數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)分析神經(jīng)纖毛蛋白1在腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義

張 哲，武衛(wèi)周，陳 健，葉益超，鐘士江

腦膠質(zhì)瘤是最常見的惡性原發(fā)性實性腦腫瘤，其中51%為膠質(zhì)母細胞瘤，其浸潤性極強、惡性程度最高且具有易復發(fā)的特點，嚴重威脅人類的生命健康。2016年WHO結(jié)合分子生物標志物與傳統(tǒng)組織學標準重新對腦膠質(zhì)瘤進行了分類[1]。揭示了未來分子水平診療的重要趨勢，從分子水平研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展有助于開發(fā)更加有效且特異性更強的診療手段，對減少患者痛苦以及延長生命尤為重要。

神經(jīng)纖毛蛋白1(neuropilin 1, NRP1)是由NRP1基因編碼的一種大小為120～140 kDa的Ⅰ型跨膜蛋白。NRP1能夠結(jié)合許多配體和各種類型的共同受體，如3類腦信號蛋白和血管內(nèi)皮生長因子，廣泛參與人體的生理和病理過程?，F(xiàn)在已證實NRP1在免疫、心血管疾病發(fā)展、神經(jīng)元引導、血管生成、細胞存活以及遷移等方面發(fā)揮重要作用。近年來，有學者觀察到NRP1在腫瘤血管系統(tǒng)中廣泛表達，同時NRP1的過度表達與腫瘤進展相關，且臨床結(jié)果不佳[2]。許多研究表明，NRP1在肝癌、乳腺癌、胃癌中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[3-5]。然而，目前NRP1與腦膠質(zhì)瘤的關系研究較少，并且由于研究方法、樣本量及人群差異的原因，其結(jié)論可靠性也較低。本文基于BioGPS數(shù)據(jù)庫、Oncomine數(shù)據(jù)庫、癌癥細胞系百科全書(cancer cell line encyclopedia, CCLE)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘分析NRP1基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義，為研究NRP1能否成為診療腦膠質(zhì)瘤的潛在靶點提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1BioGPS數(shù)據(jù)庫分析NRP1在人體正常組織中的表達 利用BioGPS數(shù)據(jù)庫(http：//biogps.org)分析NRP1基因(210615_at)在人體正常組織中的表達情況。

1.2Oncomine數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù) Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)是一個基于基因芯片的數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，在此數(shù)據(jù)庫中可根據(jù)自己的需要設定篩選條件。本文設定的篩選條件為：①Gene：NRP1；②Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③Cancer Type：Brain and CNS Cancer；④Pathology Subtype：Grade Type。

1.3CCLE數(shù)據(jù)庫分析NRP1在腫瘤細胞系中的表達 CCLE數(shù)據(jù)庫(https://portals.broadinstitute.org/ccle)是諾華公司推出的線上癌癥細胞系百科全書，其對世界上藥物研究和開發(fā)中使用的近1000種人類癌細胞系的遺傳和分子譜進行了分類。設定搜索條件為：NRP1。

1.4統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 7及IBM SPSS Statistics 25統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織間NRP1表達差異比較采用t檢驗。正常腦組織與不同級別腦膠質(zhì)瘤間NRP1表達差異比較采用獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1NRP1在人體正常組織中的表達 BioGPS數(shù)據(jù)庫分析表明，NRP1在人體各個正常組織中均有表達，其中在平滑肌組織、心臟、肝臟、甲狀腺、視網(wǎng)膜、神經(jīng)節(jié)及免疫細胞中表達量較高。見圖1。

2.2NRP1在不同類型腫瘤組織中的表達結(jié)果 Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集了417個不同類型的研究結(jié)果，其中關于NRP1表達有統(tǒng)計學差異的研究結(jié)果有30個，NRP1表達增高的研究有15個，NRP1表達降低的研究有15個。見圖2。

2.3NRP1在腦膠質(zhì)瘤中的表達結(jié)果 Oncomine數(shù)據(jù)庫中自2006年至今有4項研究涉及NRP1在膠質(zhì)母細胞瘤組織與正常腦組織中的表達，共包含922個樣本。見圖3。相關文獻分別發(fā)表在Cancer Cell和J Clin Oncol期刊。這4項研究中3項研究表示NRP1在膠質(zhì)母細胞組織與正常腦組織間表達有差異，分別是Sun Brain[6](t=12.078，P=4.49×10-21，F(xiàn)old Change=8.643)、TCGA Brain(t=16.370，P=7.03×10-15，F(xiàn)old Change=2.205)、Murat Brain[7](t=7.572，P=1.14×10-6，F(xiàn)old Change=1.643)，另外一項研究差異無統(tǒng)計學意義，Lee Brain[8](t=1.348，P=0.096，F(xiàn)old Change=1.308)。對這4項研究進行meta分析表明，與正常腦組織相比，NRP1在膠質(zhì)母細胞瘤中高表達(P=5.70×10-7)。

