低鹽青方腐乳關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)及部分功能性研究

馬艷莉，梁靜靜，李素萍，丁玉峰，席曉麗，王頡，郭書(shū)賢

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000；2.南陽(yáng)理工學(xué)院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽(yáng)473004）

腐乳作為傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，在中國(guó)已有一千多年的食用歷史，它營(yíng)養(yǎng)豐富、滋味鮮美，被人民群眾廣泛喜愛(ài)。但是，腐乳是含鹽量較高的食品，流行病學(xué)證據(jù)表明，高血壓等疾病的發(fā)病率與食鹽攝入量呈顯著負(fù)相關(guān)性，因此，目前食品工業(yè)向低鹽化方向發(fā)展，腐乳的高鹽含量嚴(yán)重限制產(chǎn)品消費(fèi)，影響其功能性發(fā)揮，妨礙其向國(guó)際化市場(chǎng)推進(jìn)。相關(guān)研究表明，當(dāng)腐乳的食鹽含量從10%下降到6%后，其抗氧化性、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性會(huì)增強(qiáng)，并且活性的保持能力也更強(qiáng)[1]。因此，降低腐乳食鹽含量勢(shì)在必行，也是目前腐乳行業(yè)迫切需要解決的問(wèn)題。

腐乳生產(chǎn)中使用較多食鹽主要目的是抑制有害菌生長(zhǎng)、控制酶活，而乳酸菌和丁酸梭菌有抑制有害菌生長(zhǎng)的作用，因此可以考慮部分代替食鹽應(yīng)用于腐乳生產(chǎn)。益生菌應(yīng)用于腐乳生產(chǎn)，改善其生產(chǎn)工藝有少量報(bào)道。后酵期間各種微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)也會(huì)對(duì)腐乳品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。劉會(huì)勇等[2]通過(guò)調(diào)整發(fā)酵溫度、添加酶類(lèi)物質(zhì)、酵母菌等來(lái)縮短腐乳生產(chǎn)周期，腐乳在發(fā)酵60 d時(shí)，香氣濃郁，口感細(xì)膩，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求?，F(xiàn)代研究表明，發(fā)酵豆制品富含的多種生物活性物質(zhì)獨(dú)自或協(xié)同作用，形成了發(fā)酵豆制品獨(dú)特的生理功能，如抗氧化、降血壓、抑制乙酰膽堿酯酶、降血糖、抗菌等[3]。腐乳中含有多種抗氧化成分，如大豆異黃酮、酚酸類(lèi)化合物、多肽等[4]，賦予腐乳產(chǎn)品良好的抗氧化活性。

本文在前期研究基礎(chǔ)上，使用乳酸菌豆坯代替?zhèn)鹘y(tǒng)鹵水豆坯接種雅致放射毛霉進(jìn)行前期發(fā)酵，不經(jīng)過(guò)鹽腌過(guò)程，并在后發(fā)酵湯料中添加乳酸菌LB01和丁酸梭菌BP01，直接進(jìn)入后發(fā)酵過(guò)程，嘗試制作低鹽腐乳，并研究其品質(zhì)特征和部分功能性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）標(biāo)準(zhǔn)品、乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase，AchE）（220 U/mg）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）（2 U/mg～6 U/mg）、鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA）、5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸 [5，5-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、甲醇、鄰苯二甲酸二乙酯、甲硫醇、丁酸乙酯、乙酸乙酯、正丁醇、丙酸丁酯、丁酸、丙酸等：西格瑪奧德里奇公司；高純氦氣（純度≥99.999%）：北京千禧京城氣體有限公司；β-巰基乙醇：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent7890A-5975C）：美國(guó)安捷倫公司；96孔酶標(biāo)板（MS-8496F）：Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.；酶標(biāo)儀（Model 680）：日本伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)公司；中草藥粉碎機(jī)（FW135）：天津市泰斯特儀器有限公司；高效液相色譜儀（LC-10A）：日本島津公司；真空冷凍干燥機(jī)（EYELA FDU-540）：Tokyo Rikakikai Co.，Ltd.；紫外-分光光度計(jì)（UV mini 1240）：Shimadzu Co.；臺(tái)式離心機(jī)（TDL-40B）：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品制備方法同前期研究中的樣品制備方法[5]。

1.3.1.1 腐乳對(duì)照樣品的制備

通過(guò)噴灑雅致放射毛霉孢子懸浮液于鹵水豆坯上制得毛坯，然后腌制5 d（食鹽含量達(dá)11%～14%），將腌制好的12塊鹽坯放入玻璃瓶中，加入140 mL后酵湯料，在28℃左右后酵45 d，即可制得腐乳對(duì)照樣品。

