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    3種碳納米材料對斑馬魚生長發(fā)育、氧化應激及代謝的影響

    2020-04-08 02:22:04孫晶歐陽少虎胡獻剛周啟星
    生態(tài)毒理學報 2020年6期

    孫晶,歐陽少虎,胡獻剛,周啟星

    南開大學環(huán)境科學與工程學院,環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復與污染防治重點實驗室,天津 300071

    近幾年,碳納米材料(carbonaceous nanomaterials, CNMs)因其具有卓越的導電性、光學性質(zhì)、磁性和反應活性等性質(zhì)被廣泛應用于在醫(yī)學、物理學、化學、生物和環(huán)境保護等研究領域中,尤其是在細胞成像、藥物傳遞、生物傳感器和儲能等方向上[1-4]。隨著CNMs的快速發(fā)展與應用,很多與之相關的工業(yè)領域都產(chǎn)生了革命性的變化,因而CNMs也被認為是一種未來革命性的材料[2-4]。而氧化石墨烯(graphene oxide, GO)、碳納米管(carbon tube, CNT)和氧化石墨烯量子點(graphene oxide quantum dot, GOQD)作為CNMs家族重要組成成員,是其中的“佼佼者”且商業(yè)價值巨大[5-6]。預計到2027年,僅石墨烯類產(chǎn)品的年生產(chǎn)量有望達到3 800 t,年產(chǎn)值達30億美元。隨著CNMs在消費產(chǎn)品中的生產(chǎn)和使用日益增加,其釋放到生態(tài)環(huán)境且導致人類暴露的風險越來越大,了解其環(huán)境歸趨和潛在的健康和生態(tài)風險已成為人們關注的焦點[7]。

    目前,在自然水體、土壤、沉積物和生物體中均已檢測出CNMs的存在[7]。生物體很可能會接觸釋放到環(huán)境中的CNMs,了解這些暴露的影響很重要。目前,已經(jīng)有大量的文獻報道了CNMs對藻、魚、細菌和細胞的納米毒性效應[8-11]。通常而言,納米材料的自身性質(zhì),如尺寸、分散性、形狀、表面電荷和化學成分,會極大影響其生物效應[12]。但是,GO、CNT和GOQD這3種CNMs哪種材料的生態(tài)健康風險更低和更安全?對于這個問題還存在著大量的未知,而這對CNMs在未來的設計、生產(chǎn)和應用至關重要。斑馬魚是一種常用的模式生物,也是國際標準化組織(ISO)認可的5種魚類實驗動物之一,已經(jīng)成為發(fā)育生物學、遺傳學和毒理學等研究常用的模式生物[13-14]。因此,本研究選取GO、CNT和GOQD作為CNMs代表納米材料,比較了其對斑馬魚胚胎生長發(fā)育毒性的影響。其次,因為目前仍缺乏環(huán)境當量濃度下CNMs的毒理數(shù)據(jù)資料及詳細的致毒機理。在本研究中,根據(jù)Jia等[8]的工作,選取一個環(huán)境痕量濃度(0.01 mg·L-1)對斑馬魚成魚進行了長達21 d的亞急性毒性測試,并利用代謝組學技術對CNMs亞急性毒性機理進行了闡釋,為今后詳細闡述CNMs納米毒性機理提供新思路和技術支撐。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 CNMs與受試生物

    1.1.1 CNMs來源

    GO(貨號XF002-1)、CNT(貨號S07)和GOQD(貨號XF042),均購自中國南京先豐納米材料科技有限公司,其基本產(chǎn)品性質(zhì)如表1所示,具體形貌如圖1所示。

    1.1.2 受試生物

    6月齡的成年野生型斑馬魚(Daniorerio),購自國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center, CZRC)。

    1.2 CNMs形貌表征

    取少量GO和CNT粉末分別分散于40 mL無水乙醇(分析純,中國天津市康科德技術有限公司)中,冰浴超聲30 min,即為GO乙醇分散液和CNT乙醇分散液。取10 μL GOQD懸浮原液至40 mL無水乙醇中,冰浴超聲30 min后,即得到GOQD乙醇分散液。為測定材料的形貌,分別取10 μL GO、CNT和GOQD乙醇分散液滴于電鏡載網(wǎng)(AZH200,中國北京中鏡科儀技術有限公司)上,使用透射電子顯微鏡(TEM)(HT7700,日本Hitachi公司)觀察,電鏡工作電壓為80 kV;為觀察和測定材料的厚度,分別取10 μL GO、CNT和GOQD乙醇分散液滴在云母片上,使用原子力電子顯微鏡(AFM)(Dimention Icon,美國Bruker公司)進行觀察。AFM圖片用NanoScope Analysis 1.8軟件進行分析。

    1.3 斑馬魚的培養(yǎng)與CNMs暴露實驗

    1.3.1 斑馬魚培養(yǎng)

