏膜上皮細胞充血(圖5(b))。2個月暴露組大鼠胃體部淺層黏膜上皮細胞變性壞死，深部細胞排列疏松，間質水腫，有少量上皮細胞核溶解消失，殘存少數(shù)核碎片(圖5(d))。

圖5 4組大鼠胃組織病理學改變情況(HE染色，200×)Fig. 5 Pathological changes of stomach in four groups of rats (HE staining, 200×)

2.3 PM2.5對大鼠各組織IL-6和TNF-α水平的影響

由圖6可知，PM2.5暴露組大鼠各組織中的IL-6(圖6(a))和TNF-α(圖6(b))表達均上升，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。2個月PM2.5暴露組大鼠5個組織中IL-6和TNF-α水平與1個月PM2.5暴露組相比沒有顯著差異。

圖6 PM2.5暴露對大鼠各組織白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響注：與對照組相比，a P<0.05，b P<0.01。Fig. 6 Effects of PM2.5 exposure on interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in rat tissuesNote: Compared with the control, a P<0.05, b P<0.01.

2.4 PM2.5對大鼠各組織SOD活性和MDA含量影響

由圖7(a)可知，大鼠腸、脾、腎和胃組織中SOD活性均有不同程度的增加，其中，1個月PM2.5暴露組大鼠腸、脾和腎組織以及2個月暴露組大鼠胃組織中SOD活性較對照組有顯著性差異(P<0.05)，2個月PM2.5暴露組大鼠腸、脾和腎組織SOD活性與對照組相比具有顯著差異(P<0.01)。而2個月PM2.5組大鼠肝組織和1個月PM2.5組胃組織中SOD活性較對照組雖有增加但并無顯著性差異。

圖7 PM2.5暴露對大鼠各組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響注：與對照組相比，a P<0.05，b P<0.01；與1個月暴露組相比，*P<0.05。Fig. 7 Effects of PM2.5 exposure on superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in different tissues of ratsNote: Compared with the control, a P<0.05, b P<0.01; compared to 1-month of exposure, *P<0.05.

不同組大鼠5種組織中MDA含量如圖7(b)所示。與對照組相比，PM2.5暴露后大鼠各組織中MDA含量都顯著上升，有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。1個月PM2.5暴露組大鼠腸、肝、腎和胃組織和2個月PM2.5暴露組大鼠腸、脾組織分別較對照組中MDA含量有顯著性差異(P<0.05)。1個月PM2.5暴露組大鼠脾組織和2個月PM2.5暴露組大鼠肝、腎、胃組織中MDA含量與對照組相比有顯著差異(P<0.01)。2個月PM2.5暴露組大鼠肝、腎和胃組織中MDA含量與1個月PM2.5暴露組相比，具有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

當前我國大氣PM2.5污染還未全面解決，許多地區(qū)PM2.5污染加重，灰霾現(xiàn)象頻繁發(fā)生，嚴重影響空氣環(huán)境質量和人們的身體健康。PM2.5粒徑小，比表面積大，含有無機、有機和微生物等多種有害物質，進入人體后對健康造成極大危害，PM2.5全身性損傷效應和毒性機制研究是我國大氣污染研究關注的焦點。

早期PM2.5毒理學研究的動物暴露模式多采用氣道滴注和口鼻式滴注方式進行顆粒物染毒[11,13,15-16]，這種方式的局限性在于動物不是通過自然呼吸空氣染毒、且滴注過程中對動物有機械損傷，不適宜開展較為長期的滴注暴露。近年來，全身暴露染毒系統(tǒng)逐漸興起，通過模擬顆粒物或PM2.5暴露探討其對機體的毒性效應及機制，這種方式更為科學，也符合實際顆粒物暴露情境。由于城市大氣PM2.5污染受到污染源、地形和氣象因素影響，PM2.5污染特征及化學組分存在較大差異，PM2.5暴露引起的健康危害及毒理學機制較為復雜。太原市具有特殊的工業(yè)污染、盆地地形和冬季輻射逆溫特點，污染物不易擴散，大氣污染較為嚴重。鑒于此，本研究在太原市這一典型地區(qū)，利用全身暴露染毒系統(tǒng)(IVC通氣籠)，控制溫度、濕度、氣壓、空氣流速和噪音等條件，對大鼠進行PM2.5實時暴露(暴露期間籠內PM2.5平均濃度約為61 μg·m-3)和亞慢性吸入染毒，研究PM2.5對不同組織的損傷效應，為PM2.5與全身性毒性研究提供動物實驗基礎。