1.3.1.2 低鹽樣品1的制備

通過(guò)噴灑雅致放射毛霉孢子懸浮液于乳酸菌豆坯上制得毛坯，然后不經(jīng)腌制將毛坯直接放入玻璃瓶中，加入140 mL后酵湯料，在28℃左右后酵45 d，即可制得低鹽樣品1。

1.3.1.3 低鹽樣品2的制備

通過(guò)噴灑雅致放射毛霉孢子懸浮液于乳酸菌豆坯上制得毛坯，然后不經(jīng)腌制將毛坯直接放入玻璃瓶中，加入140 mL后酵湯料，加入濃度為1×106CFU/mL的乳酸菌和丁酸梭菌菌懸液各5 mL，在28℃左右后酵45 d，即可制得低鹽樣品2。

1.3.2 關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)頂空法萃取樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，氣質(zhì)聯(lián)用法 （gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）對(duì)萃取的成分進(jìn)行鑒定，再通過(guò)動(dòng)態(tài)頂空稀釋法（dynamic headspace dilution analysis，DHDA）結(jié)合嗅聞檢測(cè)技術(shù)對(duì)關(guān)鍵揮發(fā)性成分進(jìn)行分析確定，參考馬艷莉等[6]方法。

1.3.3 γ-氨基丁酸（GABA）含量測(cè)定方法

使用高效液相色譜法 （high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定樣品中GABA含量，參考Pyo等[7]的方法，略有改動(dòng)。

1.3.3.1 樣品提取液制備

稱(chēng)取0.50 g凍干粉樣品于離心管中，加入5.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸，渦旋振蕩1 min，然后在40℃水浴中振蕩提取2 h，10 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，得到樣品提取液備用。

1.3.3.2 樣品柱前衍生

將鄰苯二甲醛（OPA）10 mg，β-巰基乙醇 20 μL 溶于2.5 mL乙腈中，得到OPA衍生試劑。吸取0.4 mol/L硼酸緩沖液（pH 10.4）400 μL，OPA 衍生試劑 80 μL，樣品提取液80 μL，混合均勻后室溫（25℃左右）反應(yīng)5 min，衍生后取20 μL進(jìn)HPLC檢測(cè)。

1.3.3.3 HPLC檢測(cè)條件

C18 色譜柱：4.6 mm×150 mm×5 μm；流動(dòng)相：20%乙腈的醋酸鈉緩沖液；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40℃。

1.3.4 丁酸含量測(cè)定方法

使用HPLC法測(cè)定樣品中丁酸含量，參考Zhang等[8]的方法，略有改動(dòng)。

1.3.4.1 樣品提取液制備

稱(chēng)取樣品凍干粉0.50 g于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水，超聲振蕩30 min，8 000 r/min離心20 min，取上清液，過(guò)0.45 μm濾膜制得樣品提取液。

1.3.4.2 HPLC檢測(cè)條件

色譜柱：Shimadzu SCR-101（H）7.9 mm×300 mm；流動(dòng)相：5 mmol/L的硫酸水溶液；柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.3.5 乙酰膽堿酯酶（AchE）抑制活性測(cè)定方法

采用Ellman光度檢測(cè)法測(cè)定樣品AchE抑制活性，參照Ellman等[9]的方法，略有修改。

1.3.5.1 樣品提取液制備

稱(chēng)取樣品凍干粉0.50 g，加入5 mL 80%乙醇溶液，16 000 r/min均質(zhì)1 min，超聲提取20 min，常溫（25℃左右）振蕩提取1 h，沸水浴15 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，得到樣品提取液備用。

1.3.5.2 AchE抑制活性測(cè)定方法

在96孔酶標(biāo)板中加入150 μL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.04），30 μL 不同稀釋濃度的樣品提取液，陰性和陽(yáng)性對(duì)照中以30 μL磷酸鹽緩沖液代替，然后加入 50 μL DTNB （756 μmol/L），20 μL 稀釋后的AchE酶液（0.54 U/mL），陰性對(duì)照不加酶液，以磷酸鹽緩沖液代替，微孔板振蕩器上混合均勻后，置于37℃培養(yǎng)箱中保溫5 min，取出后在所有微孔中加入50 μL底物（3 mmol/L），振蕩混合均勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品動(dòng)力學(xué)速率。酶標(biāo)儀設(shè)為動(dòng)力學(xué)測(cè)定模式，檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm，連續(xù)讀數(shù)10次，每次測(cè)定間隔28 s，振蕩3 s，抑制率的計(jì)算公式為：