    斑馬魚飼養(yǎng)條件為:循環(huán)水箱培養(yǎng),培養(yǎng)水為海鹽濃度60 mg·L-1的人工海水,水溫為(28±0.5) ℃,光照周期為14 h光照∶10 h黑暗,每日投喂豐年蝦2次。斑馬魚胚胎的獲得:挑選個體大小相同雌雄斑馬魚于前一天晚上按照雌雄比1∶1放入產(chǎn)卵盒中,將雌魚和雄魚使用隔板隔開后,將產(chǎn)卵盒放入人工氣候培養(yǎng)箱中(SPX-300I-C,中國上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)。次日,在斑馬魚光照周期開始時取出產(chǎn)卵盒中的隔板,雌雄斑馬魚自然交配,1 h后,收集魚卵,得到斑馬魚胚胎。使用斑馬魚胚胎培養(yǎng)液E3溶液清洗干凈,其中,E3溶液組分為:5 mmol·L-1NaCl,0.17 mmol·L-1KCl,0.33 mmol·L-1CaCl2,0.33 mmol·L-1MgSO4,pH = 7.4。以上試劑均為分析純,購自中國天津市康科德科技有限公司。胚胎清洗干凈后將健康斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移到E3培養(yǎng)液中,置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至2.5 hpf(hours post fertilization),用于后續(xù)實驗研究。

    1.3.2 斑馬魚幼魚CNMs暴露

    準確稱取100 mg GO,使用E3培養(yǎng)液將其分散并定容至1 L,制成100 mg·L-1的GO分散液母液,冰浴超聲30 min至其充分分散后備用;取50 mL 100 mg·L-1的GO分散液使用E3稀釋至500 mL,得到10 mg·L-1的GO培養(yǎng)液,再次將其使用E3培養(yǎng)液逐級稀釋,得到1、0.1和0.01 mg·L-1的GO-E3培養(yǎng)液。CNT-E3與GOQD-E3培養(yǎng)液的配制方法與GO-E3培養(yǎng)液的配制方法步驟相同。將2.5 hpf斑馬魚胚胎暴露于E3培養(yǎng)液(空白對照組)以及0.01、0.1、1和10 mg·L-13種CNMs E3分散液中120 h。暴露實驗在96孔板中進行,每孔一枚受精卵。每隔24 h更換一次納米材料分散液。整個胚胎染毒實驗均在人工氣候培養(yǎng)箱中進行,培養(yǎng)箱溫度為(28±1) ℃,光照周期為光暗比14 h∶10 h。

    1.3.3 斑馬魚成魚CNMs暴露

    0.01 mg·L-1CNMs斑馬魚成魚暴露液的配制方法同1.3.2,但其分散系為60 mg·L-1海鹽人工海水。體型相近、性別隨機的斑馬魚成魚被隨機分為4組,每組6條,置于1 L燒杯中,燒杯中暴露液體積為1 L。對照組與暴露組均被置于人工氣候培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)箱溫度為(28±1) ℃,光照周期為光暗比14 h∶10 h。每日投喂2次商業(yè)魚飼料(中國惠州市寸金飼料有限公司)。對照組與暴露組培養(yǎng)液每隔一天更換一次,參考Jia等[8]的工作,斑馬魚成魚暴露總時長為21 d。

    表1 3種碳納米材料(CNMs)基本信息Table 1 The basic properties of three carbonaceous nanomaterials (CNMs)

    1.4 斑馬魚幼魚生長發(fā)育毒性觀察

    1.4.1 斑馬魚幼魚死亡和畸形觀察

    每個濃度取90尾2.5 hpf斑馬魚胚胎于96孔板中進行120 h的暴露實驗,設置3個生物重復,即每組包含30個斑馬魚胚胎。使用體視鏡(ZL 61,日本Olympus公司)觀察記錄斑馬魚胚胎/幼魚,以不運動、無心跳和血液不流動(因斑馬魚幼魚周身組織透明,體視鏡下可觀察到活體斑馬魚心臟跳動和血液流動,斑馬魚心臟區(qū)域如圖2所示)作為死亡標準統(tǒng)計暴露120 h后斑馬魚死亡率;每天在體視顯微鏡下觀察斑馬魚幼魚的畸形情況,以心包/卵黃囊水腫、尾/脊椎彎曲和面部畸形等標準進行判斷,最終統(tǒng)計各組發(fā)育至120 hpf的斑馬魚幼魚的畸形率。

    1.4.2 斑馬魚幼魚活性氧簇觀察

    斑馬魚幼魚活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的測定可以通過測定2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(中國北京索萊寶科技有限公司)通過細胞膜后生產(chǎn)DCF的熒光強度來實現(xiàn)。每個CNMs濃度組取24條發(fā)育至2.5 hpf斑馬魚胚胎于96孔板中暴露120 h,設置3個生物重復。暴露結(jié)束后,每組隨機取出4條斑馬魚幼魚,用E3培養(yǎng)液沖洗干凈后,在含5 μmol·L-1DCFH-DA的E3培養(yǎng)液中避光孵育0.5 h。染色結(jié)束后,用新鮮E3培養(yǎng)液沖洗幼魚6次,染色完成的斑馬魚在0.03%三卡因(純度99%,美國Sigma公司)中麻醉后,于倒置熒光顯微鏡(X71,日本Olympus公司)下觀察拍照,激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和535 nm。利用Image J軟件對斑馬魚平均熒光強度進行定量分析。