圖1 BioGPS數(shù)據(jù)庫顯示NRP1在人體正常組織中的表達

NRP1為神經(jīng)纖毛蛋白1

2.4NRP1在不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中差異表達 對Oncomine數(shù)據(jù)庫中Sun Brain研究(samples=180)的數(shù)據(jù)挖掘顯示，4級腦膠質(zhì)瘤與正常腦組織、2級腦膠質(zhì)瘤和3級腦膠質(zhì)瘤比較NRP1均呈高表達，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而正常腦組織、2級膠質(zhì)瘤和3級膠質(zhì)瘤組間NRP1表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

2.5CCLE數(shù)據(jù)庫分析NRP1在不同類型腫瘤細胞系中的表達 在CCLE數(shù)據(jù)庫中有40種不同類型的腫瘤細胞譜系對NRP1 mRNA進行了測序，其中表達量排在前十的有軟骨肉瘤、腦膠質(zhì)瘤、骨巨細胞瘤、腦膜瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、間皮瘤、肝癌。見圖5。人腦膠質(zhì)瘤位列第2，其中位表達量為4.562303。

圖2 NRP1在Oncomine數(shù)據(jù)庫不同腫瘤研究中的表達

NRP1為神經(jīng)纖毛蛋白1；P<0.0001，fold change=2，gene rank=top 10%

3 討論

膠質(zhì)瘤占所有惡性原發(fā)性腦腫瘤的80%，其中最常見也是惡性程度最高的為膠質(zhì)母細胞瘤[9-10]。我國腦膠質(zhì)瘤每年的發(fā)病率約為8.8/10萬，排在所有惡性腫瘤的第9位。根據(jù)目前的WHO分類，膠質(zhì)瘤分為4個組織學分級。1級膠質(zhì)瘤(毛細胞星形膠質(zhì)瘤)生長緩慢，若完全切除可以治愈。2級膠質(zhì)瘤(星形細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤和少突細胞瘤)和更具侵襲性的3級膠質(zhì)瘤(間變性星形細胞瘤)具有中間臨床過程，而4級膠質(zhì)瘤(膠質(zhì)母細胞瘤)具有最迅猛的臨床進展，即使是經(jīng)過最積極的治療，患者的中位生存期僅有14.5～16.6個月[11]。這種疾病嚴重威脅人們的生命安全及生活質(zhì)量，越來越多的研究試圖通過闡明膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，探究新的診斷和治療方式。

NRP1是一種多功能單通道跨膜蛋白，基因位于10p11.22，包含923個氨基酸，具有一個小的胞質(zhì)結(jié)合域、一個短的跨膜結(jié)合域和一個細胞外結(jié)合域。該胞外結(jié)合域由N-末端細胞補體結(jié)合域(a1/a2)、凝血因子Ⅴ/Ⅷ(b1/b2)結(jié)構(gòu)域和穿膜肽酶結(jié)構(gòu)域(c)組成。來自跨膜結(jié)構(gòu)域的b2結(jié)構(gòu)域介導與其他受體的相互作用[12]。NRP1最初被認為是神經(jīng)系統(tǒng)中的一種黏附分子，但目前的研究主要將其作為3類腦信號蛋白受體軸突模式的配體和血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶VEGFR2的內(nèi)皮細胞共受體[13]。NRP1在動物體內(nèi)的神經(jīng)元、血管、免疫細胞和其他類型細胞中表達，并結(jié)合一系列結(jié)構(gòu)和功能外配體以調(diào)節(jié)器官的發(fā)育和功能[14]。一系列小鼠模型研究表明，NRP1是心臟、腎臟、后肢和眼睛發(fā)育中血管內(nèi)皮生長因子依賴性動脈形態(tài)生長的關鍵性調(diào)節(jié)因子，同時可以促進人體動脈發(fā)生[15-16]。最近的研究報道顯示，平滑肌細胞中NRP1的表達在主動脈或視網(wǎng)膜動脈的發(fā)育成熟中不起主要作用；相反，NRP1保留了胃腸道平滑肌的收縮性和運動性[17]。近年來，關于NRP1在腫瘤上的研究越來越多，其過表達與腫瘤侵襲性、病理分期和預后不良有關[18]。這可能與NRP1參與了腫瘤血管生成，增加腫瘤微血管密度、腫瘤細胞的侵襲作用相關[19-20]。