抑制率/%=（K陽(yáng)性對(duì)照-K樣品）/（K陽(yáng)性對(duì)照-K陰性對(duì)照）×100

1.3.6 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制活性測(cè)定方法

ACE抑制活性測(cè)定參考Li等[10]的方法，略有改進(jìn)。

1.3.6.1 樣品提取液制備

稱(chēng)取0.50 g樣品凍干粉于離心管中，加入5.0 mL蒸餾水，振蕩混勻。15 000 r/min均質(zhì)2 min，超聲提取5 min，再于室溫（25℃左右）下?lián)u床振蕩提取1 h。將上述樣液沸水浴15 min，5 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜，得到樣品提取液備用，其濃度標(biāo)記為100 mg/mL。

1.3.6.2 ACE抑制活性測(cè)定方法

將樣品提取液適當(dāng)稀釋?zhuān)?6孔酶標(biāo)板上將20 μL樣液（無(wú)抑制的反應(yīng)液中以蒸餾水代替）與40 μL 4.66 mmol/L的底物溶液混合，然后加入40 μL 12.5 mU/mL的酶液（對(duì)照液中以蒸餾水代替），在微孔板混合器上混勻后置于37℃恒溫箱中反應(yīng)1 h，然后加入150 μL 1.2 mol/L NaOH溶液終止酶反應(yīng)。接著在反應(yīng)液中加入40 μL 2%的OPA溶液，混合均勻，室溫（25℃左右）下靜置20 min后加入40 μL 6 mol/L的HCl溶液終止衍生反應(yīng)。將上述溶液適當(dāng)稀釋后，在30 min～90 min內(nèi)測(cè)定熒光吸收強(qiáng)度，條件如下：激發(fā)波長(zhǎng)340 nm；發(fā)射波長(zhǎng)455 nm；狹縫寬度5 nm。樣液的ACE抑制活性計(jì)算公式如下：

式中：a為抑制劑與ACE都存在時(shí)對(duì)熒光的吸收強(qiáng)度；b為抑制劑不存在，而ACE存在時(shí)對(duì)熒光的吸收強(qiáng)度；c為抑制劑存在而ACE不存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度；d為抑制劑與ACE都不存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度。

ACE抑制率越大，說(shuō)明抑制劑在該濃度條件下抑制ACE活性的能力越強(qiáng)。以抑制劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，計(jì)算抑制率達(dá)到50%時(shí)抑制劑的濃度，即為半抑制濃度，記為IC50。IC50值越小，代表抑制劑對(duì)ACE活性抑制能力越強(qiáng)。

1.3.7 多肽含量測(cè)定方法

樣品多肽含量測(cè)定參照Church等[11]的方法。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鹽腐乳關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量研究

使用GC-MS法對(duì)低鹽腐乳風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照前期研究基礎(chǔ)[12]鑒定的青方腐乳關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)在低鹽腐乳中被檢測(cè)到，所以進(jìn)一步使用內(nèi)標(biāo)物2-甲基3-庚酮對(duì)低鹽腐乳關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量，其相對(duì)含量如表1所示。

表1 低鹽腐乳關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量Table 1 Relative content of key flavor compounds in low-salt sufu μg/g

與對(duì)照樣品相比，低鹽樣品中部分關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量降低，特別是低鹽樣品1降低更明顯，可能導(dǎo)致低鹽樣品1特征性風(fēng)味有所改變。低鹽樣品2中一些風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量也有所降低，特別是吲哚相對(duì)含量降低明顯，與對(duì)照和低鹽樣品1有顯著性差異。吲哚是一種亞胺類(lèi)物質(zhì)，高濃度時(shí)有強(qiáng)烈的臭味，并對(duì)人體產(chǎn)生一定危害，某些有害菌，如大腸埃希菌、變形桿菌、霍亂弧菌等能分解色氨酸生成吲哚。低鹽樣品2中吲哚相對(duì)含量降低可能與其后發(fā)酵湯料中添加益生菌有關(guān)，乳酸桿菌和丁酸梭菌可能會(huì)抑制致病菌及腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而抑制這些有害菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，進(jìn)而降低了吲哚等胺類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量。

2.2 低鹽腐乳GABA含量和丁酸含量研究

對(duì)低鹽樣品GABA含量研究結(jié)果如圖1所示。

圖1 低鹽腐乳GABA含量Fig.1 GABA content of low-salt sufu

低鹽樣品GABA含量分別達(dá)188.92 mg/100 g干重和223.95 mg/100 g干重，為對(duì)照樣品的1.33倍和1.57倍，由此可見(jiàn)，低鹽發(fā)酵提高了樣品的GABA含量，推測(cè)原因有以下幾方面：首先，低鹽腐乳樣品使用乳酸菌發(fā)酵豆坯制作，乳酸菌發(fā)酵提高食品GABA含量已有大量報(bào)道[13-14]。因此，由于乳酸菌的作用，低鹽腐乳豆坯中GABA含量可能已高于對(duì)照中的鹵水豆坯。其次，本研究中低鹽腐乳生產(chǎn)不經(jīng)歷鹽腌過(guò)程，有利于GABA的合成，并且在一定程度上會(huì)減少GABA隨坯體中水分流失而減少。在兩種低鹽樣品中，后發(fā)酵添加乳酸菌和丁酸梭菌的低鹽樣品2中GABA含量明顯高于未添加的樣品1，進(jìn)一步說(shuō)明了乳酸菌對(duì)GABA合成具有促進(jìn)作用。對(duì)低鹽腐乳丁酸含量測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