    1.4.3 斑馬魚幼魚線粒體膜電位觀察

    JC-1是檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。JC-1(美國Adipogen公司)紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變顯示線粒體膜電位下降。每個CNMs濃度組取24條發(fā)育至2.5 hpf斑馬魚胚胎于96孔板中暴露120 h,設置3個生物重復,即每組包含8條斑馬魚幼魚。暴露結(jié)束后,每組隨機取出4條斑馬魚幼魚,用E3溶液沖洗干凈后,在含4 μmol·L-1JC-1的E3溶液中避光孵育1 h。染色結(jié)束后,用新鮮E3溶液沖洗幼魚6次,染色完成的斑馬魚在0.03%三卡因中麻醉后,于倒置熒光顯微鏡(X71,日本Olympus公司)下觀察拍照,激發(fā)波長分別為488 nm和535 nm。利用Image J軟件對斑馬魚的平均熒光強度進行定量分析。

    1.5 斑馬魚成魚亞急性毒性測試

    1.5.1 魚腮和腎組織石蠟切片的制作及β-半乳糖苷酶染色

    斑馬魚成魚暴露于CNMs分散液21 d后,將其取出,使用0.06%三卡因溶液安樂死后迅速于冰上解剖,取出斑馬魚成魚的腮和腎臟置于4%多聚甲醛溶液(中國鼎國生物科技有限公司)固定,并將其置于4 ℃冰箱過夜。過夜后組織使用自來水流水沖洗24 h,之后進行脫水浸蠟,其過程為:70%乙醇,30 ℃,30 min;85%乙醇,30 ℃,10 min;95%乙醇,30 ℃,10 min;100%乙醇Ⅰ,30 ℃,10 min;100%乙醇Ⅱ,30 ℃,30 min;二甲苯/乙醇,30 ℃,30 min,二甲苯Ⅱ,30 ℃,15 min;二甲苯Ⅲ,30 ℃,15 min;石蠟Ⅰ,60 ℃,20 min;石蠟Ⅱ,60 ℃,10 min;石蠟Ⅲ,60 ℃,10 min。浸蠟后的組織塊使用包埋機(EG1150H,德國LEICA公司)包埋,手動切片機(RM2235,德國LEICA公司)將組織切為5 μm切片后,展片烘干備用。斑馬魚組織切片β-半乳糖苷酶活性使用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(C0602,中國上海碧云天生物技術有限公司)檢測,檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

    1.5.2 丙二醛(MDA)含量測試

    斑馬魚成魚暴露于CNMs分散液21 d后,將其取出,使用0.06%三卡因溶液安樂死后,將斑馬魚表面清洗干凈,迅速于冰上將斑馬魚分割,置入玻璃勻漿器制成10%生理鹽水勻漿后使用冷凍離心機(5804 R,德國Eppendorf公司)在4 ℃下3 000 r·min-1離心10 min后取上清,隨后使用MDA測試試劑盒(A003-1-2,中國南京建成生物工程研究所)進行測定,上清液蛋白濃度使用蛋白質(zhì)含量試劑盒(A045-4-2,中國南京建成生物工程研究所)測定。試劑盒測定過程嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

    1.5.3 總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性測定

    斑馬魚成魚暴露于CNMs分散液21 d后,將其取出,使用0.06%三卡因溶液安樂死后,將斑馬魚表面清洗干凈,迅速于冰上將斑馬魚分割,置入玻璃勻漿器制成10%生理鹽水勻漿后使用冷凍離心機(5804 R,德國Eppendorf公司)在4 ℃下3 000 r·min-1離心10 min后取上清,隨后使用T-SOD測試試劑盒(A001-1-2,中國南京建成生物工程研究所)進行測定,上清液蛋白濃度使用蛋白質(zhì)含量試劑盒(A045-4-2,中國南京建成生物工程研究所)測定。

    1.6 代謝組學分析

    斑馬魚成魚暴露于CNMs分散液21 d后,將其取出,迅速置于液氮中5 min后取出,在液氮上的研缽中將組織研磨成粉末后進行代謝物提取。代謝物提取過程為:(1)在研磨好的樣品中加入15 mL提前保存于-20 ℃的提取混合溶液Ⅰ(V(甲醇)∶V(氯仿)∶V(水)=2.5∶1∶1);(2)微波輔助萃取,40 ℃,30 min,萃取完成后離心,收集上清液,然后加入15 mL提前保存于-20 ℃的提取混合溶液Ⅰ(V(甲醇)∶V(氯仿)∶V(水)=2.5∶1∶1) (用量與步驟(1)相同),微波輔助萃取,40 ℃,15 min;(3)收集第二次上清液,并與第一次收集的上清液混合于50 mL離心管中。加入500 μL滅菌后的去離子水,4 000 r·min-1離心5 min;(4)完成以上步驟后將離心管靜置,上層溶液是甲醇/水相,下層為氯仿相。甲醇/水相冷凍干燥,用氮氣吹干氯仿相;(5)樣品干燥后,采用兩步法進行衍生化。首先加入50 μL用吡啶溶解的甲氧氨基鹽酸鹽(20 mg·mL-1),密封、渦旋、短暫離心,30 ℃溫浴90 min;(6)加入80 μL硅烷化試劑N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA)(中國上海安譜實驗科技有限公司),37 ℃溫浴30 min;(7)轉(zhuǎn)移衍生化好的樣品到適合氣相質(zhì)譜(GC-MS)分析的內(nèi)襯管中。