HE染色結果是評價動物病理效應的常用方法。本研究結果表明，PM2.5暴露1個月和2個月對大鼠肝、腎、脾、胃和小腸均造成了不同程度的病理損傷，且PM2.5暴露2個月大鼠5種臟器的病理損傷效應和比暴露1個月嚴重，提示PM2.5對多種器官存在病理損傷效應，PM2.5暴露時間越長，組織損傷越嚴重，暴露2個月的時間該病理損傷效應未得到修復或緩解。

臟器系數(shù)是毒理學研究的常用指標。由表1所示，1個月暴露組SD大鼠肝和腎的臟器系數(shù)比對照組顯著增加，且超出了文獻推薦的8～12周SD大鼠正常參考值范圍[18]，提示肝和腎可能是PM2.5毒作用的靶器官。2個月暴露組各組織的臟器系數(shù)比1個月暴露組顯著下降，這可能與年齡增長、動物體質量增加有關。

MDA是膜脂質過氧化效應和氧化應激的重要標志物[19]。PM2.5暴露1個月和2個月后大鼠各組織中MDA含量與對照組相比顯著升高，表明PM2.5引起細胞膜脂質過氧化效應，這可能是PM2.5造成組織損傷的原因之一。PM2.5暴露2個月后大鼠肝、腎和胃組織中MDA含量的增加與1個月暴露組相比有顯著統(tǒng)計學意義，提示肝、腎和胃組織發(fā)生了顯著的脂質過氧化效應?；钚匝?ROS)介導的氧化應激與疾病的發(fā)生有關，SOD具有清除超氧陰離子自由基的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露引起大鼠5個組織的SOD活性水平增加，在腎、脾、胃和小腸中的變化與對照組相比有顯著性差異。我們推測PM2.5暴露導致機體內產(chǎn)生了較多ROS，在太原冬季PM2.5污染的條件下，SOD活性被激發(fā)以清除活性氧自由基。組織中MDA含量增加，反映出SOD活性增加沒有有效減少ROS堆積，氧化應激效應依然存在。文獻報道顯示，在不同的PM2.5暴露濃度、暴露時間和暴露模式下，PM2.5引起了實驗動物肝、脾、腎和腸道的病理損傷和氧化應激效應[10-13]，這與本研究結果一致。

除氧化應激外，炎癥反應是決定多器官損傷嚴重程度和疾病發(fā)生的關鍵因素[6,12,21]。由炎癥因子測定結果可知，PM2.5引起大鼠5個組織IL-6和TNF-α水平增加，其中，肝和小腸中的水平與對照組相比有顯著性差異，這說明PM2.5可使多種組織出現(xiàn)炎癥反應，而這種反應有組織差異性，肝和小腸對PM2.5的刺激較為敏感。文獻報道，PM2.5通過ROS介導線粒體自噬引起肝細胞纖維化，通過內質網(wǎng)應激引起肝細胞凋亡和炎癥，通過肝細胞氧化應激和炎癥引起的脂質代謝異常[13-15]，這些機制可能和肝癌和非酒精性肝病的發(fā)病有關。PM2.5不僅引起小鼠小腸病理損傷，且PM2.5慢性暴露引起小鼠腸道功能紊亂，并影響了糖代謝異常[22]。這說明PM2.5致肝和小腸的損傷機制與代謝和疾病的發(fā)生有關，其毒性效應研究應引起重視。

綜上，結合臟器系數(shù)、HE染色、炎癥因子和MDA結果，我們發(fā)現(xiàn)PM2.5亞慢性暴露造成大鼠多種組織出現(xiàn)不同程度病理損傷、臟器系數(shù)異常改變、脂質過氧化效應和炎癥因子水平升高，且PM2.5暴露2個月的損傷效應大于1個月。相對而言，肝臟、小腸和腎臟受到PM2.5的負面影響較大。有研究報道，上海市大氣PM2.5暴露對心肌和肺功能有損傷[23]。廣州、深圳、東莞和肇慶4個城市的大氣PM2.5均可使大鼠肺組織發(fā)生氧化應激和炎性反應。其中，廣州、東莞和深圳的PM2.5對指標的影響較肇慶強[24]。已有對太原市的研究表明，PM2.5暴露可以通過誘導炎癥反應以及炎癥因子的表達從而導致心血管疾病發(fā)生[25]。不同采樣點的PM2.5由于成分組成不同而毒性毒理有很大差異，本文結論僅針對所采集具體樣本。由于目前在全身暴露染毒系統(tǒng)實驗條件下，無法分離PM2.5和氣態(tài)污染物，因此推測雄性SD大鼠暴露器官異?？赡苁荘M2.5和氣態(tài)污染物共同影響的結果。PM2.5對消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的健康效應和毒性作用機制還需進一步的實驗研究。