圖2 低鹽腐乳丁酸含量Fig.2 Butyrate content of low-salt sufu

低鹽樣品1丁酸含量與對(duì)照沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），而低鹽樣品2丁酸含量大約比對(duì)照增加了39.46%，表明腐乳后酵湯料中添加丁酸梭菌可以提高丁酸含量。

2.3 低鹽腐乳乙酰膽堿酯酶抑制活性研究

阿爾茲海默癥患者大腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)-乙酰膽堿的缺失是引起該疾病的關(guān)鍵因素，乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）可以催化乙酰膽堿發(fā)生裂解反應(yīng)，引起乙酰膽堿缺失，因此，抑制AchE活性可以預(yù)防阿爾茲海默癥的發(fā)生[15]。發(fā)酵豆制品作為發(fā)酵食品的重要組成部分，其AchE抑制活性也被關(guān)注，Liu等[16]調(diào)查了19種市售豆豉樣品，發(fā)現(xiàn)其不同程度地存在AchE抑制活性。前期試驗(yàn)證實(shí)青方腐乳具有乙酰膽堿酯酶（AchE）抑制活性，且其活性高于所測(cè)定的其他類(lèi)型腐乳，本研究對(duì)益生菌發(fā)酵生產(chǎn)的低鹽腐乳AchE抑制活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，益生菌發(fā)酵低鹽樣品具有AchE抑制活性，但是與對(duì)照無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 低鹽腐乳乙酰膽堿酯酶抑制活性Fig.3 Acetylcholinesterase inhibitory activity of low-salt sufu

2.4 低鹽腐乳血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性和多肽含量

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）可以催化無(wú)活性的血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為刺激血管收縮、引起血壓升高的血管緊張素Ⅱ。ACE抑制劑可以抑制ACE活性，從而減少血管緊張素Ⅱ的形成，達(dá)到防治高血壓的目的[17]。研究表明，腐乳具有ACE抑制活性[18]，目前，腐乳ACE抑制活性被認(rèn)為由多肽引起，這些ACE抑制肽能抑制ACE活性，防止血管平滑肌收縮，起到降壓作用，并且不會(huì)引起正常血壓降低。對(duì)低鹽腐乳血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制活性和多肽含量進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4所示。

低鹽腐乳ACE抑制活性和多肽含量均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），其中低鹽樣品2具有最高ACE抑制活性，后發(fā)酵45 d時(shí)，其ACE抑制活性達(dá)84.66%，同時(shí)，其多肽含量也高于對(duì)照和低鹽樣品1。在前期對(duì)使用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的青方腐乳發(fā)酵過(guò)程中ACE抑制活性和多肽含量進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，降低食鹽含量并控制發(fā)酵時(shí)間有助于ACE抑制活性和多肽含量增加，本研究中生產(chǎn)的低鹽腐乳降低了食鹽含量并把發(fā)酵時(shí)間控制在45 d。所以，其ACE抑制活性和多肽含量增加可能與該生產(chǎn)工藝改進(jìn)相關(guān)。此外，本研究中低鹽腐乳2生產(chǎn)過(guò)程去除鹽腌過(guò)程，且后發(fā)酵添加益生菌，這些工藝的改進(jìn)均有可能促進(jìn)ACE抑制活性的提高。

圖4 低鹽腐乳血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性和多肽含量Fig.4 Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity and peptide content of low-salt sufu

3 結(jié)論

后發(fā)酵湯料中添加益生菌會(huì)抑制致病菌及腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，一定程度上提高青方腐乳的食用安全性和功能性。后酵湯料添加益生菌發(fā)酵可降低吲哚相對(duì)含量等胺類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量，明顯提高低鹽腐乳樣品中GABA和丁酸含量，低鹽樣品GABA含量為對(duì)照樣品的1.33倍和1.57倍，丁酸含量大約比對(duì)照增加了39.46%，益生菌發(fā)酵低鹽腐乳具有乙酰膽堿酯酶抑制活性，但是與對(duì)照無(wú)顯著差異（P＜0.05），其血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性和多肽含量與對(duì)照相比有顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明益生菌低鹽發(fā)酵對(duì)不同功能性的影響存在差異。