    斑馬魚代謝物使用GC-MS(6890A/5977A,美國Agilent公司)進行分析。測試參數(shù)如下。(1)氣相色譜進樣參數(shù):進樣量1 μL,進樣口溫度230 ℃,調(diào)整分流進樣模式(1∶50),載氣為氦氣,流速2 mL·min-1,使用自動進樣器進樣。氣相色譜參數(shù):MDN-35毛細管色譜柱(30 m),溫度程序為80 ℃恒溫2 min,然后以15 ℃·min-1的速率升溫到330 ℃,持續(xù)6 min,傳輸線(transfer line)溫度設定為250 ℃。(2)質(zhì)譜參數(shù):離子源溫度設定為250 ℃,質(zhì)量掃描范圍是m/z70~600,采集速率每秒20個掃描,質(zhì)譜電子轟擊源燈絲開啟時間在色譜溶劑延遲170 s后,檢測器電壓1 700~1 850 V,質(zhì)譜虧損設置為0,燈絲偏置電流為70 V,儀器自動調(diào)諧。譜圖解卷積參數(shù):力可公司自帶的商業(yè)軟件Chroma TOF,基線消除(baseline offset)設置為1(0.5~1);譜圖平滑(smoothing)為5數(shù)據(jù)點(3~7),峰寬(peak width)3 s(3~4 s);信噪比S/N(signal-to-noise ratio)為10(2~15)。

    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    所有的實驗組均設置3個或3個以上生物重復,結(jié)果用平均值±標準偏差表示。所得實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差(ANOVA)分析,當P<0.05時,認為在統(tǒng)計學上具有顯著性。代謝物熱圖使用軟件MeV 4.9繪制,同時將篩選出的代謝物數(shù)據(jù)導入SIMCA-P11.5軟件包進行多元統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)先用無監(jiān)督統(tǒng)計模型主成分分析(principal components analysis, PCA),得出對照組和處理組之間代謝物的離散趨勢。使用有監(jiān)督統(tǒng)計模型的正交最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminate analysis, OPLS-DA)[15-16],將差異代謝物與斑馬魚的T-SOD活性變化建立相關性,選擇定義變量權重重要性排序(variable importance in projection, VIP)>1的變量進行研究。

    2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

    2.1 3種CNMs材料的表征

    納米材料的毒性與其自身的理化性質(zhì)(如形貌和尺寸)緊密相關。3種CNMs的形貌用TEM和AFM觀察,結(jié)果如圖1所示。如圖1(a)和圖1(d),GO的形貌為單層片狀,片徑范圍為(1.5±0.50) μm,厚度范圍(1.15±0.25) nm;CNT的形貌為長度在微米級別的細長管狀結(jié)構,管外徑約為2.58 nm,內(nèi)徑約為0.8~1.6 nm。而GOQD為成不規(guī)則的點狀形貌,其粒徑大小約為(20±5) nm,高度范圍為(7.8±1.1) nm。傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)和X射線光電子能譜(XPS)可以用來表征納米材料的表面化學官能團。根據(jù)我們之前FTIR表征的結(jié)果可知,GO、CNT和GOQD表面都具有豐富的官能團,包括—OH、—COOH和—O—。XPS的結(jié)果表明,GO主要由67.2% C 1s、30.4% O 1s和2.4% S 2p組成,CNT由62.7% C 1s、29.4% O 1s、7.2% Na 1s和0.7% Cl 2p組成,而GOQD則由78.2% C 1s、16.5% O 1s和5.3% Na 1s組成[17]。其中,Na、Cl和S等元素都是合成CNMs過程中引入的雜離子。

    圖1 3種碳納米材料的透射電子顯微鏡(TEM)和原子力電子顯微鏡(AFM)的形貌表征注:(a)、(b)和(c)分別為GO、CNT和GOQD的TEM圖片;(d)、(e)和(f)分別為GO、CNT和GOQD的AFM圖片。Fig. 1 The morphology of three carbonaceous nanomaterials characterized by emission electron microscope (TEM) and atomic force electron microscope (AFM)Note: (a), (b) and (c) are TEM images of GO, CNT and GOQD; (d), (e) and (f) are AFM images of GO, CNT and GOQD.

