不同pH值下銻(V)對大麥根伸長的毒性及其生物配體模型的構(gòu)建

郭煊，王學(xué)東,*，李菊梅，馬義兵

1. 首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院，北京 100048 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081 3. 澳門科技大學(xué)澳門環(huán)境研究院，澳門 999078

中國的銻(Sb)儲量大約3.0×106～3.5×106t，超過世界Sb儲量的50%[1]。根據(jù)美國地質(zhì)調(diào)查局國家礦產(chǎn)信息中心公布的數(shù)據(jù)，中國在2018年仍然是全球最大的Sb生產(chǎn)國，占全球Sb產(chǎn)量的70%以上[2]。

近幾年間，由于采礦和冶煉、垃圾焚燒、煤炭和石油燃燒等人類活動日益頻繁，越來越多的Sb元素進入到環(huán)境中[3]。Sb礦的開采對周邊環(huán)境影響較為明顯，在中國湖南省錫礦山礦區(qū)采礦和冶煉過程中產(chǎn)生了大量的固體廢物，礦山北部沿廢物堆和尾礦池的徑流處觀察到最高的Sb濃度達到39.16 mg·L-1[3]，與世界其他受污染地點報告的最高Sb濃度相似[4]。對安徽省3個煤礦采集的33個土壤樣品分析發(fā)現(xiàn)超過75%的樣品出現(xiàn)嚴重的Sb污染[5]。

Sb是一種對動植物均存在毒害作用的元素，可造成動物組織病變，植物生長不良、枯萎等毒性影響。林祥龍等[6]對跳蟲進行的Sb毒性試驗表明，設(shè)置的濃度范圍內(nèi)Sb(Ⅴ)不會直接造成其明顯死亡，但會對跳蟲生理行為和繁殖產(chǎn)生一定毒性影響。對小鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)，Sb2O3可引起肺組織炎性病變，肝臟小片壞死，急性實質(zhì)性心肌炎病變等毒害作用[7]。植物Sb中毒的癥狀主要表現(xiàn)為生長緩慢、植株矮小、葉片瘦小及根系生長不良，嚴重時還會出現(xiàn)葉片發(fā)黃乃至植物枯萎[8-9]。較高的Sb濃度會顯著抑制葉片和根系生物量的產(chǎn)生，并且Sb在植物中的積累會導(dǎo)致植物必需營養(yǎng)素濃度的變化[10]。

土壤環(huán)境中過量的Sb會通過食物鏈等途徑進入人體。Sb對人體的急性毒性臨床表現(xiàn)為結(jié)膜炎、視神經(jīng)損傷、嘔吐、腹瀉和血尿等癥狀，慢性毒性主要表現(xiàn)為肺功能改變、慢性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病以及心血管系統(tǒng)和腎臟病變，此外，Sb還具有潛在的致癌風(fēng)險[11]?；诖?，了解Sb在土壤環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化行為對于預(yù)防和控制土壤Sb污染具有重要意義。

許多研究表明，在土壤溶液中，Sb主要以Sb(Ⅴ)的形式存在。在廣泛的氧化還原條件(360～140 mV)下，Sb僅以五價形式存在于土壤及土壤孔隙水中[12-13]，即使在厭氧條件下，土壤也可作為促進Sb(Ⅲ)氧化的催化劑[14]，可見土壤中以五價形態(tài)存在的Sb幾乎占總Sb量的90%以上[1]。

環(huán)境中的pH值和氧化還原條件在很大程度上決定了金屬元素的形態(tài)，Wilson等[15]繪制了不同系統(tǒng)下的pe-pH圖，表明了pH值對Sb的形態(tài)變化具有重要影響。我國土壤種類復(fù)雜多樣，土壤pH差異大，不同pH土壤Sb毒性可能會千差萬別。pH值通過改變金屬離子的化學(xué)形態(tài)或者與金屬競爭生物配體結(jié)合位點進而影響金屬離子的生物有效性和毒性，已有研究表明，pH從4.5到8.5，Cr(Ⅵ)和Ni毒性分別變化了4.73倍和7.28倍，隨pH從4.5升高至8.0，Cu毒性變化了9倍[16-18]。因此，pH值被認為是影響金屬離子在土壤中生物有效性的最重要因素[19]。