圖3 NRP1在Oncomine數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)母細胞瘤中的表達

NRP1為神經(jīng)纖毛蛋白1

圖4 Oncomine數(shù)據(jù)庫中NRP1在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達

NRP1為神經(jīng)纖毛蛋白1；與4級腦膠質(zhì)瘤比較，aP<0.05

在龐大的生物醫(yī)學知識網(wǎng)絡中，基因處于中心位置，BioGPS數(shù)據(jù)庫是一個集中的線上基因注釋數(shù)據(jù)庫?；贐ioGPS數(shù)據(jù)庫挖掘的結(jié)果，NRP1在人體正常組織中廣泛表達，尤其是在平滑肌組織、心臟、肝臟、甲狀腺、視網(wǎng)膜、神經(jīng)節(jié)及免疫細胞中表達量較高。側(cè)面反映出NRP1在血管生成、軸突引導、細胞存活、遷移和侵襲等方面發(fā)揮著多方面的作用。王睿君等[21]研究表明，NRP1的表達與腦膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關。Osada等[22]研究發(fā)現(xiàn)，NRP1在腦膠質(zhì)瘤中過表達，且其過表達與腦膠質(zhì)瘤的預后不良相關。Hu等[23]研究則發(fā)現(xiàn)，NRP1通過增強HGF/SF自分泌c-Met信號傳導途徑的活性來促進血管生成以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤進展。然而，這些研究樣本量較小、研究方法也不統(tǒng)一，可信度較低。Oncomine數(shù)據(jù)庫是一項生物信息學計劃，旨在收集、標準化、分析和為生物醫(yī)學研究提供癌癥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。目前，該數(shù)據(jù)庫已經(jīng)確定了18 000種癌癥基因表達譜中的基因、途徑和網(wǎng)絡。通過對數(shù)據(jù)庫的分析，可以查詢到某種基因的表達差異、共表達分析、富集分析、meta分析等。還能結(jié)合臨床資料進行二次數(shù)據(jù)分析，因其整合了大量數(shù)據(jù)、研究方法一致，分析結(jié)果具有較高的可信度。本研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，NRP1在腦膠質(zhì)瘤中高表達，尤其是在膠質(zhì)母細胞瘤中表達量較高。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，高度惡性的腦膠質(zhì)瘤(4級)較低度惡性的腦膠質(zhì)瘤(2～3級)NRP1的表達量更高，但在區(qū)別低度惡性膠質(zhì)瘤(2～3級)上無明顯差異。這表明NRP1可能是鑒別腦膠質(zhì)瘤高惡性程度的一個潛在靶點。

圖5 CCLE數(shù)據(jù)庫中NRP1在不同類型腫瘤細胞系中的表達

CCLE為癌癥細胞系百科全書，NRP1為神經(jīng)纖毛蛋白1

研究腫瘤相關基因功能的實驗通常需要先篩選目的基因的高低表達，再對目的基因進行過表達或敲降，從而通過表型實驗來觀察功能。CCLE數(shù)據(jù)庫為1100多種細胞系提供基因組數(shù)據(jù)、分析和可視化的公共訪問?？梢詫⒒虮磉_數(shù)據(jù)可視化為箱形圖或與散點圖中的其他表達值進行比較。每個基因都有多個數(shù)據(jù)集和數(shù)據(jù)標識符。其中5種主要數(shù)據(jù)集類型是拷貝數(shù)，mRNA表達(Affy)，RPPA，RRBS和mRNA表達(RNAseq)。本研究利用CCLE數(shù)據(jù)庫對NRP1在腫瘤細胞系中的mRNA表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)在40種不同腫瘤類型的1457種細胞譜系中腦膠質(zhì)瘤的表達量排在第2位。為日后研究腦膠質(zhì)瘤的細胞及動物模型實驗奠定了理論基礎。

綜上所述，本文通過對BioGPS數(shù)據(jù)庫、Oncomine數(shù)據(jù)庫和CCLE數(shù)據(jù)庫中腫瘤相關基因信息進行深入挖掘發(fā)現(xiàn)NRP1在腦膠質(zhì)瘤中高表達，且與膠質(zhì)瘤的分級程度有關。這為深入研究NRP1在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定理論基礎，同時為開發(fā)腦膠質(zhì)瘤新型的臨床診療手段提供了重要的線索和研究思路。