    2.2 3種CNMs對斑馬魚幼魚生長發(fā)育的影響

    納米材料對斑馬魚胚胎/幼魚的生長發(fā)育毒性是常規(guī)的納米毒性指標。在此,考察了3種CNMs短時間暴露(120 hpf)對斑馬魚胚胎/幼魚生長發(fā)育的影響,包括死亡率、畸形率、線粒體膜電位損傷和ROS等毒性指標。如圖2(a)所示,斑馬魚幼魚暴露于GO、CNT和GOQD組的死亡率約為3.4%~9.1%,略高于空白對照組(2.3%),但是都沒有顯著差異(P>0.05)。類似的趨勢出現(xiàn)在斑馬魚幼魚畸形率方面。如圖2(b)所示,空白對照組的畸形率約為0,而GO、CNT和GOQD組的畸形率都在5%以下,無顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明,在0.01~10mg·L-1的濃度下短期暴露(120 hpf)于這3種CNMs均不會對斑馬魚幼魚的存活和致畸方面產(chǎn)生顯著性的影響。

    氧化應激是已知的納米材料對魚類致畸機制之一[18]。斑馬魚幼魚暴露于不同濃度的GO、CNT和GOQD 120 hpf后,斑馬魚幼魚體內(nèi)總ROS含量的變化如圖3所示。熒光強度的水平與斑馬魚體內(nèi)ROS含量成正比,其結(jié)果如圖3(a)~圖3(d)所示,具體統(tǒng)計結(jié)果如圖3(e)所示。其中,GO組雖然在4個濃度上對斑馬魚幼魚體內(nèi)的ROS影響并不顯著,但其在平均值上,尤其是在濃度為1 mg·L-1和10 mg·L-1時,斑馬魚幼魚ROS含量平均值相對于對照組有上升;CNT和GOQD在0.01 mg·L-1和0.1 mg·L-1濃度下對斑馬魚幼魚的ROS影響與GO類似,即沒有產(chǎn)生顯著影響,但當CNT和GOQD的濃度為1 mg·L-1和10 mg·L-1時,斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS含量顯著升高(P<0.05)。Chen等[19]的研究表明,GO可通過升高生物體內(nèi)的ROS水平誘發(fā)斑馬魚的發(fā)育。本研究的結(jié)果表明,1 mg·L-1和10 mg·L-1的CNT和GOQD均會引起斑馬魚幼魚體內(nèi)發(fā)生顯著的氧化應激,且10 mg·L-1GOQD處理組斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS含量較對照組顯著上升,該結(jié)果與斑馬魚發(fā)育毒性實驗觀察到的畸形率上升趨勢相一致(圖2(b))。GO、CNT和GOQD低濃度(0.01 mg·L-1和0.1 mg·L-1)暴露均不會引起斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS含量的顯著上升,而1 mg·L-1和10 mg·L-1的CNT和GOQD會誘導斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS含量顯著上升,從而產(chǎn)生氧化損傷。由此可知,在引起斑馬魚幼魚ROS含量上升,造成斑馬魚幼魚氧化應激方面,3種CNMs的毒性影響排序為GOQD>CNT>GO。

    圖3 GO、CNT和GOQD暴露120 hpf后對斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧簇(ROS)的影響注:(a)、(b)、(c)和(d)分別為空白對照組、10 mg·L-1 GO暴露組、10 mg·L-1 CNT暴露組和10 mg·L-1 GOQD暴露組的ROS熒光的代表性照片;(e)為暴露120 hpf后斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS的熒光強度;黑色的*表示實驗組與空白對照組有顯著性差異P<0.05。Fig. 3 Effects of GO, CNT and GOQD on the reactive oxygen species (ROS) of zebrafish larvae after 120 hpf exposureNote: (a), (b), (c) and (d) are representative images of the ROS fluorescence in control group, 10 mg·L-1 GO exposure group, 10 mg·L-1 CNT exposure group and 10 mg·L-1 GOQD exposure group; (e) fluorescence intensity representing the ROS content in zebrafish larvae after exposure to nanoparticles until 120 hpf; the black asterisks denote significant differences at P<0.05 level compared with the control groups.

    線粒體膜電位損失是納米材料誘導產(chǎn)生氧化應激壓力的重要途徑[20]。斑馬魚幼魚暴露在GO、CNT和GOQD 120 hpf后的線粒體膜電位損失如圖4(a)~圖4(d)所示,圖中紅色熒光顯示健康線粒體膜,綠色熒光代表受損傷的線粒體膜,其紅/綠熒光的平均強度比值為衡量斑馬魚線粒體膜電位健康程度的指標。紅/綠熒光的平均強度比值越大,代表斑馬魚受到線粒體膜電位的損傷越小,反之則受到的損傷越大。從圖4(e)中可以看出,與空白對照組(紅/綠熒光比值=3.8)相比,GO、CNT和GOQD暴露組斑馬魚幼魚體內(nèi)紅/綠色熒光的比值范圍分別為2.1~3.0、2.1~2.7和1.8~2.3。值得注意的是,3種CNMs能誘導斑馬魚幼魚線粒體膜電位值下降,但是不同濃度的同種CNMs組別中斑馬魚線粒體膜電位的變化并未出現(xiàn)明顯的劑量-效應關系。與空白對照組相比,在最低濃度0.01 mg·L-1的3種CNMs暴露下,斑馬魚幼魚線粒體膜電位損傷并不顯著(P>0.05)。GO與CNT在0.1 mg·L-1和1 mg·L-1暴露時能引起了斑馬魚幼魚線粒體膜電位的顯著下降(P<0.05)。在10 mg·L-1的GO、CNT和GOQD暴露下,紅/綠色熒光的比值分別下降了18.9%(P>0.05)、27.1%(P<0.05)和52.3%(P<0.05)。以上結(jié)果表明,3種CNMs暴露均會對斑馬魚幼魚造成一定的線粒體損傷,但在不同種類和濃度CNMs的作用下這種損傷的大小是有差異的。3種CNMs對斑馬魚幼魚線粒體膜電位損傷影響排序為GOQD>CNT>GO,這結(jié)果與對ROS的影響是一致的(圖3)。