最近，生物配體模型(BLM)常被用于水體和土壤環(huán)境中量化pH及金屬的一些伴隨離子對金屬毒性的影響[20]。目前，已有關(guān)于Cu、Ni、Zn、Cd和Cr等金屬元素毒性預(yù)測BLM的報道[16-19, 21-22]，但關(guān)于Sb毒性的BLM還鮮見報道?；诖?，本研究采用水培試驗的方法，探索pH對Sb毒性的影響及其機制，并利用BLM理論建立其量化關(guān)系，從而為土壤中Sb風(fēng)險評價提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

化學(xué)試劑：六羥基銻酸鉀(KSb(OH)6)、CaCl2、NaOH、HCl、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid, MES)和3-(N-嗎啡啉)乙磺酸(3-(N-morpholino) propane sulfonic acid, MOPS)，均為分析純，均購于北京百靈威科技有限公司。試驗用塑料燒杯購于北京宏達科萊科技有限公司。大麥品種采用河南省農(nóng)科院培育的駐大麥六號。

1.2 溶液配制

采取單因素控制的方法，設(shè)置9個pH組，分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。在每一個pH值梯度設(shè)置7個Sb(Ⅴ)濃度，分別為0、0.0951、0.1902、0.3804、0.7607、1.5215、和3.043 mmol·L-1，溶液pH值采用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)，采用1 mmol·L-1MES(pH<7.0)和3.6 mmol·L-1MOPS(pH≥7.0)作緩沖劑，以往研究證明MES和MOPS不與金屬絡(luò)合，不影響金屬形態(tài)及其毒性[18, 23]。采用0.2 mmol·L-1CaCl2作為背景溶液。所有溶液都使用去離子水配制，每個處理均設(shè)置3個重復(fù)。溶液pH測定采用pH計(Delta320; Mettler, Zurich, Switzerland)。

1.3 大麥根伸長抑制試驗

大麥根長試驗采用ISO11269-1方法[24]，使用廣口塑料燒杯作為培養(yǎng)容器，選擇健康飽滿的大麥種子，用去離子水沖洗干凈，放置于底層鋪有滅菌濾紙的玻璃培養(yǎng)皿上，并用去離子水沒過種子，在20 ℃、無光照條件下放置36 h，待胚根長至2 mm后移至裝有溶液的培養(yǎng)杯中，每杯6個。培養(yǎng)條件為白天光照14 h，溫度為(24±2) ℃；夜間光照為10 h，溫度為(18±2) ℃。光照強度為25 000 lx。大麥生長約5 d后測定根長，并計算不同Sb濃度處理下的大麥相對根伸長(RE)(%)。

(1)

式中：REt為不同Sb濃度處理下的根伸長；REc為對照根伸長。

1.4 Sb(Ⅴ)形態(tài)預(yù)測

Sb(Ⅴ)形態(tài)通過Visual MINTEQ 3.0計算(http://hem.bredband.net/b108693/)。輸入的參數(shù)為pH以及Sb(Ⅴ)、K、Ca和Cl的離子濃度，設(shè)置CO2分壓為35.46375 Pa。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理

劑量-效應(yīng)曲線用log-logistic方程進行擬合[25]：

(2)

式中：y為相對于對照組的大麥根伸長(%)；x為Sb(Ⅴ)濃度；y0、a和b為擬合常數(shù)，a為log10(EC50)。利用擬合曲線求出不同評價指標(biāo)的EC50值及其相應(yīng)的95%置信區(qū)間。

1.6 生物配體模型的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)

c(TBL)=c(Sb(OH)6BL)+c(OHBL)+c(ClBL)+c(BL)

(3)

式中：c(TBL)為生物配體的絡(luò)合容量(mol·L-1)；c(XBL)為與陰離子結(jié)合的生物配體活度(mol·L-1)；c(BL)為未被絡(luò)合的自由配體活度(mol·L-1)。

(4)