    圖4 GO、CNT和GOQD暴露120 hpf后對斑馬魚幼魚線粒體膜電位損傷的影響注:(a)、(b)、(c)和(d)分別為空白對照組、10 mg·L-1 GO暴露組、10 mg·L-1 CNT暴露組和10 mg·L-1 GOQD暴露組的線粒體膜電位損傷的代表性照片;(e)為暴露120 hpf后斑馬魚幼魚體內(nèi)線粒體膜電位損傷紅/綠熒光的比值的統(tǒng)計;黑色的*表示實驗組與空白對照組有顯著性差異P<0.05。Fig. 4 Effects of GO, CNT and GOQD on the mitochondrial membrane potential loss of zebrafish larvae after 120 hpf exposureNote: (a), (b), (c) and (d) representative images of the mitochondrial membrane potential loss in control group, 10 mg·L-1 GO exposure group, 10 mg·L-1 CNT exposure group and 10 mg·L-1 GOQD exposure group; (e) red to green fluorescence intensity ratios in zebrafish larvae after exposure to nanoparticles until 120 hpf; the black asterisks denote significant differences at P<0.05 level compared with the control groups.

    綜上所述,GO、CNT和GOQD在不同濃度短期暴露(120 hpf)下并未對斑馬魚幼魚的存活和致畸造成特別顯著的影響,但是GO、CNT和GOQD會誘導斑馬魚幼魚產(chǎn)生ROS和線粒體膜電位損傷。此外,相比GO和CNT,GOQD能誘導產(chǎn)生更多的ROS和更強的線粒體膜電位損傷。

    2.3 3種CNMs對斑馬魚成魚的亞急性毒性

    目前,關于納米材料對斑馬魚毒性的研究多集中于斑馬魚幼魚的發(fā)育毒性和高濃度(mg·L-1級)納米材料的急性毒性[19,21-22]。但環(huán)境中CNMs在自然水體和土壤等環(huán)境介質(zhì)中的檢出或預測濃度大約在ng·L-1~μg·L-1級別[23-24]。鑒于生態(tài)環(huán)境中生物的暴露模式,研究長期的、低濃度的CNMs的水生生物暴露毒性機理必不可少[13,17]。就本研究而言,在斑馬魚幼魚的毒性暴露實驗中,0.01 mg·L-1濃度相對于其他濃度對斑馬魚存活率、畸形率、線粒體損傷和ROS含量的影響最小,但是0.01 mg·L-1也會引起死亡率上升,且0.01 mg·L-1GOQD能誘導產(chǎn)生明顯的線粒體膜損傷?;谝陨弦蛩氐目紤],選取CNMs對斑馬魚成魚亞急性毒性暴露的濃度為0.01 mg·L-1,暴露時間為21 d。通過斑馬魚β-半乳糖苷酶、MDA及T-SOD等毒性指標的測定來比較探索3種CNMs對斑馬魚成魚的亞急性毒性效應。

    β-半乳糖苷酶是一種典型的細胞衰老標志物,其含量越高表明細胞衰老越快[25-26]。斑馬魚腮和腎β-半乳糖苷酶表達結(jié)果分別如圖5(a)~圖5(d)和圖5(e)~圖5(h)所示,細胞藍色的點為β-半乳糖苷酶表達。對照組與處理組的β-半乳糖苷酶表達通過Image J統(tǒng)計出表達細胞個數(shù)來衡量,其統(tǒng)計結(jié)果如圖5(i)~圖5(j)所示。結(jié)果表明,3種納米材料均會引起斑馬魚成魚的腮部和腎臟β-半乳糖苷酶表達顯著升高(P>0.05),這說明,GO、CNT和GOQD均會引起斑馬魚的腮和腎臟細胞的衰老。魚類的腮和腎是斑馬魚重要的呼吸和代謝器官,其作用涉及斑馬魚呼吸和血液代謝等,其細胞活性對于斑馬魚生理代謝有著重要作用[27-28]。因而,斑馬魚腮和腎的細胞衰老可能誘導斑馬魚產(chǎn)生潛在的健康風險。

    圖5 低濃度3種碳納米材料對斑馬魚成魚亞急性毒性影響注:(a)、(b)、(c)和(d)分別為空白對照組、0.01 mg·L-1 GO暴露組、0.01 mg·L-1 CNT暴露組和0.01 mg·L-1 GOQD暴露組中對斑馬魚腮β-半乳糖苷酶活性影響代表性圖片;(e)、(f)、(g)和(h)分別為空白對照組、0.01 mg·L-1 GO暴露組、0.01 mg·L-1 CNT暴露組和0.01 mg·L-1 GOQD暴露組中對斑馬魚腎臟β-半乳糖苷酶活性影響代表性圖片;(i)~(j)分別為3種碳納米材料對斑馬魚腮和腎臟細胞β-半乳糖苷酶陽性率的統(tǒng)計;(k)~(l)分別為3種碳納米材料對斑馬魚總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響;(b)~(d)中紅色箭頭以及(e)~(h)中黃色箭頭所指區(qū)域分別為斑馬魚腮和腎臟中部分β-半乳糖苷酶陽性點;黑色的*表示實驗組與空白對照組有顯著性差異P<0.05。Fig. 5 Subacute toxicity induced by three low concentration carbonaceous nanomaterials in adult zebrafishNote: (a), (b), (c) and (d) are typical pictures of effects on β-galactosidase (β-gal) activity of adult zebrafish gill in control group, 0.01 mg·L-1 GO exposure group, 0.01 mg·L-1 CNT exposure group and 0.01 mg·L-1 GOQD exposure group; (e), (f), (g) and (h) are typical pictures of β-gal activity of adult zebrafish kidney in control group, 0.01 mg·L-1 GO exposure group, 0.01 mg·L-1 CNT exposure group and 0.01 mg·L-1 GOQD exposure group; (i)~(j) statistical analysis of positive cell ratio of β-gal activity in adult zebrafish gill and kidney after exposure to three carbonaceous nanomaterials; (k)~(l) influence induced by three carbonaceous nanomaterials on total superoxide dismutase (T-SOD) activity and malondialdehyde (MDA) concentration of adult zebrafish; red arrows in figure (b)~(d) and yellow arrows in figure (e)~(h) represent partial dots with positive β-gal activity in adult zebrafish gill and kidney; the black asterisks denote significant differences at P<0.05 level compared with the control groups.

    由圖3和圖4結(jié)果可知,1 mg·L-1和10 mg·L-1的3種CNMs(GO、CNT和GOQD)均會對斑馬魚氧化應激和線粒體膜電位造成影響。生物組織MDA含量和T-SOD活性是衡量生物組織氧化應激的重要指標[29]。為研究低濃度長期暴露對斑馬魚抗氧化系統(tǒng)的影響,選取斑馬魚MDA含量和T-SOD活性來衡量0.01 mg·L-1的3種CNMs對斑馬魚成魚氧化應激的影響,其結(jié)果如圖5(k)和圖5(l)所示。與對照組相比,0.01 mg·L-1的GO、CNT和GOQD處理組斑馬魚成魚體內(nèi)MDA含量均無顯著差異(P>0.05)。但是0.01 mg·L-1的GO、CNT和GOQD中暴露21 d后的斑馬魚成魚體內(nèi)T-SOD活性較對照組有顯著差異(P<0.05)。具體而言,GO、CNT和GOQD處理組的T-SOD活性較空白對照組分別降低了49.7%、39.3%和47.5%。但是3種材料處理組之間T-SOD活性無顯著性差異(P>0.05)。T-SOD作為研究生物氧化應激的重要指標,其活性的降低也意味著生物氧化應激反應,這與本研究幼魚的研究結(jié)果具有一致性,而其背后機理需要我們進一步研究。

    2.4 3種CNMs對斑馬魚成魚代謝組的影響

    近年來,代謝組學以其對生物毒性的高靈敏度響應已經(jīng)成為研究生物毒性機理的有效工具,尤其在揭示納米材料誘導的生物毒性機制領域獨具優(yōu)勢[13,17]。為探索斑馬魚成魚在3種CNMs中亞急性暴露的分子機理,我們引入代謝組學對其進行分析。GC-MS測定經(jīng)過衍生化的樣品,測得代謝物中約有230個質(zhì)譜峰出現(xiàn),其中,64種代謝物被鑒定出來,將空白對照組和CNMs暴露組中這64種代謝物的相對含量歸一化后用熱圖表示,如圖6(a)所示。此外,對64種代謝物進行聚類分析和PCA分析,在PCA圖中每點代表不同種類CNMs的代謝物組,點之間的距離與樣品代謝物組成的相似程度成反比,即距離越遠,其相似程度越低。如圖6(b)所示,對照組與GO組的距離最近,而與GOQD組的距離最遠,CNT組與對照組的距離介于GO和GOQD之間,說明GOQD組斑馬魚代謝物與對照組差異最大,而GO處理組對斑馬魚代謝物的影響最小,其結(jié)果與聚類分析的結(jié)果一致。

    圖6 斑馬魚成魚空白對照組和3種碳納米材料21 d暴露組代謝分析注:(a)為差異代謝物的熱圖;(b)為PCA聚類分析圖。Fig. 6 Metabolic analysis of the control and three carbonaceous nanomaterials-exposed adult zebrafish groups at 21 dNote: (a) heat map of all the identified metabolites; (b) PCA cluster analysis.