式中：KXBL為條件結(jié)合常數(shù)，c(Xn-)為陰離子活度。

根據(jù)BLM的假設(shè)，當(dāng)競爭離子OH-和Cl-被考慮的時候，整個生物配體結(jié)合位點被Sb(Ⅴ)所占據(jù)的比例為f，即分配系數(shù)，其大小與生物量以及總配體數(shù)無關(guān)，可以表達為公式(5)。

(5)

當(dāng)達到50%抑制的時候，公式(5)可以轉(zhuǎn)化為

(6)

(7)

式中：β為模型參數(shù)。將公式(5)中的f帶入到公式(7)中，可得：

(8)

方程最優(yōu)化檢驗采用最小殘差平方和(RMSE)：

(9)

式中：N、n為處理的數(shù)據(jù)個數(shù)，Robserved大麥相對根伸長實測值(%)，Rpredicted為大麥相對根伸長預(yù)測值(%)。

2 結(jié)果與討論(Results and disscusion)

2.1 不同pH條件下Sb(Ⅴ)的形態(tài)分布

圖1 不同溶液pH下Sb(Ⅴ)的形態(tài)分布Fig. 1 The distribution of different Sb(Ⅴ) species as a function of pH

2.2 pH值對Sb(Ⅴ)毒性的影響

表1 不同pH條件下Sb(Ⅴ)對大麥根伸長的半數(shù)抑制效應(yīng)濃度(EC50)值及95%置信區(qū)間Table 1 The measured Sb(Ⅴ) toxicity threshold at 50% inhibition (EC50) in the different pH sets for barely root elongation with 95% confidence intervals

圖2 不同pH值下分別以和Sb(OH)5 (b)表示的EC50值變化曲線Fig. 2 The curve of EC50 as a function of pH expressed as (a) and EC50(Sb(OH)5) (b)

圖3 大麥相對根伸長隨和Sb(OH)5 (b)活度變化的劑量效應(yīng)曲線Fig. 3 Dose-response curve of barley root elongation as a function of (a) and Sb(OH)5 (b) activity

圖4 分別以和Sb(OH)5 (b)表示的EC50值與OH-活度的關(guān)系注：圖中實線為線性擬合結(jié)果。Fig. 4 The relationship between EC50 value and OH- activity expressed as (a) and Sb(OH)5 (b)Note: The solid line in the figure is the linear fitting result.

(10)

式中：KSb(OH)5BL和KOHBL是形成Sb(OH)5與OH-配合物的穩(wěn)定常數(shù)；將公式(10)代入公式(7)中，可得：

(11)

(12)

由上式可知離子濃度與根伸長RE之間的關(guān)系是非線性的，為了明確式中每個變量對RE的影響大小，分別對自變量進行靈敏性分析?？刂破渌兞坎蛔儯{(diào)整公式中某一變量，根據(jù)RE的變化量及斜率大小，可以判斷每個自變量的靈敏度。靈敏度反映自變量對RE的貢獻，較高的靈敏性表明該成分與大麥根配體位點有更強的親和力。

本文通過溶液模擬試驗探討了不同pH值對大麥根伸長Sb(Ⅴ)毒性的影響，得出的主要結(jié)論如下：

圖5 大麥相對根伸長(RE)分別與和Sb(OH)5 (c)的相關(guān)關(guān)系注：圖中實線為線性擬合結(jié)果。Fig. 5 The relationships between barley root elongation (RE) and OH- (a), (b) and Sb(OH)5 (c)Note: The solid line is the linear fitting result.

圖6 考慮和OH-活度后預(yù)測的大麥根伸長與實測大麥根伸長的相關(guān)關(guān)系Fig. 6 Correlation between predicted barley root elongation and measured barley root elongation after considering

(3)依據(jù)BLM方程，通過線性和非線性擬合獲得BLM參數(shù)，建立了BLM，其預(yù)測值與實測數(shù)據(jù)具有良好的相關(guān)關(guān)系(r2=0.95，P<0.001)，表明Sb(Ⅴ)的BLM可以很好地預(yù)測Sb(Ⅴ)對大麥根伸長毒性。