    為了在更深層次上研究3種CNMs對斑馬魚成魚代謝物的具體影響,考察了3種CNMs對其有顯著影響的代謝物。顯著差異代謝物被定義為:當納米材料處理組某代謝物的峰面積是對照組同一代謝物峰面積的1.5倍以上或0.67倍以下時,該代謝物被稱為顯著差異代謝物(significantly changed metabolite, SCM)。本研究中3種納米材料的SCM的數(shù)量與種類如表2所示。將SCM分為了以下幾個主要類型:氨基酸、脂肪酸、糖類及糖類衍生物和其他小分子差異代謝物等。氨基酸的變化在處理組中是十分顯著的,在3種CNMs處理組中的氨基酸SCM中,CNT引起的氨基酸變化數(shù)量最多,為11種,GO與GOQD相近,分別為5種和6種。在以上不同類型的差異物中,脂肪酸是3種CNMs引起的SCM中占比最大的代謝物種類,GO、CNT和GOQD處理組中脂肪酸在總SCM的比例分別為55%、50%和56%。說明脂肪酸代謝是受3種CNMs影響最為顯著。

    圖7 代謝物的正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)分析注:代謝物相關系數(shù)(Coefficient CS)和變量權重重要性排序(VIP)值分別為自變量,T-SOD活性為因變量的OPLS-DA分析。Fig. 7 The orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) of metabolitesNote: Coefficient CS and variable importance in projection (VIP) value with the metabolic levels as the independent variable and T-SOD activity as the dependent variable using OPLS-DA.

    表2 3種納米材料暴露組中斑馬魚成魚體內(nèi)顯著差異代謝物類型統(tǒng)計Table 2 Type analysis of significantly changed metabolites (SCMs) induced by three carbonaceous nanomaterials in adult zebrafish

    為進一步確認與斑馬魚成魚氧化應激相關的代謝物的變化,利用OPLS-DA法進行斑馬魚代謝物與斑馬魚T-SOD活性相關性分析,Y變量是斑馬魚T-SOD活性,X變量是代謝物,分析結(jié)果如圖7所示。64種代謝產(chǎn)物中有21種代謝物的Coefficients CS系數(shù)為正數(shù),這表明細胞中這些代謝物對斑馬魚體內(nèi)T-SOD的生成做出了積極貢獻,而負相關代謝物有43種。此外,對代謝物進行了變量重要性投影,得到VIP>1的代謝物有24種。OPLS-DA分析表明,3種CNMs處理21 d后,28種代謝物的變化與斑馬魚T-SOD活性變化相伴發(fā)生,說明代謝物的變化可能是3種CNMs引起斑馬魚T-SOD活性變化的分子機制。其中,與T-SOD活性正相關且VIP>1的代謝物有8種,其中7種為脂肪酸,包含丁酸、二十烷酸和十四烷酸等,說明這些脂肪酸的變化與斑馬魚T-SOD活性的下降正相關;同時,與T-SOD活性負相關且VIP>1的代謝物有16種,其中包含一種氨基酸(脯氨酸)、7種脂肪酸、2種糖及糖類衍生物以及其他小分子化合物,這16種代謝物與斑馬魚T-SOD活性下降正相關。在與T-SOD活性負相關的代謝物中,脯氨酸作為精氨酸/脯氨酸代謝通路的重要一環(huán),在處理組均顯著上升。上述結(jié)果表明,代謝組學分析為了解3種CNMs對成年斑馬魚亞急性毒性效應的分子機制提供了新的思路和視角。

    由以上研究內(nèi)容可得出以下3點結(jié)論:

    (1)3種CNMs在1 mg·L-1和10 mg·L-1濃度下會引起斑馬魚幼魚線粒體損傷,損傷嚴重程度為GOQD>CNT>GO;同時,GOQD和CNT在1 mg·L-1和10 mg·L-1濃度下會引起斑馬魚幼魚氧化應激,且在10 mg·L-1時GOQD對斑馬魚幼魚的影響大于CNT。

    (2)環(huán)境相關濃度下,3種CNMs亞急性暴露會引起斑馬魚成魚腮和腎臟細胞衰老,同時抑制斑馬魚成魚T-SOD活性,但是對斑馬魚成魚MDA含量沒有顯著影響。

    (3)代謝組學分析表明,3種CNMs對斑馬魚代謝組影響的順序為GOQD>CNT>GO;T-SOD活性與代謝組學關聯(lián)分析表明,脂肪酸和脯氨酸的變化是引起斑馬魚T-SOD活性變化的分子機理之一。

    綜上所述,即使3種CNMs對斑馬魚在抗氧化酶等指標上的影響無顯著差異,但是其影響代謝的機理卻是不同的,其中,CNT主要通過誘導斑馬魚體內(nèi)氨基酸代謝物的變化(如脯氨酸、賴氨酸和亮氨酸等)造成氧化損傷,而GO和GOQD主要影響的代謝物則為脂肪酸(如十八碳烯酸、棕櫚酸和十九烷酸等)。

    通過3種典型CNMs對斑馬魚幼魚急性毒性的研究,對3種CNMs的毒性做出了排序,同時在環(huán)境相關濃度下測定了3種CNMs對斑馬魚成魚的亞急性毒性,揭示了其對斑馬魚抗氧化酶系統(tǒng)影響的分子機理,為后續(xù)CNMs的毒性評估和生態(tài)風險評價提供了重要的數(shù)據(jù)資料。

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